MONOGRAFIA - Van-Lume et al. 2016

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE BIOCIÊNCIAS BRENA VAN-LUME DO NASCIMENTO

Diversificação heterocromática e cito-molecular em Caesalpinia sensu lato (Leguminosae)

RECIFE 2016

BRENA VAN-LUME DO NASCIMENTO

Diversificação heterocromática e cito-molecular em Caesalpinia sensu lato (Leguminosae)

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenação do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ciências Ambientais, da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos à obtenção do Grau de bacharel em Ciências Biológicas. Orientador: Prof.__________________________

RECIFE 2016

BRENA VAN-LUME DO NASCIMENTO

Diversificação heterocromática e cito-molecular em Caesalpinia sensu lato (Leguminosae)

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenação do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas com ênfase em Ciências Ambientais, da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos à obtenção do Grau de bacharel em Ciências Biológicas. Data de Aprovação: ____/____/________ Nota: __________ BANCA EXAMINADORA: ______________________________________________ Prof. Dr. LUIZ GUSTAVO RODRIGUES SOUZA (Orientador) Departamento de Botânica – UFPE

_______________________________________________ Prof. Dra. ANDREA PEDROSA-HARAND (1º Titular) Departamento de Botânica – UFPE

_______________________________________________ Dr. MARCELO DOS SANTOS GUERRA FILHO (2º Titular) Departamento de Botânica – UFPE

AGRADECIMENTOS Primeiramente, Agradeço à Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade. Mãe, obrigada por tudo, esse trabalho é pra você e para Tia Rossana. Bruna e Iguinho nada seria possível sem vocês. Obrigada minha família! Agradeço ao meu orientador, Gustavo Souza, principalmente pela paciência, transferência de conhecimento, apoio e pela positividade. Ao Laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal, pelos ensinamentos e pela união da nossa equipe. Andrea e Marcelo em especial. Um muito obrigada especial pra Ribeiro, Mariela (Emíliooo), Esposito[monstro], André, Álex, Mariana (Iara), Sandrinha, Marcus e Artur (ainda é do lab sim!). A todos os agregados também (Bruno, Géssica, Elivania). As “Divas do Lab” que sempre encontram uma maneira de dar apoio e boas risadas. Karol (meu bem-casado), Lívia, Duda (obrigada por revisar minha monografia!!!) Jéssica pelas conversas, Dani e a sua risada(sim) contagiante, Thallitha com dois l e dois h. Muito obrigada por estarem sempre presentes. Aos meus amigos feitos na graduação, Paulito (Paulo Braga), Uél (Wellyson), Gleicynha (Tia Vera et al) e Camila por todo o apoio e momentos que jamais serão esquecidos. Estamos juntos ao infinito e Camela(além). Haggy(GG), Júlio(eGlecias), Jhon, Amanda Melo(melbem) e tantos outros amigos (Sintam-se citados) que estão sempre por perto. Aproveito para agradecer a turma 2012.1, minha turma de Ciências Ambientais e todos os seus integrantes (Henrique, Luan, Brunna, Joãozinho...) por formarmos a turma mais linda e unida desse Centro. Meus agradecimentos ao CB pela comunidade amável que somos e pelos Docentes excepcionais aqui presentes, em especial para minha querida professora Roxana Barreto pelo carinho. Agradeço também a Ivandete pelo exemplo de funcionária e aos „tios‟ e „tias‟ que trabalham e cuidam do nosso centro. Um sincero e especial agradecimento a Luciano Lira (Love) por chegar aos 45min do segundo tempo da minha graduação e fazer tudo parecer mais lindo e suave. Por fim agradeço a todos que tornaram esse trabalho possível.

Resumo Caesalpinia sensu lato é um grupo Pantropical com cerca de 150 espécies e alta diversidade nos neotrópicos, dividido em três centros principais: Andino (Argentina, Bolívia, Chile e Peru), Nordeste do Brasil e Mesoamérica (Caribe, Sul dos Estados Unidos e México). O grupo tem uma história taxonômica longa e complexa, e recentes análises filogenéticas sugerem que é claramente polifilético, mas a delimitação do gênero permanece incerta devido à falta de resolução filogenética. Este estudo tem como objetivo avaliar a distribuição dos sítios 5S e 45S DNAr e a evolução das bandas heterocromáticas CMA/DAPI em Caesalpinia s.l., visando esclarecer as relações filogenéticas. Adicionalmennte foi construída uma filogenia molecular baseada em sequências plastidiais matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6 e nuclear ITS e a homologia genômica entre as espécies do Nordeste do Brasil foi investigada por GISH comparativa (cGISH). Um total de 18 espécies de oito grupos segregados de Caesalpinia s.l. foram analisadas, incluindo Arquita (2 sp.), Balsamocarpon (1 sp.), Caesalpinia sensu stricto (2 sp.), Echinata (1 sp.), Erythrostemon (6 sp.), Guilandina (1 sp.), Libidibia (1 sp.) e Poincianella (4 sp). Enquanto todas as espécies tinham o mesmo número de cromossomos (2n = 24; 16M/SM + 8A/SM) nós observamos padrões variáveis de distribuição da heterocromatina. Para os cromossomos acrocêntricos, bandas CMA+/ DAPI− foram observadas no braço curto em todas as espécies. Em contraste, três padrões diferentes foram encontrados nos cromossomos metacêntricos: bandas proximais CMA+/DAPI− (Balsamocarpon, Echinata, Guilandina, Libidibia e Poincianella), bandas proximais CMA0/DAPI− (Arquita e Erythrostemon) e bandas terminais CMA+/DAPI− (Caesalpinia s.s. + C. gilliesii e C. hughesii). Os sítios de DNAr 45S variaram de oito a 14, sempre co-localizados com bandas CMA+/DAPI− preferencialmente nos cromossomos acrocêntricos. Enquanto que o DNAr 5S marcou apenas um par de cromossomos na maioria das espécies analisadas. A análise de cGISH revelou marcação positiva da heterocromatina proximal nos experimentos controle. Por outro lado, em todas as combinações de hibridização cruzada não houve marcação dessa heterocromatina, revelando que cada espécie analisada do Nordeste do Brasil (C. echinata, L. ferrea e P. pyramidalis) possui um genoma distinto. Observou-se uma correlação perfeita entre o padrão de bandas heterocromáticas e distribuição geográfica. No entanto, esses dados citogeográficos não correspondem à filogenia. Por exemplo, todas as espécies do Nordeste do Brasil apresentaram o mesmo padrão de heterocromatina, mas estão inseridas em três clados diferentes. Por outro lado, a presença de heterocromatina CMA0/DAPI− é monofilética em Arquita e Erythrostemon. Estes resultados sugerem que a heterocromatina CMA+ é altamente dinâmica e a amplificação/desamplificação (i) pode ser aleatória gerando cariótipos similares em espécies não relacionadas ou (ii) pode estar relacionado às condições ambientais, o que poderia gerar cariótipos similares em espécies filogeneticamente nãorelacionadas distribuídas na mesma região geográfica. Em qualquer cenário, a heterocromatina rica em GC aparente parece evoluir de uma forma homoplásica, sugerindo que a interpretação deste caractere em Caesalpinia sensu lato é complexo e precisa ser examinado com cuidado e em um contexto filogenético.

Palavras-chave: Citogenética, Caesalpinia, heterocromatina, filogenia molecular.

Abstract Caesalpinia sensu lato is a pantropical group of about 150 species, with a concentration of diversity in the Neotropics in three main centers: Andean (Argentina, Bolivia, Chile and Peru), Northeastern of Brazil and Mesoamerican (Mexico, Southern USA and caribbean). The group has a long and complex taxonomic history, and recent phylogenetic analyses suggest that it is clearly polyphyletic, but generic delimitation remains uncertain due to lack of phylogenetic resolution. This study aims to analyze the distribution of 5S and 45S rDNA sites and the evolution of CMA/DAPI heterochromatic bands in Caesalpinia s.l., to help clarify phylogenetic relationships. In addition it carried out a molecular phylogeny based on plastid sequences matK, rps16, trnDT, trnL and ycf6 and nuclear ITS and genomic homology among species of northeastern Brazil was investigated by comparative GISH (cGISH). A total of 18 species from eight groups segregates of Caesalpinia s.l. were analysed, including Arquita (2 sp.), Balsamocarpon (1 sp.), Caesalpinia sensu stricto (2 sp.), Echinata (1 sp.), Erythrostemon (6 sp.), Guilandina (1 sp.), Libidibia (1 sp.) e Poincianella (4 sp). While all species had the same chromosome numbers (2n = 24; 16M/SM + 8A/SM), we observed variable patterns of heterochromatin distribution. For acrocentric chromosomes, CMA+/DAPI− bands were found on the short arms in all species. In contrast, three different patterns were found in metacentric chromosomes: proximal CMA+/DAPI bands (Balsamocarpon, Echinata, Guilandina, Libidibia e Poincianella), proximal CMA0/DAPI bands (Arquita e Erythrostemon) and terminal CMA+/DAPI bands (Caesalpinia s.s. + C. gilliesii and C. hughesii). Sites of 45S rDNA ranged from eight to 14, always co-localized to CMA+/DAPI− bands preferably in the acrocentric chromosomes. Whereas the 5S rDNA labeled only one chromosome pair in most species analyzed. The cGISH analysis revealed positive hybridization of the proximal heterochromatin in the control experiments. On the other hand, in all cross-hybridization combinations no marking this heterochromatin, revealing that each species analyzed in the Northeast of Brazil (C. echinata, L. ferrea and P. pyramidalis) has a different genome. A perfect correlation between heterochromatic banding pattern and geographical distribution was observed. However, this cytogeographical data did not match to the phylogeny. For example, all species from Northeastern of Brazil showed the same heterochromatin pattern, but were placed in three different clades. Moreover, the presence of heterochromatin CMA0/DAPI− is monophyletic in Arquita e Erythrostemon. These findings suggest that CMA+ heterochromatin are highly dynamic and amplification/desamplification (i) might be random and lead to the similar karyotypes found in non-related species or (ii) might be related to environmental conditions, which could give rise to similar karyotypes in non-phylogenetically related species distributed on the same geographical region. In either scenario, the GC-rich CMA heterochromatin and the apparent karyotype similarity seem to evolve in a homoplasic way, suggesting that the interpretation of this character in Caesalpinia sensu lato is complex and needs to be examined with caution and in a phylogenetic context.

