Introd. Microscopia

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UFCG – CSTR MEDICINA VETERINÁRIA HISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA Prof. Dr. Fernando Borja Introdução à Microscopia O estudo da histologia depende da utilização da microscopia. Na realidade para se conhecer a “anatomia microscópica” dos tecidos e órgãos, incontestemente, necessário se faz o uso do microscópio. Portanto, o aluno de histologia deve necessariamente conhecer os fundamentos básicos da microscopia. Assim sendo, passaremos à descrição mais detalhada de um microscópio óptico (utilizado nos nossos estudos), depois citaremos alguns conceitos ligados à microscopia óptica e finalizando descreveremos outros tipos de microscópicos, além do microscópio óptico. 1. Microscópio óptico Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. No nosso curso de histologia, o aluno trabalhará com um microscópio composto. Partes de um microscópio óptico composto Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas. As partes mecânicas tem uma base que estabiliza o microscópio, uma coluna ou braço que se estende da base para cima, uma platina na qual é colocado o objeto a ser examinado. Um Parafuso Macrométrico usado para fazer a “focalização grossa”. Um Parafuso Micrométrico que realiza movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Um Revólver que é uma estrutura de forma circular adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva. E um Charriot que é um dispositivo preso à platina, destinado a movimentar a lâmina para frente e para trás e para os lados. As partes ópticas estão presas à coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador, diafragma e lâmpada ou espelho. O tubo ou canhão é, por muitos, considerado como parte mecânica, mas o seu comprimento pode influenciar na qualidade do que se está focalizando, assim parece mais razoável considerá-lo como parte óptica. Em muitos microscópios o espelho e a lâmpada estão alojados, com segurança, na base do instrumento. A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à extremidade inferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x dá um aumento total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua

vez está preso à extremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar.

Figura 1. Inscrições contidas numa objetiva de microscópio óptico.

Figura 2. Códigos de cores das lentes objetivas.

O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris. O espelho, nos microscópios mais simples, está situado abaixo do condensador e reflete os raios luminosos emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador pode existir um porta-filtros móvel. Microscópios mais modernos são equipados com uma lâmpada ao invés de um espelho.

Figura 3. Microscópio óptico e suas partes. Como funciona o microscópio óptico O objeto a ser estudado é montado em uma lâmina de vidro, que é colocada na platina do microscópio. O objeto é posto em posição sob a objetiva seja manualmente ou usando a platina mecânica. Faz-se o foco correto do objeto levantando ou abaixando a platina e levantando ou abaixando o tubo do microscópio, ao qual estão atarraxados a ocular e as objetivas. Os raios luminoso aqui são defletidos e convergem para o objeto. Então passam através das lentes da ocular e são novamente defletidos. Emergindo da ocular, os raios luminosos são dirigidos para a pupila do olho, após o que eles incidem sobre a retina. Se o olho está em repouso, como na visão a longa distância, deve-se obter uma clara imagem do objeto quando a objetiva estiver no foco exato. A posição das lentes do microscópio em relação ao objeto pode ser mudada ajustando os focos fino e grosso. A focalização grossa

