Testes in vitro e in vivo (ISO 10993)

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS CAMPUS ZEFERINO VAZ FACULDADE DE ENGENHARIA MECÂNICA

ENSAIOS “IN VITRO” E “IN VIVO” (ISO 10993)

CAROLINI SILVA BRANDOLISE LUANA CALDEIRA ARAÚJO

Trabalho apresentado para a disciplina de Introdução aos Biomateriais Prof. Dr. Éder Sócrates Najar Lopes

CAMPINAS 2018

1. INTRODUÇÃO Quando tratamos de biomateriais, um dos conceitos mais aceitos foi o dado por Williams (1987, apud TEMENOFF; MIKOS, 2008) como “um material destinado a interagir com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir qualquer órgão de tecido ou função do corpo”. A interação entre o biomaterial e tecido necessita ser compatível entre as partes. A biocompatibilidade é um requisito em biomateriais, e foi definida como “a capacidade de um material desempenhar uma resposta apropriada no receptor, em uma aplicação especifica” por Williams (1987), citado por TEMENOFF; MIKOS, (2008). Para um biomaterial ser aplicado clinicamente, é necessário que, após o desenvolvimento consolidado de suas propriedades química e física em escala laboratorial, sejam realizados ensaios in vitro e in vivo a fim de garantir que o dispositivo produzido não possui respostas adversas ao corpo humano quando estiver em contato, tanto direto quanto indireto com o mesmo. Uma norma se faz necessária para capacitar um biomaterial a ser produzido em escala industrial e aplicado clinicamente, como a ISO 10993. Esta norma é dividida em uma série de padrões de avaliações dos dispositivos médicos. O gerenciamento de riscos para avaliações de biocompatibilidade ocorre em uma sequência de etapas. Geralmente avaliando os componentes do dispositivo, os processos de manufatura, e a utilização clínica do dispositivo, como a localização anatômica pretendida, a frequência e a duração da exposição. Para uma avaliação confiável utiliza-se o dispositivo acabado. Não sendo apenas avaliados os materiais usados no dispositivo, mas também o processamento desses materiais, os métodos de fabricação (incluindo o processo de esterilização) e quaisquer resíduos das ferramentas de fabricação usadas durante o processo. Os riscos potenciais de biocompatibilidade incluem adversidades químicas e físicas, como toxicidade, problemas nas propriedades da superfície do dispositivo, geometria do mesmo, forças mecânicas, eletromagnéticas e térmicas no tecido hospedeiro ou partículas residuais. Recomenda-se que antes da realização dos ensaios in vivo todas as informações disponíveis sejam consideradas, como as presentes na literatura e outras publicações disponíveis, experiências clínica e de estudos em animais, os padrões necessários para cada dispositivo médico. Segundo a norma ISO 10993-1, os ensaios específicos necessários a serem realizados são baseados na natureza do tecido em que o implante ficará em contato, se este será a curto ou longo prazo e qual a resposta biológica do mesmo nas respostas do tecido hospedeiro. Os testes a serem realizados analisam propriedades como: citototixidade, sensibilização, hemocompatibilidade, pirogenicidade, implantação, genotoxicidade, carcinogenicidade, toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento e análise de degradação.