Keywords: Cytogenetic, Caesalpinia, heterocromatin, molecular phylogeny.

SUMÁRIO 1. Introdução

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2. Referencial Teórico

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2.1 Coloração CMA/DAPI

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2.2 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

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2.3 Hibridização genômica in situ (GISH)

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2.4 Citogeografia

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2.5 Filogenia Molecular

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2.6 O gênero Caesalpinia sensu lato

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3. Referências

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4. Manuscrito

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Resumo

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Introdução

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Material e Métodos

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Material vegetal

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Filogenia molecular

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Bandeamento cromossômico

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Hibridização in situ Fluorescente

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Medições cromossômicas e reconstrução de caracteres

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Resultados

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Relações evolutivas

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Distribuição de heterocromatina

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Hibridização in situ

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Discussão Conclusão

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Referências

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Figura suplementar

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Tabela 1

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1. Introdução A família Leguminosae (Fabaceae) se destaca por ser a terceira maior família entre as Angiospermas e pela diversidade no Nordeste do Brasil (Forzza et al., 2010). A família é caracterizada morfologicamente pela existência do fruto do tipo legume, folhas geralmente compostas e hábitos variando de árvores, arbustos, ervas e trepadeiras (Lewis, 2005). Taxonomicamente, a família tem sofrido diversas alterações baseadas em dados de filogenias moleculares recentes. Assim, as três subfamílias tradicionalmente reconhecidas para Leguminosae devem ser reformuladas, tendo em vista o parafiletismo de Caesalpinioideae/Mimosoideae (Doyle et al., 1997). Posteriormente Legume Phylogeny Working Group (2013) sugeriu que Leguminosae seja circunscrita em seis subfamílias, boa parte das subfamílias são oriundas de subdivisões de Caesalpinioideae. Dentro do grado Caesalpinioideae o gênero Caesalpinia sensu lato se destaca por ser pantropical e formado por aproximadamente 150 espécies que variam de hábito (árvores, arbustos e lianas) se distribuindo em ambientes preferencialmente áridos, como as florestas tropicais secas (Manzanilla e Bruneau, 2012). Na região Neotropical o grupo apresenta diversidade em regiões áridas da Mesoamérica e América do Sul. Apresentam flores zigomorfas com a pétala maior geralmente mais interna e folhas compostas pinadas (Judd et al., 2009). O gênero Caesalpinia s.l possui uma taxonomia complexa, com propostas divergentes de separação em gêneros menores. Lewis (2005) separou o grupo em sete gêneros, Coulteria Kunth, Erythrostemon Klotzsch, Guilandina L., Libidibia Schlt, Mezoneuron Desf, Poincianella Britton & Rose e Tara Molina, dos quais apenas cinco (Tara, Coulteria, Libidibia, Guilandina, e Mezoneuron) foram confirmados em filogenias posteriores (Gagnon et al., 2013). Além disso, a análise filogenética revelou que três clados (C. trothae (Harms) Brenan, C. erianthera Chiov e C. trichocarpa Griseb.) apontam-se robustos, podendo ser tratados como novos gêneros, embora necessitem de revisões taxonômicas mais detalhadas. Um exemplo disso foi a circunscrição do gênero Arquita Gagnon, G.P.Lewis & C.E.Hughes recentemente descrito com base em sistemática molecular, é composto por duas espécies de região Andina que são morfologicamente difíceis de diferenciar de outros gêneros próximos (Gagnon et al., 2015). Nesse sentido, as análises citogenéticas podem ajudar a apontar sinapomorfia que ajudem numa melhor delimitação desses grupos.

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Análises citogenéticas revelam que Caesalpinia s.l. apresenta estabilidade cariotípica numérica, com a maioria das espécies apresentando 2n = 24 cromossomos, geralmente meta/submetacêntricos ou acrocêntricos e com tamanho pequeno (Beltrão e Guerra, 1990). Poliploides são raros, sendo reportados apenas em Libidibia (=Caesalpinia) ferrea (Mart. exTul.) L. P. Queiroz e Poincianella (=Caesalpinia) bracteosa (Tul.) L.P. Queiroz, ambas com 2n = 48 (Alves e Custódio, 1989; Beltrão e Guerra, 1990). Embora as diferenças na morfologia dos cromossomos seja muito sutil, a análise de assimetria cariotípica revelou que há uma variação intra genérica, como cariótipos mais simétricos em Libidibia quando comparado a Poincianella que apresentou assimetria intermediaria (Rodrigues et al., 2013). A coloração com fluorocromos CMA e DAPI utilizada para identificar regiões cromossômicas ricas em pares de base GC e AT, respectivamente (Guerra, 2002) é amplamente empregada na citogenética comparativa de plantas e pode auxiliar numa melhor caracterização dos cariótipos das espécies de Caesalpinia s.l. Adicionalmente, a hibridização in situ fluorescente (do inglês FISH), uma técnica que determina a presença e posição de sequências de DNA ou RNA específicas (sonda) no cromossomo (alvo), pode refinar ainda mais uma análise citogenética. A combinação de dupla coloração CMA e DAPI e FISH com DNAr 5S e 45S permitiram por exemplo, a diferenciação de Passiflora edulis Sims e Passiflora cacaoensis Bernacci & Souza (Viana et al., 2012). A hibridização genômica in situ (sigla em inglês GISH) foi originalmente descrita com a finalidade de distinguir cromossomos ou genomas de espécies parentais em híbridos sintéticos ou naturais. Entretanto, mais recentemente essa técnica começou a ser utilizada para comparar a proximidade filogenética entre diferentes genomas, através de uma variante chamada comparativeGISH (cGISH). Esse tipo de abordagem permitiu, por exemplo, investigar relações evolutivas em diversos grupos de plantas (Markova e Vyskot, 2009; Mao et al., 2012; She et al., 2015). Estes dados citogenéticos podem ser melhor interpretados com a incorporação de uma filogenia molecular e métodos filogenéticos comparativos, que nos permita interpretar de forma mais clara a evolução cariotípica do grupo (Vaio et al., 2013; Souza et al., 2015). O presente trabalho teve por objetivo compreender a diversificação cariotípica de Caesalpinia s.l., analisando 18 espécies do grupo com base em número e morfologia cromossômica, bandeamento Cromomicina A3 (CMA) e 4’, 6-diamidino-2-

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fenilindol (DAPI) e FISH para o DNAr 5S e 45S. Além disso, as relações cariotípicas entre as espécies do Nordeste do Brasil foram investigadas por cGISH. Por fim foi construída uma filogenia molecular para essas espécies baseada em sequências plastidias (matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6) e nuclear (ITS), visando interpretar a relação entre a variabilidade cariotípica e distribuição geográfica.