produz movimentos amplos, enquanto que a fina é um mecanismo delicado que se faz com pequenos movimentos (pequenos e grandes aumentos). Um microscópio óptico composto é, assim, um sistema de aumento em dois estágios. Primeiro o objeto é aumentado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo conjunto de lentes da ocular. O aumento total é o produto dos aumentos da objetiva pelo da ocular. Um microscópio composto produz uma imagem de cabeça para baixo e invertida lateralmente. A inversão é facilmente demonstrada: se o espécie é movido para um lado, a imagem move-se no sentido contrário. Aumento, Definição, Resolução e Profundidade do foco Grandeza (aumento) – é o aumento do tamanho da imagem comparada com o objeto. O aumento total de um microscópio composto, como anteriormente explicado, é o grau de aumento da imagem produzido pelas lentes objetivas multiplicado pelo aumento dado pelas lentes da ocular. Usar sempre uma objetiva de pequeno aumento quando se começar o exame de um preparado; ele lhe permitirá observar um campo mais amplo e é útil para uma visão panorâmica. Definição – é a nitidez da imagem quando o sistema de lente foi corretamente ajustado. A imagem borrada geralmente significa que as lentes foram incorretamente ajustadas ou que elas estão sujas. Outra ocorrência comum é colocar inadvertidamente a lâmina de vidro na platina com o lado errado para cima. Limite de resolução – é a capacidade de um sistema óptico de separar detalhes. Mais precisamente, o limite de resolução é a menor distância que deve existir entre dois pontos para que apareçam individualizados. Por exemplo: duas partículas separadas por 0,3 micrômetros aparecerão individualizadas quando examinadas num sistema de 0,2 micrômetros. Mas, se forem examinadas num sistema com limite resolutivo de 0,5 micrômetros, aparecerão fundidas, como se fossem uma só partícula, de maior tamanho. O limite de resolução das melhores lentes utilizadas nos microscópios ópticos comuns é de 0,2 micrômetros. Portanto o que determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico é seu limite resolutivo e não seu poder de aumentar de tamanho os objetos. A propriedade de aumentar só tem valor prático se for acompanhada de um aumento paralelo do poder resolutivo. O limite resolutivo depende essencialmente da objetiva. A ocular apenas aumenta de tamanho a imagem projetada no seu plano de foco pela objetiva. Uma das características mais importantes de uma objetiva é a sua abertura numérica, pois o limite resolutivo depende principalmente desta e do comprimento de luz utilizada. A abertura numérica vem gravada nas objetivas e sua determinação cabe ao fabricante das lentes. Ela é igual ao menor índice de refração (n) interposto entre o corte e a lente objetiva, multiplicado pelo seno do semi-ângulo de abertura (u). Teremos então: Abertura Numérica (AN) = n x seno de u.

Já o Limite de Resolução da objetiva é dado pela fórmula:

LR = K x Y , AN onde K é uma constante estimada em 0,61 e Y o comprimento de onda. Geralmente tomase o comprimento da onda da faixa verde-amarelo (0,55 micrômetros) para o cálculo do limite resolutivo, por ser o olho humano mais sensível a essas cores do que a quaisquer outras. Então, substituindo-se as letras pelos seus respectivos valores, temos: LR = 0,61 x 0,55 AN A análise da fórmula mostra que o limite de resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional à abertura numérica da objetiva. O exemplo abaixo nos dará a exata compreensão da importância da abertura numérica e também que a utilização de oculares de grande aumento não traz qualquer vantagem. Admitamos as duas seguintes combinações de lentes: A – objetiva de 10x de AN 0,15 com ocular 20x. Aumento de 200x. B – objetiva de 40x de AN 0,65 com ocular 5x. Aumento de 200x. Fazendo-se os cálculos, verifica-se que, no exemplo A, o limite de resolução será de 2,2 micrômetros, enquanto que no exemplo B será muito mais rica em detalhes, pois o seu limite de resolução é de 0,5 micrômetros.

Figura 4. Representação gráfica da abertura numérica (AN): quanto maior a grandeza da objetiva maior, maior sua abertura numérica (AN) e maior o seu ângulo de captura.

Figura 5. Esquema gráfico de como se calcula a abertura numérica (ON).

Profundidade de foco – é a propriedade da lente de revelar estruturas que estão relacionadas uma às outras, mas que se encontra em diferentes níveis no espécime. A profundidade do foco diminui à medida que o poder de aumento e abertura numérica aumentam. 2. Outros tipos de Microscópio Microscópio de contraste de fase Quando um fragmento de tecido não corado é examinado com um microscópio óptico comum, a estrutura minuciosa não pode ser visualizada. A razão disto reside no fato de que os índices de refração dos componentes celulares são muito semelhantes, resultando em falta de contraste. O microscópio de fase é um instrumento que converte diferenças do índice de refração que não podem ser vistas, em diferenças de intensidade que se tornem visíveis.