2. ENSAIOS ESPECÍFICOS: a. Citotoxicidade A citotoxicidade in vitro é normalmente o ensaio realizado precedente aos demais. Seu objetivo é testar a biocompatibilidade de biomaterial. Os testes de citotoxicidade in vitro são realizados por contato direto ou indireto entre o material a ser avaliado com a cultura de células de mamífero, e posteriormente a verificação das alterações celulares ocorridas no sistema. O parâmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade é a viabilidade celular. Utilizando corantes vitais, que além de serem solúveis em água, passam através da membrana celular, concentrando-se nos lisossomos, fixando-se por ligações eletrostáticas hidrofóbicas em sítios aniônicos na matriz lisossomal. Então são utilizadas substâncias que danificam as membranas, resultando no decréscimo de captura e ligação do corante. Portanto é possível distinguir entre células vivas e danificadas ou mortas, pela medida de intensidade de cor da cultura celular (ROGERO, S. O. et al., 2003). Existem dois métodos de realizar a citotoxicidade, por contato direto ou indireto. O método de contato direto, o material e as células são colocados juntos no mesmo recipiente com nutrientes necessários para as células. Enquanto o contato indireto, o material é colocado em um recipiente e as células cultivadas em outro. A norma ISO 10933-5 recomenda que o líquido promotor das extrações possua um veículo, que em caso de células animais podem ser meio de cultura com soro, solução salina ou outro veículo adequado, contanto que permita a extração tanto polar quanto não polar. A temperatura das extrações preferencialmente devem ser a 37°C entre 24 a 72 horas. De acordo com a ISO 10993-12, a extração deve ser realizada em recipientes estéreis, quimicamente inertes e fechados. Em caso de novos materiais, recomenda-se que a citotoxidade seja realizada no método de contato direto e também eluição. Em casos de materiais que são inerentemente citotóxicos, testes adicionais usando várias diluições da solução de teste podem ser necessários para determinar o nível no qual a citotoxicidade não ocorre mais. Esta informação pode ser avaliada em relação à dose clínica, bem como outros fatores atenuantes, como a duração do contato e a necessidade clínica. Já para os casos de produtos contendo conhecidos agentes citostático ou citotóxico, ou resinas poliméricas não curadas, podem ser necessários testes de citotoxicidade comparativos usando um dispositivo médico legalmente comercializados. A fim de demonstrar que o novo dispositivo não é mais citotóxico que o dispositivo comparativo com o mesmo tipo e duração do contato. b. Sensibilização Em casos de sensibilização, os testes são realizados in vivo normalmente são: o Teste de Maximização de cobaias e o Ensaio de Nódulos Linfáticos Locais, por serem mais eficientes. Além desses, o método de Buehler pode ser usado apenas para dispositivos tópicos, ou seja, aqueles em contato com a pele.

No caso do Teste de maximização de cobaias os ensaios são realizados na pele das mesmas, aplicando 0,1 ml de injeções intradérmicas. Para pós ou líquidos, no mínimo de dez animais devem ser utilizados como amostras de ensaio e um mínimo de cinco animais deve ser do grupo de controle. Para extratos, cinco animais devem atuar como grupo de controle do solvente. Se utilizado controles positivos, estes animais devem ser testados periodicamente. Após (7 ± 1) dias da fase de indução intradérmica, administra-se a amostra de teste por aplicação tópica na região intrascapular de cada animal, utilizando uma área de aproximadamente 8 cm2 de modo a cobrir os locais de injeção intradérmica. Remove-se os curativos e adesivos após (48 ± 2) horas. As cobaias devem ser albinas jovens-adultas, saudáveis, de ambos os sexos, mesma genealogia, não sendo parentes próximos, pesando de 300 a 500 gramas. Em caso de fêmeas, elas devem ser nulíparas e não grávidas. No caso de Ensaio de Nódulos Linfáticos Locais, segundo o prevê a ISO 10933-10, a amostra deve ser um líquido, suspensão, gel ou pasta, que será aplicada nas orelhas dos ratos. A amostra apropriada deve ser aplicada no lado dorsal de ambas as orelhas dos ratos designados, numa dose de 25 µl / d por três dias consecutivos. A cada dia, deve-se observar em busca de sinais de irritação que possam interferir na interpretação de resultados. Após o tratamento tópico de uma amostra de teste no dorso das orelhas, a extensão da proliferação de linfócitos é medida nos gânglios linfáticos que drenam os locais de aplicação. Os animais devem ser ratos fêmeas da linhagem CBA/Ca ou CBA/J ou camundongos machos com sensibilidade compatível aos ratos fêmeas, as linhagens de camundongos consideradas aceitáveis são DBA / 2, B6C3F1 e BALB / c. Os animais devem estar sem gestação e com oito a doze semanas de idade, no caso dos camundongos, em cada estudo devem ser pareados em idade (dentro de uma faixa etária de uma semana). Os pesos corporais individuais devem ser registrados no início e no final do estudo. A fim de detectar a toxicidade potencial da amostra, a observação clínica deve ser realizada e registrada durante o estudo. Quando o teste é realizado em grupo, um mínimo de quatro ratos deve-se ser utilizado. Para produtos químicos, o LLNA é geralmente realizado de maneira dose-resposta. Para dispositivos médicos, as amostras a serem testadas podem ser extratos, certificando-se que o veículo utilizado em tal extrato não interfira nos resultados finais do ensaio. As células em proliferação nos gânglios linfáticos podem ser marcadas por um marcador radioativo ou não radioativo. Os marcadores radioativos normalmente utilizados são [metil-3H]-Timidina e125Iiododeoxiuridina, enquanto que o flourescente pode ser utilizada fluorodesoxiuridina e outras alternativas ainda são, o ensaio de Imunoadsorção Enzimática Ligada a 2-Bromodesoxiuridina (BrdUELISA) ou o teste Daicel Adenosina Trifosfato (DA). Para obtenção dos resultados são sacrificados os ratos e removidos o linfonodo auricular drenante. Para a preparação de células individuais pressiona-se suavemente os gânglios linfáticos através de uma rede de arame de aço inoxidável de 200 µm ou malha de nylon. As células preparadas são lavadas duas