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2. Referencial Teórico 2.1 Bandeamento CMA/DAPI A heterocromatina está relacionada a uma série de dados importantes como a presença de DNA repetitivo em tandem e a quase ausência de atividade gênica. Tradicionalmente a fração heterocromática do genoma é dividida em heterocromatina facultativa e constitutiva, sendo a constitutiva um elemento amplamente estudado na citogenética (Sumner, 2003). A identificação das regiões de heterocromatina nos cromossomos só se tornou possível com o desenvolvimento da técnica de bandeamento C (Schwarzacher et al., 1980) possibilitando um aprimoramento das análises citogenéticas comparativas (Guerra, 2000). Posterior ao bandeamento C surgiram várias outras técnicas para a visualização de heterocromatina, dentre elas a dupla colocação com os fluorocromos CMA (Cromomicina A3) e DAPI (4’,6-diamidino-2-fenilindol). Trata-se de uma das técnicas mais utilizadas na citogenética vegetal e consiste na afinidade do CMA por regiões do cromossomo ricas em guanina e citosina (GC) e do DAPI ricas em adenina e timina (AT) (Guerra e Souza 2002). Essa técnica desenvolvida por Schweizer (1976) que analisou três espécies de plantas (Vicia faba L., Scilla siberica Andrews e Ornithogalum caudatum Jacq.) revelando marcação CMA positiva (CMA+) nas RONs (regiões organizadoras de nucléolos) e bandas heterocromáticas. As análises da distribuição de heterocromatina constituem uma das principais ferramentas para o estudo de citogenética comparativa (Souza e Guerra, 2012). Desse modo, a coloração CMA/DAPI tem sido utilizada a fim de facilitar o entendimento das relações evolutivas. No gênero Citrus L. esta técnica revelou que os cromossomos podem ser definidos pela presença de grandes blocos de heterocromatina rica em GC (CMA+) em regiões específicas dos cromossomos, permitindo definir tipos cromossômicos (ex: o cromossomo tipo A apresenta uma banda proximal, uma banda terminal no braço curto e outra no braço longo; tipo B apresenta uma banda proximal e uma banda terminal; tipo C apresenta bandas CMA+ terminais em ambos os braços cromossômicos, etc). Assim, foram identificados sete tipos cromossômicos (A – G) mostrando cariótipos homomórficos (espécies puras) e heteromórficos (espécies híbridas), permitindo identificar que a maioria dos cultivares de Citrus são híbridos e seus prováveis parentais (Moraes et al., 2007).

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Dentro do gênero Solanum L., o estudo da seção Acanthophora Dunal (Solanum) revelou uma diversidade de bandas CMA e DAPI, permitindo uma interpretação do relacionamento entre as espécies (Chiarini et al., 2013). Neste trabalho, diversos padrões de bandas CMA+ (associadas ou não aos sítios de DNAr 45S) foram revelados. Os autores sugerem que o incremento na quantidade de heterocromatina seja uma característica basal na seção Acanthophora e que a amplificação dessa fração repetitiva do genoma esteja relacionada com a expansão do tamanho do genoma e assimetria cariotípica. 2.2 Hibridização in situ fluorescente (FISH)

A FISH (Hibridização in situ fluorescente) é uma técnica de hibridização realizada com moléculas fluorescentes e possui a finalidade de verificar a presença e posição de determinada sequência de DNA ou RNA (sonda) no cromossomo (alvo) (Guerra, 2004). A detecção de sequências in situ e a hibridização fluorescente trouxeram avanços significativos na citogenética vegetal, que vai desde a construção de mapas físicos, até a posição de genes e de marcadores moleculares (Jiang e Gill, 2006). As sequências de DNA ribossomal (DNAr 5S e DNAr 45S) são as mais usadas em plantas por serem repetidas milhares de vezes e por se organizarem em blocos (tandem), o que torna a sua localização nos cromossomos mais fácil. Além disso, estão presentes em todos os seres vivos e são muito conservadas em termos de sequências de DNA, o que permite o uso de sondas heterólogas (sonda de uma espécie hibridizada em outra distinta) facilitando a informação em espécies com pouca/nenhuma informação genômica disponível. Em alguns casos as sequências de DNAr 5S e 45S podem ser bastante variáveis como no gênero Clivia Lindl., onde os sítios de DNAr 45S variaram de dois a seis (Ran et al., 2001). Os autores concluíram que a presença de sítios de DNAr em cromossomos específicos podem constituir sinapomorfia para alguns clados e que esses sítios sofreram eventos de amplificação/desamplificação ao longo de sua evolução. Por outro lado, análises com amostragem mais extensas revelaram variabilidade intraespecífica no número de sítios de DNAr. A FISH em diferentes acessos de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) revelou uma estabilidade no número de sítios de DNAr 5S contrapondo com uma extensa variabilidade no número de sítios de DNAr 45S (de dois a oito locus por cariótipo)

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sempre nos terminais cromossômicos. A partir deste dado, foi possível inferir que essa variação intraespecífica esteja relacionada com recombinações ilegítimas nas regiões terminais dos cromossomos levando ao espalhamento de cópias desse sítio pelo genoma (Pedrosa-Harand et al., 2006). Todavia, numa espécie muito próxima e com histórico similar de domesticação e cultivo, a fava (P. lunatus L.) mostrou uma tendência completamente distinta. Nesse caso houve estabilidade no número de sítios de DNA dentro dos 17 acessos analisados (Almeida et al., 2011). Isso sugere que os sítios de DNAr podem variar muito em número dentro de uma mesma espécie ou entre espécies próximas, possuindo portanto sequências de evolução muito rápidas e aleatórias, tendo confiabilidade restrita em estudos comparativos. Em Citrus (Barros e Silva et al., 2010a) a técnica de hibridização in situ fluorescente foi de extrema importância para a determinação de marcas na diferenciação de espécies. Nesse trabalho foi possível observar a variabilidade de bandas heterocromáticas, relacionadas como o DNA satélite CsSat 181 específico do gênero. Com essa análise foi possível avaliar relação de Citrus dentro da subfamília Aurantioideae, que estava mais próximo dos gêneros Fortunella Swingle e Poncirus Raf, visto que estes compartilham o mesmo DNA satélite específico.

2.3 Hibridização Genômica in situ (GISH) Uma variante da FISH é a técnica de hibridização genômica in situ (sigla em inglês GISH). Desenvolvida em 1989 por Schwarzacher e colaboradores a fim de distinguir cromossomos em um híbrido (alopoliploide), podendo assim discriminar genomas de espécies parentais em metáfases do híbrido. Esta técnica é utilizada para identificar a variação da cromatina a partir de espécies diferentes, sendo útil também para entender o pareamento de homeólogos e a recombinação cromossômica entre genomas distintos. O procedimento da GISH ocorre a partir da extração do genoma do material que se tornará a sonda. A adição de moléculas marcadoras e sinalizadoras na fita de DNA é necessária para a visualização dos cromossomos marcados (Roa e Guerra, 2012). Em várias espécies de genoma pequeno (Ali et al., 2004; Zhao et al., 2013) as análises de GISH não revelam marcação em todo o cromossomo, mas sim apenas nos blocos de heterocromatina proximal. Nesses casos, a técnica é limitada no que diz respeito à

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visualização de recombinação intergenômica. Uma modificação do protocolo (aumento da concentração de sonda na hibridização) realizada por Ali e colaboradores (2004), permitiu marcar homogeneamente os cromossomos de espécies na GISH, entretanto, esse método ainda é dispendioso e pouco utilizado. Usando esse procedimento os autores identificaram que Arabidopsis arenosa (L.) Lawalrée é um alotetraploide, tendo como um dos parentais a espécie Cardaminopsis carpatica Mesicek. No gênero Setaria P.Beauv. análises de GISH permitiram revelar três novos genomas Setaria glauca P.Beauv. (D), Setaria plicata T.Cooke (E) e Setaria arenaria Kitag. (F) mostrando a diversidade e origem distinta dos genomas dentro do grupo (Zhao et al., 2013) Além do tamanho do genoma, a GISH pode ter graus de eficiência distintos dependendo da divergência filogenética entre as espécies parentais (Markova e Vyskot, 2009), podendo ser utilizada como um indicador de relacionamento evolutivo. Nesse sentido, a GISH é utilizada como uma ferramenta na comparação de homologia entre espécies (comparativeGISH ou cGISH). Três espécies Sinapis arvensis L. (SS), Brassica rapa L. (AA) e Brassica nigra (L.) Andrz (BB) foram analisadas revelando a hibridazação positiva do genoma de S. arvensis nas duas espécies de Brassica e a hibridização de B. nigra e B. rapa em S. arvensis, mostrando homologia entre os genomas. Adicionalmente, foi possível identificar que o genoma do tipo BB é mais intimamente relacionado ao genoma SS, quando comparados os três genomas em questão (Mao et al., 2012). Dentro das Leguminosas, um estudo em espécies cultivadas do gênero Vigna Savi (She et al., 2015) mostrou que a cGISH foi fundamental no suporte das relações entre as espécies, onde o DNA genômico de Vigna umbellata (Thunb.) Ohwi & H.Ohashi hibridizou fortemente as regiões centroméricas de V. angularis (Thunb.) Ohwi & H.Ohashi e V. umbellata, sugerindo uma proximidade entre essas espécies. Por outro lado, essa mesma sonda apresentou fraca marcação em metáfases de V. aconitifolia (Jacq.) Maréchal e V. mungo var. Mungo (L.) Hepper. Esse resultado corroborou com as análises filogenéticas do grupo baseada em filogenias moleculares.

