Teorico Contaminantes_CyC_la plata

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27/03/2019

Curso teórico-práctico sobre control de contaminantes 23 de Marzo de 2019

Diego Libkind y Martín Moliné INFO CURSOS: cursosmicro@comahue‐conicet.gob.ar Pagina FB: https://www.facebook.com/JCYTCerveza/ www.ipatec.conicet.gob.ar

Laboratorio de Microbiologia Aplicada, Biotecnología y Bioinformática de Levaduras (MABBlev)

INSTITUTO ANDINO PATAGONICO DE TECNOLOGIAS BIOLOGICAS Y GEOAMBIENTALES

¿Por qué están Uds. acá?

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Cronología Cervecera

Levadura LAGER ALE

LAGER

LAGERS: 95%

Limpieza y sanitización

Otros MO

Otros MO

Lambicas, sourbeer… contaminantes

¿Qué vamos a ver hoy? - Contra quién luchamos?: bacterias y hongos contaminantes de la cerveza

- Detección: cultivo o no cultivo?. Identificación. Futuro…

- Laboratorio cervecero para control de calidad microbiológica

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La cerveza es el resultado de un proceso biotecnológico

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Es primariamente un  MONOCULTIVO donde el  ÚNICO microorganismo que  debería estar es la levadura  inoculada.

Del cual surge un producto con condiciones microbiológicamente particulares contiene etanol (hasta 10 % v/v) sustancias antibacterianas (α‐ácidos del lúpulo) alto contenido CO2 bajo pH (3.8–4.7) bajo contenido de O2 pobre en nutrientes

Un contaminante de cerveza debe  resistir y desarrollarse en estas  condiciones extremas

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Microorganismos contaminantes/deteriorantes de la cerveza Cloramfenicol Tetraciclina

Bacterias

vs.

Levaduras Cicloheximida (o Actidiona)

Poseen cientos de diferencias celulares

Ambos grupos pueden colonizar y arruinar la cerveza

Levaduras Levaduras

Los Hongos

Cuando son  unicelulares Grupo de organismos  saprófitos muy  importantes por ser  descomponedores

Unicelular (1 célula = 1 individuo)

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Levaduras • Existen miles de especies Sacaromicéticas (S. diastaticus) y  no sacaromicéticas (Brettanomyces, Cándida)

exceso de turbidez y gas, diacetilo,   fenoles y acetaldehido.

Bacterias Los bacterias

• Existen miles de especies (Lactobacillus, Pediococcus,  Pectinatus, Megasphaera)

Son muy Diversas y Abundantes (1 célula = 1 individuo)

Unicelular turbidez, sedimentos, ácido  sulfhídrico, propiónico,  butírico, capróico, láctico,  acético, diacetilo, entre otros

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Bacterias

Sensibles a los iso alfa‐ácidos No son sensibles a los iso alfa‐ácidos

¿De Dónde Provienen los Contaminantes? Están en todas partes

Pediococcus damnosus

Saccharomyces cerevisiae

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¿De Dónde Provienen los Contaminantes?

Los microorganismos de la Cebada Principalmente bacterias, seguidas por levaduras y hongos filamentosos.

Fusarium graminearum

Produce deoxinivalenol (DON, vomitoxina)

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23% de las muestras exhibieron DON con a un promedio de 2,36 ug/g, con 44% excediendo los limites máximos (promedio 5.24 ug/g); 29% contenían NIV (promedio 2.36 ug/g); 7% contenían DON y NIV.

Los microorganismos del Mosto Durante la maceración reducimos la cantidad de microorganismos

Quedan bacterias termofilas (Lactobacillus)

Ayudan a ácidificar y mejoran la extracción

Sin embargo… Clostridium sp. Ácido butírico (Queso) Bacillus sp. Nitrosaminas

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Los microorganismos del Mosto Durante la cocción se “esteriliza” el mosto y se generan los iso-alfa ácidos del lúpulo Una vez frío es un ambiente rico en nutrientes disponible…

Enterobacterias oportunistas Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter, Obesumbacterium, y Escherichia

No las afecta el  lúpulo pero sí son sensibles al pH  bajo y al alcohol!