As ondas de luz que atravessam os componentes celulares de densidades ópticas diferentes assim o farão em diferentes velocidades. Desse modo, as ondas luminosas que atravessam núcleos, mitocôndrias e inclusões celulares emergirão em tempos diferentes e em fases diversas, de um elemento em relação ao outro. Existem aberturas especiais em placas que absorvem e mudam as fases situadas dentro do condensador e das lentes objetivas do microscópio de contraste de fase que convertem

diferenças de fases em intensidade diferentes. O microscópio de fase é particularmente útil no estudo dos tecidos não-corados e de células vivas.

Fig 6. Trajeto da luz em contraste de fase.

Figura 7. Configuração do Microscópio de Contraste de fase.

Foto 1. Imagens fornecidas pelo microscópio óptico (a) e de contraste de fase (b) Microscópio de interferência O microscópio de interferência usa dois feixes de luz, que passam através do espécime. Um feixe passa através do objeto que está sendo estudado, o segundo passa através de um outro, uma área neutra. Os feixes separados são então combinados em uma imagem plana. Devido ao fato de o objeto estudado ter uma densidade óptica maior do que a área neutra, o feixe que o atravessa terá que ser retardado ou interferido em menor extensão do que o feixe que atravessou a área neutra. O grau de interferência pode ser usado para medir o índice de refração, a refração e a massa seca por unidade de área do projeto. Microscópio de polarização Polarização é um fenômeno que ocorre quando a luz passa através de certas substâncias, tais como os cristais, e é dividida, de modo que emergem dois raios luminosos derivados de um só. Essas substâncias tem dois índices de refração que são chamados de birrefrigentes. No microscópio de polarização a luz é polarizada embaixo da platina do microscópio por um prisma de quartzo Nicol chamado polarizador. A luz polarizada passa então através do espécime. Um segundo prisma, chamado analisador, está localizado perto da ocular dentro do tubo do microscópio. Quando a posição dos prismas analisador e polarizador é ajustada, de modo que os feixes luminosos tenham um trajeto paralelo, uma imagem normal pode ser vista através da ocular. Se o analisador é então rodado de modo que o seu eixo fique em ângulo reto com o polarizador, nenhuma luz alcança a ocular e nada pode ser visto. Colocando-se um objeto amorfo (não refrigente) na platina do microscópio, com os prismas na mesma posição em ângulo reto, nada será visto, porque os raios de luz não foram divididos pelo objeto. Porém, se for colocado um objeto cristalino ou birefringente na platina, uma imagem luminosa aparecerá em fundo escuro. Assim a fim de que materiais biológicos alterem a direção da luz polarizada e seja visualizada com luz polarizada, sua estrutura submicroscópica deve ser de moléculas assimétricas orientadas. Fibras musculares, fibras de tecido conjuntivo e gotículas de gordura exibem birrefrigência e tem sido estudadas intensivamente com microscópio de luz polarizada.

Figura 8. Microscópio de polarização

Foto 2. Imagens obtidas por microscopia de polarização.

Microscópio de fluorescência Neste tipo de microscópio a luz ultravioleta é usada para iluminar o espécime. Certas substâncias biológicas permitem luz visível quando absorvem luz ultravioleta e diz-se que existe fluorescência. A imagem observada aparenta ser auto-luminosa. A fluorescência pode ter lugar com compostos que ocorrem naturalmente, tais como a vitamina A. Corantes fluorescentes também podem ser introduzidos no espécime, onde podem combinar-se compostos determinados ou ser acoplados a anticorpos específicos.

Figura 9. Esquema gráfico da microscopia em fluorescência.

Foto 3. Filamentos de actina e microtúbulos (proteínas estruturais) em fibroblastos de rato (1000x), Fluorescência. / Torsten Wittmann, do Scripps Research Institute. Cortesia Nikon Small World.