2.4 Citogeografia Citogeografia é a análise da distribuição geográfica de marcadores citológicos polimórficos. Essa análise da distribuição espacial da diversidade cariotípica pode

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sugerir o significado adaptativo de determinados tipos de rearranjos, assim como processos que influenciam na formação de um padrão particular de distribuição geográfica (Colombo et al., 2004). Dentre os polimorfismos cromossômicos mais associados com padrões de distribuição geográfica estão alterações no

tamanho de genoma, inversões

cromossômicas, cromossomos B, fissão/fusão cêntrica entre outros (Majure et al., 2012; Souza et al., 2015). No entanto a poliploidia parece ser a alteração cariotípica que mais influência na distribuição das espécies vegetais. A análise do gênero Opuntia (L.) Mill no clado Humifusa (Cactaceae), por exemplo, revelou que os taxa diplóide apresentavam uma distribuição muito restrita no sudeste/sudoeste dos EUA, em regiões que serviam de refúgio no período do Pleistoceno. Já os táxons poliplóides, que teriam se formado durante o período interglacial do Pleistoceno, através do contato das populações diplóides apresentando uma distribuição geográfica muito mais ampla, sugerindo que a poliploidia esteja relacionada com maior adaptabilidade para a colonização de novos ambientes (Majure et al., 2012) . Em análises citogenéticas de populações de milho, no noroeste da Argentina, revelaram uma alteração do número médio de cromossomos B correlacionado com altitude das populações das espécies (Lia et al., 2007). Esses dados sugerem que pode haver alguma relação entre polimorfismos cariotípicos e adaptabilidade, entretanto a demonstração desse mecanismo ainda é incerta. Em Poaceae, no gênero Aegilops L. é possível observar uma repadronização cromossômica, que se formou a partir de uma espécie natural (Aegilops speltoides Tausch) em uma população marginal, gerando rapidamente uma nova espécie (Aegilops sharonensis Eig). Essa espécie nova pode ser reconhecida por diferenças morfológicas e no número de sítios de DNAr 5S, que foi amplificado no genoma em associação com um retroelemento (Raskina et al., 2004). 2.5 Filogenia molecular A filogenia é o método de reconstrução das relações entre os organismos e de sua história evolutiva. Essa técnica engloba a identificação de caracteres homólogos que são compartilhados pelos organismos e a relação evolutiva baseada na comparação de diversos caracteres. Por muitos anos as análises filogenéticas eram apenas baseadas em caracteres morfológicos. Mas na década de 80 em diante, a utilização de dados moleculares revolucionou esse método (Savolainen e Chase, 2003).

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A técnica é baseada em sequências de DNA, onde são comparados caracteres homólogos que são alinhados e organizados numa árvore filogenética. As sequências de DNA utilizadas numa filogenia tendem a ser variáveis a ponto de unir grupos e/ou espécies a partir de suas sinapomorfias. As sequências mais utilizadas para a filogenia são as sequências não codificantes do DNA plastidial e o ITS (espaçadores transcritos internos) do DNA ribossomal (Vaio et al., 2012). De acordo com (Yang e Rannala, 2012) a análise filogenética molecular colabora em examinar diferentes classificações taxonômicas, até então baseadas apenas em caracteres morfológicos. Além de representar as relações entre diferentes grupos, as árvores filogenéticas estão sendo utilizadas para entender os processos existentes por trás destas relações. Essas análises permitem diagnosticar as taxas de evolução de polimorfismos, eventos de poliploidia, origens de domesticação, entre outros (Vaio et al., 2012). A análise filogenética tem importância essencial no suporte de estudos cromossômicos, podendo corroborar ou não com os dados apresentados por análises cromossômicas. Esses dados incrementam o estudo positivamente, gerando informações mais confiáveis como, por exemplo, no estudo de Leucocoryne Lindl (Souza et al., 2015) onde a análise citogenética sustentava a hipótese de que a duplicação de sítios de DNAr 5S nas espécies do norte do Chile ocorreu num ancestral comum as espécies, mas, com base na filogenia é possível confirmar que essa duplicação se deu de forma aleatória e que as espécies que possuíam os sítios duplicados, não eram monofiléticas. 2.6 O gênero Caesalpinia sensu lato O grupo Caesalpinia s.l., atualmente, consiste em cerca de 150 espécies conhecidas com distribuição pantropical (Lewis, 1987; Gagnon et al., 2013). Nos países da América do Sul como Argentina, Brasil, Paraguai e Uruguai são citadas na literatura e cerca de 39 espécies nativas dessas regiões (Izaguirre e Beyhaut 2003). Morfologicamente as espécies do grupo apresentam hábito de árvores e arbustos com caules lenhosos aculeados ou espinhosos. Os ramos podem ter forma ascendente pubérulo ou glabro. As folhas podem ser paribipinadas ou imparibipinadas com pinas opostas ou alternas e sem nectários. Apresentam estípulas caducas. O fruto do tipo legume deiscente inerme ou aculeado, internamente seco ou carnoso, não dividido em compartimentos. Sementes com hilo apical ou subapical. Inflorescência em racemos

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simples, ou panículas, axilares e/ou terminais. Apresentam brácteas caducas. Flores zigomorfas, pentâmeras, com cálice dialissépalo e sépalas imbricadas no botão floral (uma delas sobreposta sobre as demais). Corola com pétalas que variam de amarelas, alaranjadas ou vermelhas, sésseis. Apresentam dez estames férteis isomorfos com filetes livres e anteras glabras, o ovário séssil e estilete geralmente curvado; estigma subterminal/terminal (Bortoluzzi et al., 2007). Historicamente o gênero Caesalpinia possui uma grande complexidade em sua taxonomia. Desde a descrição do gênero até a atualidade, diversas reorganizações foram realizadas no grupo. A proposta por Polhill e Vidal (1981) do grupo informal Caesalpinia composto por 16 gêneros foi considerada bastante distinta por analisar morfologicamente diversas estruturas dentro da tribo. Nessa classificação foram incluídos Conzattia Rose, Lemuropisum H. Perrier e Parkinsonia L. no grupo Caesalpinia, mas posteriormente foram incluídos em taxa distintos (Bruneau et al., 2001). Mais recentemente, Lewis (2005) reintegrou ao grupo oito gêneros, deixando Caesalpinia sensu lato com 21 gêneros. Mas observou que o monofilestimo do grupo ainda precisa ser analisado, bem como características morfológicas e filogenéticas. Gagnon e colaboradores (2013) construíram a filogenia do grupo Caesalpinia sensu lato baseada em sequências nuclear e plastidiais, incluindo 18 dos 21 gêneros descritos anteriormente e 98 das 150 espécies conhecidas. Nesse trabalho foram reconhecidos 20 grupos, onde o monofiletismo foi bem suportado em cinco linhagens reconhecidas por Lewis (2005) (Tara, Coulteria, Libidibia, Guilandina, e Mezoneuron), além de outros grupos não-monofiléticos. Essa análise ainda sugeriu três gêneros distintos (clado C. trothae, clado C. erianthera e clado C. trichocarpa). Recentemente descrito, o gênero Arquita (Gagnon et al., 2015), é composto por duas espécies de região Andina que são morfologicamente difíceis de diferenciar de outros gêneros próximos. Dentro das Leguminosas, há uma grande variação em morfologia, hábito e habitat como também quanto ao número cromossômico. Originalmente é provável que os números cromossômicos nas Leguminosas seja n = 5,6,7 ou 8, mas é possível observar diversos eventos de duplicação e aneuplodia, gerando vários números nas três subfamílias. A poliploidia é presente em 82% na subfamília Cesalpinioideae, 93% em Mimosoideae e 69% em Faboideae onde o número básico cromossômico é igual a oito, mas variações dentro da subfamília podem ocorrer de n = 7 e n = 11 (Bandel 1974).

11

Esse estudo indica que a evolução cariotípica das tribos ocorreu independentemente dentro das subfamílias. Como em Caesalpinioideae onde o número haplóide mais comum é n = 12 e n = 14. Estudos em Caesalpinia s.l revelaram estabilidade entre os cariótipos das espécies do grupo com 2n = 24 sendo 16 metacêntricos ou submetacêntricos e oito acrocêntricos (Beltrão e Guerra 1990). Esses cromossomos apresentaram tamanhos pequenos (~2μm). Populações tetraplóides foram observadas em duas espécies (Libidibia ferrea e Poincianella bracteosa) com 2n = 48. Em análise da morfologia dos cromossomos dentro do grupo Caesalpinia s.l, dados de assimetria cariotípica revelaram variações intragenéricas, onde o gênero Libidibia apresentou cariótipos mais simétricos quando comparado ao gênero Poincianella que apresentou assimetria intermediária (Rodrigues et al., 2013). Com relação à distribuição de heterocromatina, as análises citogenéticas em Caesalpinioideae revelaram 2-4 pares de cromossomos com banda CMA+/DAPI− (ricas em GC) e também diferenças significativas no tamanho cromossômico e condensação de Cassieae, Chamaecrista e Senna (Souza et al., 2004). Em Phaseolus o bandeamento CMA/DAPI demonstrou que Phaseolus microcarpus possui bandas CMA+ quase ausente na região pericentromérica, sendo distinto quando comparado com Phaseolus vulgaris e Phaseolus lunatus. Juntamente com o uso de BACs, foi possível afirmar que as regiões pericentroméricas de P. microcarpus é composta por sequências repetitivas distintas (Fonsêca et al., 2013).