vezes por centrifugação e ressuspensas em PBS, então precipitadas com ácido tricloroacético a 5% (TCA) a (4 ± 2) ° C durante (18 ± 1) h. Após uma centrifugação final, os pellets são ressuspendidos em 1 ml de TCA e transferidos para frascos de marcação contendo 10 ml do marcador. Então medido o nível de radioatividade nas células do linfonodo em contagens por minuto por rato e posteriormente convertido para desintegração por minuto (dpm). c. Hemocompatibilidade Os testes de hemocompatilidade são aplicados aos dispositivos médicos que terão contato direto ou indireto com sangue, independente da duração desse contato. Três testes podem ser relevantes: hemólise, ativação do complemento e trombogenicidade. Em caso de contato indireto entre o dispositivo e o sangue apenas o teste de hemólise é suficiente. Enquanto para dispositivos com contato direito com sangue, aqueles ainda não comercializados que serão destinados a aplicações cardíacas ou vasculares e para dispositivos que liberaram algum produto químico no sangue circulante, o teste de trombogenicidade deve ser realizado. No caso de ensaio de hemólise para dispositivos com contado direto com sangue circulante a ISO 10993 recomenda a utilização da ASTM F756 “Prática Padrão para Avaliação de Propriedades Hemolíticas de Materiais”, através dos métodos direto e indireto (extrato) para hemólise mediada por material / superfície contidos na norma. Para testes de hemólise de dispositivos que tenham contato indireto com o sangue circulante, a ISO 10993 recomenda que um método indireto (extrato) seja realizado de acordo com ASTM F756. Para dispositivos sem contato com a circulação não é necessário o teste de hemólise, como por exemplo os aplicados na superfície externa de um vaso sanguíneo, a menos que haja o risco de alguns componentes acessarem a circulação sanguínea. O teste é realizado por uma medição quantitativa da hemoglobina plasmática, utilizando-se uma hemoglobina reagente e uma medição fotométrica (em um comprimento de onda de 540 nm). Um aumento no plasma pode ser correlacionado com a diluição de células vermelhas, indicando a atividade hemolítica do plasma hepático em contraste com as células. Para o teste de Ativação de Complemento utilizando um dispositivo médico leva-se em consideração algumas características do dispositivo, como área de superfície, arquitetura da superfície e composição química. Tendo em vista que o teste de ativação de complemento ocorre na superfície do material. O contato entre a superfície do biomaterial e o sistema de defesa do sangue gera um sistema cascata que leva a ativação celular, a análise se baseia os produtos resultantes dessa ativação. No caso in vitro, a análise é feita através do contato do material com os mediadores potentes, que são respostas do organismo (EKDAHL, K. N. et al, 2011). A ISO 10993 recomenda a utilização do complexo SC5b-9 e um método estabelecido teste ELISA. Para a interpretação de dados, os resultados são satisfatórios se não houverem diferenças estatística entre a amostra ensaiada e o controle negativo. Pois a grande quantidade do complexo SC5b-9 pode indicar uma resposta imune ao dispositivo médico.