Figura 10. Microscópio de Fluorescência.

Microscópio Eletrônico de Transmissão O Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) difere do microscópio óptico pelo fato de usar feixe de elétrons em vez de um feixe visível de luz. Uma das grandes desvantagens do microscópio óptico é o longo comprimento da onda da luz que limita o poder de resolução máximo a cerca de 0,2 micrômetro. Uma corrente de elétrons tem um comprimento de onda muito curto e resoluções de 0,2 nanômetros podem ser obtidas com microscópios modernos. No microscópio eletrônico, os elétrons são emitidos por um filamento aquecido de tungstênio chamado catódio. Em virtude de os elétrons serem partículas carregadas que poderiam colidir com moléculas de ar e assim ser absorvidas e defletidas, todo sistema óptico do microscópio eletrônico deve operar no vácuo. O anódio é uma peça metálica com um pequeno furo no centro. Uma diferença de potencial entre e 40 e 100 KV entre o catódio e o anódio acelera os elétrons à medida que eles passam do catódio para o anódio. Atingindo o anódio, muitos elétrons passam através do furo do seu centro para formar um feixe. O feixe de elétrons passa através de uma série de lentes eletromagnéticas iguais às lentes de vidro do microscópio óptico. As lentes eletromagnéticas servem para focalizar o feixe de elétrons e a força do campo magnético produzido pelas lentes pode ser mudada alterando a quantidade de corrente que passa através dos espirais de fio das lentes. Dessa maneira, o condensador focaliza o feixe sobre o objeto. À medida que os elétrons abandonam o preparado, eles são focalizados na lente objetiva e se obtém uma imagem aumentada. A imagem é mais aumentada por uma ou duas lentes projetoras. Em virtude de os feixes de elétrons serem invisíveis ao olho, a imagem é revelada fazendo com que os elétrons ou sejam projetados sobre uma tela fluorescente ou uma película fotográfica. Infelizmente, os feixes de elétrons possuem um poder de penetração muito fraco, de modo que tem que ser feitos cortes muito delgados do espécime (0,02 – 0,1 micrômetros). Devido a sua delgadeza, os cortes têm um contraste muito pequeno; assim eles precisam ser corados com metais pesados que absorvem elétrons (tais como o urânio e o chumbo) para aumentar o contraste. O poder de penetração dos elétrons é aumentado elevando a voltagem de aceleração. É possível agora, com voltagens de aceleração de um milhão de volts, usar cortes mais espessos (1 – 5 micrômetros) e, ao mesmo tempo, obter maior resolução.

Foto 4. Microscópio eletrônico de transmissão Tecnai – G2-20-FEI 2006.

Figura 11. Desenho esquemático de um microscópio eletrônico de transmissão. Microscópio Eletrônico de Varredura O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) examina a superfície do tecido; o feixe de elétrons não atravessa o espécime. Um feixe eletrônico estreito é dirigido sobre a superfície do espécime, varrendo-a de um lado para outro regularmente. Quando o feixe atinge a superfície do espécime esta emite elétrons secundários. Os elétrons secundários são captados por detentores, os quais criam um sinal elétrico, que é projetado em uma tela de televisão. O feixe de varredura, atingindo a superfície, desloca-se em sincronia com o feixe que porduz a imagem no ecran de televisão. Dese modo, uma imagem tridimensional da superfície do espécime pode ser construída no vídeo. Podem obter-se micrografias fotografando a imagem. O tecido é preparado para o MEV primeiro fixando-o e depois por desidratação cuidadosa. A superfície do espécime é então revertida com uma delgada camada de metal, como o ouro, ouro-pálido, ou carbono, para ajudar a dispersão de elétrons.

Foto 5. Microscópio Eletrônico de Varredura JEOL JSM 6360-LV

Figura 12. Esquema comparativo entre microscópio óptico (a), eletrônico de transmissão (b) e de varredura (c).

a b Foto 6. Macrófago visualizado em microscópio de transmissão (a) e de varredura (b).