12

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17

Diversificação heterocromática e cito-molecular em Caesalpinia sensu lato (Leguminosae)

Brena Van-Lume1, Edeline Gagnon2, Gustavo Souza1* 1

Laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal, Departamento de Botânica, CB, Universidade Federal

de Pernambuco, Rua Prof. Nelson Chaves, S/N, Cidade Universitária, Recife, PE 50372-970, Brasil 2

Institut de Recherche en Biologie Végétale, Département de Sciences biologiques, Université de

Montréal, 4101 rue Sherbrooke est, Montréal, Québec H1X 2B2, Canada

*E-mail: [email protected] Manuscrito a ser submetido à revista Annals of Botany

18 Resumo Caesalpinia sensu lato é um grupo Pantropical com cerca de 150 espécies e alta diversidade nos neotrópicos, dividido em três centros principais: Andino (Argentina, Bolívia, Chile e Peru), Nordeste do Brasil e Mesoamérica (Caribe, Sul dos Estados Unidos e México). O grupo tem uma história taxonômica longa e complexa, e recentes análises filogenéticas sugerem que é claramente polifilético, mas a delimitação do gênero permanece incerta devido à falta de resolução filogenética. Este estudo tem como objetivo avaliar a distribuição dos sítios de DNAr 5S e 45S e a evolução das bandas heterocromáticas CMA/DAPI em Caesalpinia s.l., visando esclarecer as relações filogenéticas. Adicionalmennte foi investigada a homologia genômica entre as espécies do Nordeste do Brasil por GISH comparativa (cGISH). Esses dados foram interpretados com base numa filogenia molecular construida a partir de sequências plastidiais matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6 e nuclear ITS. Um total de 18 espécies de oito grupos segregados de Caesalpinia s.l. foram analisadas, incluindo Arquita (2 sp.), Balsamocarpon (1 sp.), Caesalpinia sensu stricto (2 sp.), Echinata (1 sp.), Erythrostemon (6 sp.), Guilandina (1 sp.), Libidibia (1 sp.) e Poincianella (4 sp). Enquanto todas as espécies tinham o mesmo número de cromossomos (2n = 24; 16M/SM + 8A/SM) nós observamos padrões variáveis de distribuição da heterocromatina. Para os cromossomos acrocêntricos, bandas CMA+/DAPI− foram observadas no braço curto em todas as espécies. Em contraste, três padrões diferentes foram encontrados nos cromossomos metacêntricos: bandas proximais CMA+/DAPI− (Balsamocarpon, Echinata, Guilandina, Libidibia e Poincianella), bandas proximais CMA0/DAPI− (Arquita e Erythrostemon) e bandas terminais CMA+/DAPI− (Caesalpinia s.s. + C. gilliesii e C. hughesii). Os sítios de DNAr 45S variaram de oito a 14, sempre co-localizados com bandas CMA+/DAPI− preferencialmente nos cromossomos acrocêntricos. Enquanto que o DNAr 5S foi localizado apenas em um par cromossômico na maioria das espécies analisadas. A cGISH revelou marcação positiva da heterocromatina proximal nos experimentos controle. Por outro lado, em todas as combinações de hibridização cruzada não houve marcação dessa heterocromatina, revelando que cada espécie analisada do Nordeste do Brasil (C. echinata, L. ferrea e P. pyramidalis) possui um genoma distinto. Observou-se uma correlação entre o padrão de bandas heterocromáticas e distribuição geográfica. No entanto, esses dados citogeográficos não correspondem à filogenia. Por exemplo, todas as espécies do Nordeste do Brasil apresentaram o mesmo padrão de heterocromatina, mas estão inseridas em três clados diferentes. Por outro lado, a presença de heterocromatina CMA0/DAPI− é monofilética em Arquita e Erythrostemon. Estes resultados sugerem que a heterocromatina CMA+ é altamente dinâmica e a amplificação/desamplificação (i) pode ser aleatória gerando cariótipos similares em espécies não relacionadas ou (ii) pode estar relacionado às condições ambientais, o que poderia gerar cariótipos similares em espécies filogeneticamente nãorelacionadas distribuídas na mesma região geográfica. Em qualquer cenário, a heterocromatina rica em GC aparente parece evoluir de forma homoplásica, sugerindo que a interpretação deste caractere em Caesalpinia sensu lato é complexo e precisa ser examinado com cuidado e em um contexto filogenético.

Palavras-chave: Citogenética, Caesalpinia, heterocromatina, filogenia molecular.

19

Introdução Citogeografia é a análise da distribuição geográfica de marcadores citológicos polimórficos (Colombo et al., 2004). A análise da distribuição espacial da diversidade cariotípica pode sugerir o significado adaptativo de determinados tipos de rearranjos, assim como processos que influenciam na formação de um padrão particular de distribuição (Colombo et al., 2004; Raskina et al., 2004). Nesse sentido, a análise cariotípica extensiva de grupos com distribuição geográfica ampla e distintas condições ecológicas pode ajudar a entender a relação entre variabilidade cariotípica e distribuição geográfica. O gênero Caesalpinia sensu lato (Leguminosae) pode representar um bom modelo citogeográfico por ser pantropical, com distribuição em diferentes ambientes, principalmente em florestas tropicais secas (Lewis, 2005; Manzanilla e Bruneau, 2012). Nos Neotrópicos, Caesalpinia s.l. apresenta como centros de diversidade as regiões Mesoamericana (Sul dos Estados Unidos, México e Caribe), Andina (Argentina, Bolívia, Chile e Peru) e Nordeste do Brasil (Lewis, 2005). Muitas caesalpinoides se distribuem de forma disjunta entre esses centros de diversidade, sendo a dispersão à longa distância uma característica marcante no grupo (Simpson et al., 2005; 2006). Caesalpinia

s.l.

é

formado

arbóreas/arbustivas

com

taxonomia

por

aproximadamente

complexa,

sofrendo

150

diversas

espécies alterações

nomenclaturais principalmente com base em filogenias moleculares recentes (Manzanilla e Bruneau, 2012; Gagnon et al., 2013; 2015). Lewis (2005) propôs a separação do grupo em sete gêneros, Coulteria Kunth, Erythrostemon Klotzsch, Guilandina L., Libidibia Schlt, Mezoneuron Desf, Poincianella Britton & Rose e Tara Molina, dos quais apenas cinco (Tara, Coulteria, Libidibia, Guilandina e Mezoneuron) foram confirmados em filogenias posteriores (Gagnon et al., 2013). Além disso, essa análise filogenética revelou que três clados (C. trothae (Harms) Brenan, C. erianthera Chiov. e C. trichocarpa Griseb.) podem constituir novos gêneros, embora necessitem de revisões taxonômicas detalhadas. O gênero críptico Arquita Gagnon, G.P.Lewis & C.E.Hughes, por exemplo, foi recentemente descrito com base em sistemática molecular, embora apresente poucos caracteres diagnósticos (Gagnon et al., 2015). Nesse sentido, as análises citogenéticas podem indicar sinapomorfias que ajudem numa melhor delimitação desses grupos.

20

Caesalpinia s.l. é caracterizado cariotipicamente por apresentar estabilidade numérica com 2n = 24, com tamanho cromossômico pequeno (~2μm) e morfologia meta/submetacêntrica e acrocêntrica (Beltrão e Guerra, 1990; Rodrigues et al., 2013). Poliploides são raros no gênero, sendo reportados apenas em Libidibia (=Caesalpinia) ferrea (Mart. ex Tul.) L. P. Queiroz e Poincianella (=Caesalpinia) bracteosa (Tul.) L.P. Queiroz, ambas com 2n = 48 (Alves e Custódio, 1989; Beltrão e Guerra, 1990). Em grupos de plantas com cariótipos numericamente estáveis a análise cariotípica mais detalhada, por exemplo, usando bandeamento cromossômico e hibridização in situ fluorescente (FISH) tem permitido um melhor entendimento da evolução cariotípica (Hizume et al., 2002; Almeida et al., 2007; Barros e Silva et al., 2010a; Moreno et al., 2015). A citogenética comparativa pode ainda ser incrementada pela hibridização genômica in situ (GISH). Essa técnica permite distinguir cromossomos em um híbrido (alopoliploide), podendo assim discriminar genomas de espécies parentais em metáfases do híbrido (Schwarzacher et al., 1989). A eficácia da técnica de GISH depende diretamente da divergência filogenética entre as espécies parentais, sugerindo que essa técnica pode ser usada como um indicador de relacionamento evolutivo (Markova e Vyskot, 2009). Nesse sentido, a GISH tem sido utilizada como uma ferramenta na comparação (comparative GISH ou cGISH) verificando a homologia entre espécies/genomas (Mao et al., 2012; Zhao et al., 2013; She et al., 2015). Esses estudos cito-moleculares têm sido incorporados a filogenias moleculares através de métodos filogenéticos comparativos (Souza et al., 2015; Kolano et al., 2015; Moreno et al., 2015). A análise filogenética tem importância essencial na interpretação da

variabilidade

cariotípica,

podendo

apontar

tendências

evolutivas

de

amplificação/desamplificação de sítios de DNAr, bandas heterocromáticas, tamanho do genoma, etc. Todas essas análises em conjunto podem esclarecer os mecanismos de evolução cariotípica de Caesalpinia s.l., assim como revelar sinapomorfia para clados de difícil delimitação. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo compreender a diversificação cariotípica de Caesalpinia s.l. baseada numa análise citogenética comparativa. Para isso, foram analisadas 18 espécies do grupo com base em número e morfologia cromossômica, bandeamento Cromomicina A3 (CMA) e 4’, 6-diamidino-2fenilindol (DAPI) e FISH para o DNAr 5S e 45S. Além disso, as relações cariotípicas entre as espécies do Nordeste do Brasil foram investigadas por cGISH. Por fim foi

21

construída uma filogenia molecular para essas espécies baseada em sequências plastidias (matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6) e nuclear (ITS), visando interpretar a relação entre a variabilidade cariotípica e distribuição geográfica.