DMS, ácidos orgánicos, 2,3-butanodiol (aroma frutado-vegetal)

Bacterias Gram Negativas Enterobacterias

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Los microorganismos de la Cerveza Una vez que inoculamos con la levadura, las condiciones para las bacterias se volverán desfavorables

contiene etanol (hasta 10 % v/v) sustancias antibacterianas (iso α‐ácidos del lúpulo) alto contenido CO2 bajo pH (3.8–4.7) bajo contenido de O2 pobre en nutrientes

Sin embargo las bacterias de los géneros Lactobacillus y Pediococcus (LAB) pueden amenazar nuestro producto (tienen alta prevalencia)

Ácidificación Diacetilo Exopolisacaridos Aminas Biol. Activas

Alergias, intoxicaciones

Bacterias Gram +

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Porcentaje de microorganismos deteriorantes de la cerveza en incidentes reportados entre 2010 y 2013.

60-90% indicencia Lactobacillus + Pediococcus L. brevis se reporta como la LAB más frecuente durante la fermentación, maduración y en cerveza terminada

Acidez, diacetilo

Lactobacillus/Pediococcus

Acidez, turbidez, sedimento

Deteriorantes

Domesticada!!

Resistentes a los iso‐alfa ácidos del lúpulo

Evidencias de domesticación L. brevis Resistentes a desinfectantes y a la pasteurización (formación de cápsulas extracelulares) Utilizan dextrinas Resistentes a los iso-alfa ácidos L. lindneri

Causan sedimento,  turbidez, ropiness superatenuación

Resistente a los iso-alfa ácidos del lúpulo

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Los microorganismos más allá de la cerveza Incluso aunque hayamos hecho todo bien….

Existen múltiples superficies donde pueden formarse biofilms bacterianos

Es importante siempre limpiar

TODO

Bacterias Gram -

Anaerobios: Pectinatus, Megasphaera, Zymophilus y Selenomonas, principales en cerveza no pasteurizada Aerobias y anaerobias facultativas: AAB: Acetobacter y Gluconobacter, Zymomonas y algunas Enterobacteriaceae

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Bacterias

Anaerobias

Gram Negativas Eventos de  deterioro de  cerveza 2‐7%

20‐30%

Bacterias

Aerobias y Anaerobias facultativas

Gram Negativas

AAB Resisten a los iso-alfa ácidos y al alcohol, pero necesitan O2. Comunes en dispensers y barriles y refermentaciones

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Levaduras contaminantes Existen miles de especies No fermentadoras

Fermentadoras

Sacaromicéticas: S. cerevisiae, S. mikatae, S. bayanus no sacaromicéticas: Brettanomyces, Candida, Pichia, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces, Torulaspora, Zygosaccharomyces Diferentes formas, estructuras sexuales, agregados

exceso de turbidez y gas, diacetilo, esteres, fenoles (POF), act. diastática y acetaldehído. POF1

p-coumaric  4-vinyl phenol Ferulic acid  4 vinyl guaiacol

4-ethyl guaiacol 4-ethyl phenol Isovaleric acid

¿Por qué limpiar todo a veces (parece que) no alcanza?

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DETECTANDO DÓNDE ESTA EL PROBLEMA

Técnicas de monitoreo rápidas

 Medición de ATP/NADH/NADPH  PCR (EP‐PCR, qPCR)  DEFT (Direct Epifluorescence Filter Technique)/AbDEFT/OligoDEFT. COBRA/Citómetro  In situ hybridization (FISH, Hybriscan). VIT®‐beer (Vermicon)  MALDI‐TOF MS

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Monitoreo de ATP por luminiscencia

Esencialmente para control de Limpieza

Bioluminiscencia

Se puede medir

Chequeo de tanques en al menos tres sitios, chequeo en zonas de conflicto

Hygiena

Sensibilidad/reproducibilidad/durabilidad/precio bioluminómetro e insumos/compatibilidad

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Monitoreo en base a medios de cultivo

formulación y características

Un Medio de Cultivo es: Una preparación (líquida o sólida) utilizada para cultivar, transportar o conservar  microorganismos Objetivo: Intentar poner en  evidencia la  presencia de  bacterias y/o  levaduras  diferentes de la  levadura  cervecera Nos permiten estudiar a los microorganismos,  identificarlos y caracterizarlos. Control de calidad de los ingredientes/proceso

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Los Medios de Cultivo pueden ser muy sencillos…