Para o teste de Trombogenicidade o FDA recomenda o uso de modelo animal para este teste. Os protocolos devem incluir métodos apropriados para avaliar a formação de trombos associados a dispositivos (por exemplo, evidência fotográfica) e tromboembolismo em órgãos irrigados pelo sangue que houve contato com o dispositivo. Se o trombo do dispositivo for evidente, ou se o dispositivo for destinado a um órgão vital, a análise histopatológica adicional pode ser útil para avaliar tecidos locais e tecidos irrigados pelo sangue que teve contato com o dispositivo. No caso de testes in vivo a fluoroscopia é uma técnica importante para o conhecimento da posição adequada do dispositivo. Os parâmetros que podem interferir nos testes in vivo incluem a espécie do animal, a posição do mesmo durante a cirurgia, se há a aplicação de anticoagulante, minimização de traumas vasculares no local do implante, análise de diâmetro do vaso em relação ao implante, atenção no posicionamento e fixação do implante, assegurar que na explantação haja o mínimo de perturbação do trombo aderido e minimizar a formação de coágulos após o sacrifício do animal. Alguns dispositivos não necessitam de testes in vivo, os in vitro que envolvam avaliação de danos no sangue bastam. Uma série de testes como avaliação de plaquetas e o sistema de coagulação podem ser usados como um substituto para teste de trombogenicidade in vivo. Quando o dispositivo passa por alterações que não sejam de geometria e superfície, apenas testes estáticos de sangue são necessários, porém para novos dispositivos recomenda-se a avaliação das plaquetas, o sistema de coagulação e a formação macroscópica de trombos. Em testes in vitro o FDA recomenda o uso de sangue humano, e que sejam realizados testes de repetição se houverem doadores diferentes para demonstrar que os resultados não são afetados pelvariabilidade do doador. Sangue animal só deve ser utilizado sob justificativas. As condições de fluxo (por exemplo, agitação suave versus fluxo clinicamente relevante) e o tipo e concentração de anticoagulantes utilizados para testes in vitro podem depender do sistema de teste e da indicação clínica do dispositivo. d. Pirogenicidade Os pirogênios tem como característica induzir a temperatura corporal (febre), e eles podem ter exógenos ou endógenos. Os exógenos são originários fora do corpo e quando injetados ou implantados elevam a temperatura corporal (FUKUMORI, N. T. A., 2008). Enquanto os endógenos são produzidos internamente pelo hospedeiro em resposta do estimulo dos pirogênios exógenos. Existem duas formas comuns que pirogênios iniciam sua função e são importantes para o estudo em foco: Os pirogênios mediados por material e as endotoxinas bacterianas. No caso dos materiais, são produtos químicos que podem conter no mesmo e durante o uso ocasionarem a febre como resposta. Dispositivos estéreis implantados que tenham contato direto ou indireto com o sistema cardiovascular, sistema linfático ou líquido cefalorraquidiano, independentemente da duração do contato, e dispositivos rotulados como “não -pirogênico ”, deve atender às especificações de limite de