Material e Métodos Material Vegetal Foram analisadas 18 espécies de Caesalpinia s.l., correspondentes aos grupos Arquita,

Balsamocarpon,

Caesalpinia

sensu

stricto,

Echinata,

Erythrostemon,

Guilandina, Libidibia e Poincianella (Tabela 1). Todas as espécies foram coletadas em campo e mantidas em cultivo no jardim experimental do laboratório de Citogenética e Evolução Vegetal da UFPE para as análises citogenéticas.

Filogenia molecular

Todas as espécies analisadas cariotipicamente foram incluídas na filogenia molecular. Os dados plastidiais matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6 e nuclear ITS foram obtidos do Genbank (Gagnon et al., em preparação). A espécie Caesalpinia bonduc (grupo Guilandina) foi incluída como grupo externo (Gagnon et al., 2013). Cada conjunto de sequências foi alinhado separadamente no software Geneious (Kearse et al., 2012) e em seguida foram concatenadas em uma única matriz. A Inferência Bayesiana foi realizada com a matriz combinada de dados plastidiais e nucleares. O modelo evolutivo mais apropriado para o conjunto de sequências foi determinado usando o Akaike information criterion (AIC) como implementado no programa jModelTest 0.1.1 (Posada, 2008). O melhor modelo estimado para o nosso conjunto de dados foi GTR. A Inferência Bayesiana foi realizada usando o Mr. Bayes v3.1.2 (Ronquist e Huelsenbeck, 2003). A corrida foi realizada com 10.000.000 gerações e as primeiras 1/4 das árvores amostradas foram descartadas (burn-in). Para as árvores subsequentes foi calculada a probabilidade a posteriori (PP) a partir da construção da árvore de consenso de maioria. As árvores foram visualizadas no FigTree v1.3.1 (Rambaut, 2007).

22

Bandeamento cromossômico

Foram germinadas sementes de todas as espécies para a obtenção de pontas de raízes. Essas foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinoleína 0.02% por 24 h a 10 ºC. As mesmas foram fixadas em etanol:ácido acético (3:1, v/v) por 2-24 h à temperatura ambiente e armazenadas à 20 ºC. Para a preparação de lâminas, as pontas de raízes fixadas foram lavadas em água destilada e digeridas em uma solução enzimática de celulase (p/v, Onozuka) 2% e pectinase (v/v, Sigma) 20% na estufa a 37 ºC por 90 minutos. O meristema foi macerado em uma gota de ácido acético 45% e o material foi esmagado e mergulhado em nitrogênio líquido para fixação e remoção da lamínula. Para a dupla coloração CMA/DAPI, as lâminas foram envelhecidas por 3 dias, coradas com 10 μl de CMA 0,1 mg/ml por 30 minutos e em seguida com 10 μl de DAPI 1μg/ml por 60 minutos (Barros e Silva e Guerra, 2010b). Para a montagem das lâminas foi utilizado a solução de glicerol:tampão McIlvaine pH 7.0 (1:1). As Lâminas coradas foram envelhecidas por 3 dias, sendo fotografadas usando um microscópio de epifluorescência Leica DMLB. As imagens foram capturadas por uma câmera de vídeo acoplada a um dispositivo de carga Cohu (CCD) utilizando o software Leica QFISH e posteriormente editadas usando Adobe Photoshop CS3.

Hibridização in situ Fluorescente

Na FISH, para a localização dos sítios de DNAr, um clone de 500 pares de bases do DNAr 5S (D2) de Lotus japonicus, marcado com Cy3-dUTP (Amersham) e um clone de 6.5 kb do 18S-5.8S-25S (R2) de Arabidopsis thaliana, marcado com digoxigenina-11-dUTP, foram utilizados como sondas (Souza et al., 2015). Essas marcações foram feitas por nick translation. As sondas do DNAr 45S foram detectadas com o conjugado de isotiocinato fluorescente anti-digoxigenina (FITC) de ovelha (Roche) e amplificado com o conjugado de coelho anti-FITC (Dako). A FISH foi realizada de acordo com Souza et al. (2015) com pequenas modificações. A solução de hibridização foi composta por formamida 50% (v/v), sulfato de dextrano 10% (p/v), 20 × SSC e 50 mg/μl de cada sonda. As lâminas foram desnaturadas a 75 ºC por 5 minutos, e a estringência final da hibridização foi cerca de 76%. As imagens das melhores células foram capturadas como descrito anteriormente.

23

Para a cGISH foi feita a extração do DNA genômico de P. pyramidalis, C. echinata e L. ferrea, conforme protocolo de Doyle e Doyle (1987). Em seguida o DNA foi quantificado no Nanodrop 2.000 e submetido a fragmentação por fervura até chegar a < 1 kb. Em seguida esses DNAs genômicos foram marcados por nick translation com Cy3-dUTP (Amersham). A hibridização in situ e processamento das imagens se deu como descrito para a FISH.

Medições cromossômicas e reconstrução de caracteres

Para cada espécie, três metáfases com clara morfologia dos cromossomos foram medidas usando o software Adobe Photoshop CS3 versão 10.0. A proporção de braço do cromossomo (RB = comprimento do braço longo / comprimento do braço curto) foi usada para classificar como cromossomos metacêntricos (RB = 1-1,4), submetacêntricos (RB = 1,5-2,9), ou acrocêntricos (RB> 3.0), segundo Guerra (1986). Comprimentos médios do todo complemento cromossômico e pares de cromossomos com bandas CMA e sítios de DNAr foram medidos e comparados para a construção de idiogramas. Para diferenciar os tipos de bandas CMA+ foi estimada a intensidade de fluorescência CMA e DAPI ao longo do cromossomo. Essa medição foi feita no software Leica QFISH usando a função ‘Measure intensity’. Foram feitas medições de intensidade em 10 pontos ao longo do par cromossômico I em três metáfases por espécie. Foram analisados representantes dos grupos Echinata (C. echinata), Poincianella (P. pyramidalis), Libidibia+Balsamocarpon (L. ferrea e B. brevifolium), Arquita (C. mimosifolia e A. trichocarpa) e Erythrostemon (C. hughesii, C. exilifolia e C. coulterioides). Com base nisso, a heterocromatina proximal foi categorizada em CMA+/DAPI ou CMA0/DAPI (ver Fig. 5). A reconstrução de estados ancestrais para os tipos de heterocromatina (CMA+/DAPI e CMA0/DAPI) foi estimado utilizando o software Mesquite v.2.75 (Maddison e Maddison, 2011). Para isso foi utilizada a função ‘trace character history’ usado com a árvore de consenso de maioria de 50% da análise de inferência Bayesiana. O estado ancestral foi inferido usando máxima verossimilhança sobre o modelo Markov k-state one-parameter (Mk1), onde todas as mudanças com igual probabilidade. Os dados cromossômicos foram tratados como caracteres multiestados não-ordenados.

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Resultados

Relações evolutivas

A análise filogenética, baseada nas sequências plastidiais matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6 e nuclear ITS (matriz concatenada com 8.803 pb), resultou em uma árvore robusta e bem resolvida (Fig. 1). A árvore apresentou sete clados: Arquita, Balsamocarpon+Libidibia, Caesalpinia s.s., Echinata, Erythrostemon, Guilandina e Poincianella (Fig. 1). Os clados Arquita e Erythrostemon são grupo irmão (pp = 1), próximo do clado Balsamocarpon+Libidibia (pp = 1). Poincianella compõe um clado bem suportado (pp = 1), enquanto Caesalpinia s.s. apresentou um baixo suporte (pp = 0,6). As espécies do Nordeste do Brasil foram divididas em três clados distintos (Echinata, Libidibia e Poincianella). Além disso, os demais centros de diversidade dos Neotrópicos (Andino e Mesoamericano) também não se revelaram monofiléticos (Fig. 1).

Fig. 1 – Árvore Bayesiana (baseada em sequências plastidias matK, rps16, trnDT, trnL e ycf6 e nuclear ITS) mostrando as relações filogenéticas das espécies de Caesalpinia sensu lato. Números nos ramos indicam probabilidade a posteriori. A distribuição geográfica está representada em vermelho (Nordeste do Brasil), azul (Mesoamérica) e verde (Andina).