Robert Koch

….o muy elaborados! Yeast Nitrogen Base (YNB)

dextrose (20g/L) ammonium sulfate (5g/L), Potassium phosphate (1000 mg/L) Inositol (2 mg/L) Copper sulfate (0.04 mg/L) Magnesium sulfate (500 mg/L) Niacin (0.4 mg/L) Potassium iodide (0.1 mg/L) Sodium chloride (100 mg/L) PABA (0.2 mg/L) Iron (III) chloride (0.2 mg/L) Calcium chloride (100 mg/L) Pyridoxine (0.4 mg/L) Manganese sulfate (0.4 mg/L) Biotin (0.002 mg/L) Riboflavin (0.2 mg/L) Sodium molybdate (0.2 mg/L) Pantothenate, calcium (0.4 mg/L) Thiamine (0.4 mg/L) Zinc sulfate (0.4 mg/L) Folic acid (0.002 mg/L) Boric acid (0.5 mg/L)

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Por eso clasificamos los medios de cultivo según su composición Medios  Complejos

Aquellos que no  sabemos  exactamente que  contienen en su  composición

Medios Sintéticos  o Definidos

Lo que más importa  son los CHONPS

Aquellos que  conocemos todos  sus componentes y  las concentraciones  de cada uno de ellos

Para crecer los seres vivos requieren de

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Para crecer los seres vivos requieren de

Representan el 95% del peso  Los micronutrientes y los oligoelementos  representan el otro 5% (potasio, magnesio, hierro, calcio, sodio, manganeso, cobalto, cobre,  molibdeno y zinc)

También clasificamos a los medios de cultivo por su función • Medios No Selectivos (o de uso general):  permiten el crecimiento de un amplio rango  de microorganismos. • Medios Selectivos: Poseen compuestos o sustancias que permiten el desarrollo de ciertos microorganismos pero no otros. • Medios Diferenciales: Poseen sustancias que al combinarse con algún producto  especifico del metabolismo microbiano permite diferenciarlo de otros.

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Sí son muchas cosas a Considerar…. …. Pero lo más difícil ya esta hecho Existen medios de cultivos específicos para bacterias y levaduras contaminantes de cerveza

Lo que queda es elegir el medio adecuado y seguir correctamente las instrucciones

Medio de Cultivo general para microorganismos de la Cerveza

crecimiento de bacterias,  levaduras salvajes y levadura  cervecera

AGAR MOSTO Permite conservar levaduras

Con cicloheximida:  crecimiento sólo de  bacterias (SELECTIVO)

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Medios de Cultivo para identificar contaminantes de la cerveza Medio

Organismos cultivables

Organismos más frecuentes

UBA (Universal Beer Agar)

Levaduras y Bacterias

Lactobacillus, Pediococcus, Acetobacter Enterobacter, Saccharomyces, etc.

WLN (Wallerstein nutritivo)

Levaduras y Bacterias

Saccharomyces, Brettanomyces, Candida,  Lactobacillus, Acetobacter

WLD (Wallerstein differential)

Bacterias

Lactobacillus, Acetobacter

SDA (Schwarz Differential Agar) 

Bacterias y Levaduras

Bacterias AA, Bacillus, Lactobacilus,  Enterobacter

Bacterias

Lactobacillus, Pediococcus

Levaduras salvajes

Levaduras no‐sacaromicéticas

Levaduras salvajes

Levaduras no‐sacaromicéticas

Levaduras salvajes

Levaduras sacaromicéticas

HLP (Hsu’s Lactobacillus‐ Pediococcus) LCSM (Lin’s Cupric Sulfate  Medium)  Medio Lys LWYM (Lin’s Wild Yeast Medium)

Leer la Hoja técnica

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Medios de Cultivo para identificar contaminantes de la cerveza WLN

cicloheximida

WLD (Wallerstein Diferencial) Selectivo y diferencial

Anaerobiosis (4‐7 días)

Aerobiosis (2‐3 días)

Bacterias ácido acéticas Flavobacterium, Proteus Bacillus

BAL: Lactobacillus y Pediococcus

Medios de Cultivo para identificar contaminantes de la cerveza HLP (Hsu’s Lactobacillus/Pediococcus) selectivo ‐ Anaerobio Pediococcus

Lactobacillus

28‐30 °C (hasta 7 días) 

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Medios de Cultivo para identificar contaminantes de la cerveza LCSM (Lin’s Cupric Sulfate Medium) Yeast extract 0.4 g Malt extract 0.2 g Peptone 0.2 g Dextrose 1.0 g K2HPO4, 0.1 g NH4Cl 0.05 g CuSO4 0.05 g Agar 2 g Agua destilada 100 ml

selectivo Aerobiosis 28˚C 4‐6 días

La levadura cervecera no crece, con excepciones

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¿Qué puedo implementar en mi cervecería? • Análisis sensorial • Análisis físico‐químicos a lo largo del proceso fermentativo y producto final (pH, atenuación) • Test forzado mosto

pH