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Distribuição de heterocromatina Todas as espécies de Caesalpinia s.l. analisadas apresentaram 2n = 24, com cromossomos medindo de 1,4 até 5,1 μm. Os cariótipos foram formados por cromossomos meta/submetacêntricos ou acrocêntricos (em alguns casos confundidos com submetacêntricos pela distensão de um satélite observado nos braços curtos), com a fórmula cariotípicada maioria das espécies n = 12 (8M/SM + 4A). Os idiogramas da Fig. 2 resumem nossos resultados. Em Libidibia ferrea foram observados indivíduos poliploides com 2n = 4x = 48 e 2n = 6x = 72 e em algumas espécies foi observado mixoploidia, com células diploides e tetraploides no mesmo tecido (Fig. Suplementar 1).

26 Fig. 2–Idiogramas das espécies de Caesalpinia sensu lato mostrando o tamanho cromossômico (T), razão de braços (RB), bandas CMA+/DAPI (amarelo) e CMA0/DAPI (amarelo tracejado), DNAr 5S (vermelho) e CMA+/DAPI co-localizadas com sítios de DNAr 45S (verde). A ordem cromossômica (OC) foi definida de acordo com o tamanho do braço curto. Para C. bonduc (Guilandina) é apresentado um idiograma esquemático ilustrando a posição da heterocromatina.

As análises de dupla coloração com os fluorocromos CMA e DAPI revelaram bandas CMA+/DAPI no braço curto dos cromossomos acrocêntricos em todas as espécies analisadas. Adicionalmente foi observada heterocromatina proximal, de tamanho e intensidade variável, na maioria destas (Fig. 3). Bandas CMA+/DAPI foram localizadas nas espécies dos clados Guilandina (Fig. 3a), Echinata (Fig. 3b), Poincianella (Fig. 3e-h), Libidibia (Fig. 3i) e Balsamocarpon (Fig. 3j). Por outro lado, as espécies dos clados Arquita (Fig. 4a, b) e Erythrostemon (Fig. 4c, d, f e g) apresentaram heterocromatina proximal CMA0/DAPI que aparece na sobreposição como uma banda de intensidade mais fraca (Figs. 3 e 5). As únicas espécies que não apresentaram heterocromatina proximal foram o clado Caesalpinia sensu stricto (C. pulcherrima+C. pumila) (Fig. 3c, d), C. gilliesii e C. hughesii (Fig. 4e, h). Todas essas apresentaram bandas CMA+/DAPIterminais em número variável (Figs. 2, 3 e 4).

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Fig. 3–Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) no complemento cromossômico de espécies do gênero Caesalpinia sensu lato. Espécies dos clados Guilandina: C. bonduc (a); Echinata: C. echinata (b); Caesalpinia sensu strictu: C. pulcherrima (c) e C. pumila (d); Poincianella: P. bracteosa (e), P. microphylla (f), P. pluviosa (g) e P. pyramidalis (h); Libidibia: L. ferrea (i); Balsamocarpon: B. brevifolium (j). Barra em j representa 10 μm.

Fig. 4 – Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) no complemento cromossômico de espécies do gênero Caesalpinia sensu lato. Espécies dos clados Arquita: A. trichocarpa (a) e C.

28 mimosifolia (b); Erythrostemon: C. exilifoia (c), C. angulata (d), C. gilliesii (e), C. coulterioides (f), C. coluteifolia (g) e C. hughesii (h). Barra em h representa 10 μm.

Fig. 5 – Distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) ilustrando bandas dos tipos CMA+/DAPI (Libidibia ferrea) e CMA0/DAPI (Caesalpinia mimosifolia).

Hibridização in situ

A FISH revelou apenas um par de DNAr 5S em todas as espécies analisadas (Fig. 6), exceto em C. mimosifolia que apresentou sítios em dois pares cromossômicos (Fig.6a). Os sítios de 5S estavam localizados nas regiões intersticiais ou terminais dos cromossomos metacêntricos (L. ferrea, C. mimosifolia [par III], A. trichocarpa, C. hughesii, C. exilifolia, C. coluteifolia, C. coulterioides e C. echinata) ou acrocêntricos (C. pulcherrima, P. pyramidalis, P. bracteosa e C. mimosifolia [par X]) (Figs. 2 e 6). As bandas CMA+/DAPIdos braços curtos de todos os cromossomos acrocêntricos foram sempre co-localizadas com sítios de DNAr 45S (Fig. 6). Sítios de 45S extras foram observados na região terminal de um par metacêntrico em C. pulcherrima (Fig. 6j) e C. coluteifolia (Fig. 6d) e em três pares de C. exilifoia (Fig. 6f), sempre co-localizados com bandas CMA+.

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Fig. 6 – Hibridização in situ revelando a distribuição de sítios de DNAr 5S (vermelho) e 45S (verde) em espécies do gênero Caesalpinia sensu lato. a, C. mimosifolia; b, A. trichocarpa; c, C. coulterioides ; d, C. coluteifolia; e, C. echinata; f, C. exilifoia; g, L. ferrea; h, C. hughesii; i, P. bracteosa; j, C. pulcherrima; k, P. pyramidalis. Insertos em a, c, d e k mostram pequenos sítios de DNAr ampliados e contrastados. Setas apontam para os menores sítios de DNAr 5S. Barra em k representa 10 μm.

A técnica de cGISH foi realizada em três espécies do Nordeste, pertencentes aos clados Echinata (C. echinata), Libidibia (L. ferrea) e Poincianella (P. pyramidalis), visando checar a homologia entre os genomas dessas espécies. Quando as sondas genômicas foram hibridizadas em metáfases das próprias espécies (controle positivo) ocorreu forte marcação nas bandas heterocromáticas (Fig. 7a-c). Foram então realizadas hibridizações cruzadas com todas as combinações possíveis, cujo resultado foi a ausência de marcação na heterocromatina proximal, com sinais positivos apenas nos sítios de DNAr 45S (Fig. 7d-f). Esse resultado demonstra a ausência de homologia entre esses genomas, sugerindo que as linhagens Echinata, Libidibia e Poincianella possuam genomas exclusivos.

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Fig. 7 – Hibridização genômica comparativa (cGISH) em espécies Nordestinas de Caesalpinia sensu lato. Cromossomos metafásicos de C. echinata (a, e), L. ferrea (b, f), P. pyramidalis (c, d). Primeira linha (ac) revelam as hibridizações controle, enquanto na segunda linha (d-f) hibridizações cruzadas. Barra em f representa 10 μm.

Discussão

Nossos resultados, mostrando monofiletismo para Caesalpinia s.l. e sua subdivisão em subclados (Arquita, Balsamocarpon, Caesalpinia sensu stricto, Echinata, Erythrostemon, Guilandina, Libidibia e Poincianella) corrobora filogenias anteriores (Gagnon et al., 2013; 2015). Os dados revelaram um não-conservadorismo da distribuição geográfica, com os três centros de diversidade Neotropical (Andino, Nordeste do Brasil e Mesoamericano) sendo não-monofiléticos (Fig.1). As espécies do Nordeste do Brasil, por exemplo, estão distribuídas em três grupos não relacionados (Echinata, Libidibia e Poincianella). Isso reforça o papel da dispersão à longa distância na biogeografia do grupo, caracterizado por distribuições disjuntas, conforme observado em Hoffmannseggia (Simpson et al., 2005) e Pomaria (Simpson et al., 2006). Os resultados obtidos confirmam a estabilidade cariotípica numérica descrita para o gênero (Beltrão e Guerra, 1990; Rodrigues et al., 2013), com poliploidia restrita a Libidibia ferrea (Beltrão e Guerra, 1990; Borges et al., 2012). Nesses poliploides a presença de múltiplos exatos das bandas heterocromáticas e sítios de DNAr em relação

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ao diploide sugere que se tratem de autopoliploides, corroborando dados de morfologia e biologia floral (Borges et al., 2012). Caesalpinia sensu lato apresentou uma grande diversidade heterocromática, como é observado em outros grupos de plantas com cromossomos pequenos e numericamente estáveis (Almeida et al., 2007; Barros e Silva et al., 2010a; Moreno et al., 2015). Isso é evidenciado pela presença de dois padrões distintos de heterocromatina proximal (CMA+/DAPI− e CMA0/DAPI−) e pela variabilidade na quantidade de heterocromatina por cariótipo (Tabela 1). Dessa forma, sugere-se que a heterocromatina rica em GC presente no grupo é amplamente dinâmica e sofre amplificações/desamplificações frequentes, assim como reportado para outros grupos de plantas (Mendes et al., 2011; Fonsêca et al., 2013). Uma vez que a maior parte da fração repetitiva dos genomas é formada por elementos transponíveis e/ou DNA repetitivo em tandem (Heslop-Harrison e Schwarzacher, 2011), diferentes mecanismos como crossing-over desigual, transposição de elementos móveis ou recombinação ectópica (Raskina et al., 2004; Amheim et al., 1980) podem explicar a diversidade heterocromática observada. Nossos dados sugerem que a heterocromatina proximal em Caesalpinia s.l. evolui de forma não aleatória. A presença de bandas CMA+/DAPI− é uma condição plesiomórfica, ocorrente nos clados Balsamocarpon, Echinata, Guilandina, Libidibia e Poincianella (Fig. 8). Nesse sentido as bandas CMA0/DAPI− são uma condição derivada, presente exclusivamente em espécies de Arquita e Erythrostemon. A perda de heterocromatina proximal se deu de forma homoplásica em C. hughesii, C. gilliesii e no clado Caesalpinia sensu stricto. Curiosamente essa perda foi correlacionada com o surgimento de heterocromatina CMA+ terminal nessas espécies (Fig. 8). Esses padrões de distribuição de heterocromatina são ainda congruentes com a distribuição geográfica das espécies, geralmente sendo observados cariótipos similares em espécies de um mesmo centro de diversidade. Isso pode ser evidenciado pela ausência da heterocromatina proximal nas espécies Mesoamericanas e pela presença de bandas CMA0 nas espécies Andinas. Tendo em vista o não-monofiletismo desses centros de diversidade (ver Discussão acima), nossos dados sugerem que a variabilidade heterocromática pode estar sendo influenciada pelas condições ambientais. Se sabe que alguns polimorfismos cromossômicos, como poliploidia (Majure et al., 2012), cromossomos B (Lia et al., 2007) ou DNAr (Raskina et al., 2004; Souza et al., 2015)

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parecem associados com adaptabilidade ou padrões particulares de distribuição geográfica. Entretanto a relação entre o cariótipo e o ambiente ainda não é clara, com poucos estudos demonstrando essa associação (Pasco, 2006).

Fig. 8 – Reconstrução de estados ancestrais dos padrões de bandeamento CMA e DAPI observados em Caesalpinia sensu lato. O modelo de reconstrução foi máxima verossimilhança com parâmetro Markov (Mk1) no software Mesquite.

O resultado da cGISH revelou que as bandas CMA+ proximais presentes nas espécies do Nordeste do Brasil são homoplásicas. Esse resultado corrobora com a filogenia molecular, uma vez que as espécies pertencem a três grupos distintos (Echinata, Libidibia e Poincianella). A técnica de cGISH apresenta elevada sensibilidade na detecção de proximidade evolutiva, apresentando em geral uma alta

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congruência com as árvores filogenéticas (Zhao et al., 2013; She et al., 2015). Se tratando de genomas diferentes, a aparente similaridade cariotípica entre C. echinata, L. ferrea e P. pyramidalis revelada pelo bandeamento CMA/DAPI pode dar uma falsa ideia de proximidade evolutiva. Resultados similares foram obtidos por Barros e Silva et al. (2010) na análise comparativa da heterocromatina entre Citrus e gêneros relacionados. Ao contrário da heterocromatina, os sítios de DNAr apresentaram mais estabilidade nas espécies de Caesalpinia s.l. A presença de apenas um par de sítios de DNAr 5S nas espécies analisadas (exceto em C. mimosifolia), reflete uma condição comum em plantas (Roa e Guerra, 2015). Da mesma forma, os sítios de DNAr 45S apresentaram uma forte estabilidade de número e posição. A localização desses sítios no braço curto dos acrocêntricos é muito frequente (Roa e Guerra, 2012). A presença de sítios de DNAr 45S em cromossomos metacêntricos foi uma condição rara (apenas em C. coluteifolia, C. exilifoia e C. pulcherrima) e homoplásica no grupo (Fig. 8). Esses sítios extras estavam presentes preferencialmente na região terminal dos metacêntricos, o que pode ter favorecido seu espalhamento pelo genoma dessas espécies (PedrosaHarand et al., 2006). A sintenia dos sítios de DNAr 5S e 45S, observada em C. mimosifolia, C. pulcherrima, P. pyramidalis e P. bracteosa, também se mostrou uma condição homoplásica (Fig. 8). Entretanto uma melhor amostragem do clado Poincianella pode revelar se essa característica é compartilhada por todas as espécies desse grupo.

Conclusão

Caesalpinia s.l. é um grupo que possui filogenia bem resolvida, com um forte suporte para a maioria dos subclados. As espécies desse grupo possuem distribuição geográfica não relacionada com a filogenia, o que sugere que os eventos de dispersão à longa distância tenham um importante papel na biogeografia do grupo. A estabilidade cariotípica numérica é contraposta por uma grande diversificação heterocromática, sugerindo que a heterocromatina proximal CMA+ seja altamente dinâmica, com eventos de amplificação/desamplificação dessa fração repetitiva do genoma. Nossos dados apontam que essa heterocromatina evolui de forma não aleatória, sendo altamente correlacionado com a distribuição geográfica das espécies e indicando que o ambiente possa desempenhar algum papel na fixação desses cariótipos. A não-homologia dos

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genomas das três espécies do Nordeste do Brasil (C. echinata, L. ferrea e P. pyramidalis), revelado por cGISH, indica que a aparente similaridade cariotípica mostrada pelo bandeamento CMA/DAPI constitui uma homoplasia e pode dar uma falsa ideia de proximidade evolutiva. Ao contrário da heterocromatina, os sítios de DNAr apresentaram mais estabilidade nas espécies do grupo. Nossos dados sugerem que a interpretação dos caracteres cariotípicos em Caesalpinia s.l. é complexa, dado o número de homoplasias nos padrões de bandas heterocromáticas e sítios de DNAr, e precisa ser examinado com cautela e em um contexto filogenético.

Agradecimentos Os autores agradecem à bolsa de Iniciação Cientifica de Van-Lume B. concedida pela UFPE e Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco (FACEPE). Além disso, agradecem a Leonardo Felix, Marcelo Guerra e Laís Borges pela coleta de espécies analisadas nesse artigo.

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Fig. Suplementar 1 – Poliploidia em Libidibia ferrea (a-c) e mixoploidia em Balsamocarpon brevifolium (d). Citótipo tetraploide (a, b) e hexaploide (c) de L. ferrea revelando a distribuição de heterocromatina CMA (amarelo) e DAPI (azul) e sítios de DNAr 45S (verde) e 5S (vermelho). Setas apontam sítios de DNAr 5S. Barras em a e d representam10 m.

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Tabela 1–Lista de espécies de Caesalpinia sensu lato com distribuição geográfica (http://www.gbif.org), número cromossômico (2n), tamanho do complemento haploide, quantidade e tipo de heterocromatina e número de sítios de DNAr. Tamanho do Clado

Espécie

Distribuição

2n

complemento haploide (m)

DNAr* Heterocromatina

Heterocromatina

(%)

proximal 5S

45S

Arquita trichocarpa(Griseb.) Gagnon, Arquita

Balsamocarpon

G.P.Lewis & C.E.Hughes

Andina

24

31,8

62,5

CMA0/DAPI

1M

4A

Caesalpinia mimosifolia Griseb.

Andina

24

32,3

54,7

CMA0/DAPI

1M + 1A

4A

Balsamocarpon brevifolium Clos.

Andina

24

27,5

59,0

CMA+/DAPI

-

-

(cultivada)

24

40,5

11,6

0

1A

1M + 4A

F.J.Herm.

Mesoamericana

24

27,9

38,5

0

-

-

Caesalpinia echinata Lam.

Nordeste do Brasil

24

31,5

40,8

CMA+/DAPI

1M

4A

Andina

24

22,4

52,9

CMA0/DAPI

-

-

1M

1M + 4A

1M

-

1M

3M + 4A

-

-

Mesoamericana Caesalpinia

Caesalpinia pulcherrima (L.) Sw.

sensu strictu

Caesalpinia pumila (Britton & Rose)

Echinata

Caesalpinia angulata (Hook. & Arn.) Baill. Caesalpinia coluteifolia Griseb. Erythrostemon

Caesalpinia coulterioides Griseb.

Andina Andina

Caesalpinia exilifolia Griseb.

Andina

Caesalpinia gilliesii (Hook.) Wall. ex

Mesoamericana

Benth.

(cultivada)

24 24

40,3 40,4

58,2

0

CMA /DAPI



48,9

0

CMA /DAPI



0



24

33,0

42,3

CMA /DAPI

24

36,3

38,4

0

41

Guilandina

Caesalpinia hughesii G.P.Lewis

Mesoamericana

24

34,2

31,2

0

1M

4A

Caesalpinia bonduc (L.) Roxb.

Cosmopolita

24

-

-

-

-

-

Nordeste do Brasil

24

23,0

27,8

CMA+/DAPI

1M

4A

Poincianella bracteosa (Tul.) L.P.Queiroz Nordeste do Brasil

24

25,1

33,2

CMA+/DAPI

1A

4A

24

25,7

38,8

CMA+/DAPI

-

-

-

-

1A

4A

Libidibia ferrea (Mart. ex Tul.) Libidibia

L.P.Queiroz

Poincianella microphylla (Mart. ex G.Don) L.P.Queiroz

Nordeste do Brasil

Poincianella

Poincianella pluviosa (DC.) L.P.Queiroz

+



Nordeste do Brasil

24

33,3

33,2

CMA /DAPI

Nordeste do Brasil

24

34,4

37,5

CMA+/DAPI

Poincianella pyramidalis (Tul.) L.P.Queiroz * M = metacêntrico; A = acrocêntrico.