pirogênio. A informação de pirogenicidade é usada para ajudar a proteger os pacientes do risco de reação febril. A avaliação da pirogenicidade mediada por material utiliza métodos tradicionais de extração de biocompatibilidade, por exemplo, 50° C por 72 horas; 70°C por 24 horas; ou 121°C por 1 hora conforme a ISO 10993-12: 2012. Como o descrito no teste de pirogênio de coelho USP (Farmacopeia dos Estados Unidos) 34 ou um método validado equivalente. Para dispositivos que contêm materiais sensíveis ao calor que podem sofrer deformações ou mudanças estruturais do material em alta temperatura, é recomendado a extração a 37°C. O teste de pirogênio de coelho é um ensaio in vivo que consiste medir o aumento da temperatura ou determinar a tolerância do corpo em coelhos após administrar, por injeção intravenosa, a solução. A interpretação dos resultados é realizada com o aumento da temperatura dos animais acima de 0,5°C. Atualmente, os ensaios utilizados para avaliar o conteúdo de pirogênios, além do teste de pirogênio em coelhos, são o lisado de amebócito de limulus e o teste de ativação de monócitos (SILVA, V. F. 2017). e. Implantação O teste de implantação é realizado in vivo, recomenda-se a utilização da ISO 10993-6 para a maioria dos casos, ou em casos de implantes cerebral e vasculares, por haver risco elevado. A ISO 10993-6 recomenda que para o teste de implantação sejam utilizados animais como camundongos, ratos, hamsters ou coelhos, porém dependendo do tamanho do implante, sua função e resposta biológica esperada, outras espécies podem ser usadas, como cachorros ou porcos. O tempo do teste pode variar, para aqueles de resposta a curto prazo de uma a quatro semanas, e para respostas a longo prazo até doze semanas. A cirurgia é realizada com o animal anestesiado. Durante e depois da cirurgia sugere-se assepsia e cuidado com traumas locais. Para análise de resultados é realizado uma avaliação histológica do local, levando em conta o tamanho do implante. Em caso de implantes com riscos de segurança relativamente altos, sugere-se que uma implantação clinicamente relevante seja realizada, para determinar as respostas teciduais sistêmicas e locais ao implante em um ambiente anatômico relevante sob condições clínicas simuladas. Para testes de implantação de dispositivos com materiais que se destinam a degradar, recomendamos que testes incluam avaliações intermediárias para determinar a resposta tecidual durante a degradação (isto é, quando há mínima ou nenhuma degradação, se aplicável; durante a degradação para demonstrar um padrão de degradação progressiva e uma vez atingido o estado estacionário em relação à degradação do material e resposta tecidual). A seleção de pontos de tempo de avaliação intermediários pode ser baseada em testes de degradação in vitro.

f.

Genotoxicidade

O teste de genotoxicidade é descrito em detalhes pela ISO 10993-3, juntamente com os testes de carcinogenicidade e toxicidade reprodutiva. No ensaio de genotoxicidade, são usadas células de mamíferos ou não-mamíferos, bactérias, leveduras ou fungos para determinar se mutações genéticas, alterações na estrutura dos cromossomos ou outras alterações no DNA ou nos genes são causadas pelas amostras de teste. Os testes de genotoxicidade possuem a função principal de investigar o potencial dos produtos de induzirem alterações genéticas no homem, incluindo aquelas que podem ser transmitidas através das células germinativas para as gerações futuras. Para isso, utiliza-se células ou organismos de teste nos ensaios realizados, com o objetivo de se aproximar ao máximo à situação real. Existes estudos científicos que associam o dano ao DNA em células somáticas a um evento crítico para o início de câncer, uma vez que esse dano resulta em mutações. Dessa forma, pode-se perceber que testes para detectar atividade genotóxica auxiliam também a identificação de substâncias químicas com potencial carcinogênico (que será abordado a seguir). Diferente dos testes toxicológicos clássicos, que conseguem analisar inúmeros parâmetros pertinentes em um só experimento, a toxicologia genética cita aproximadamente quinze testes diferentes nas diretrizes do estudo. Isso se deve à necessidade de detecção de diversos parâmetros genéticos, o que demanda um estudo com múltiplos ensaios, que devem ser cuidadosamente programados para atender a todos os requisitos específicos. O ensaio de genotoxicidade pode ser dispensado nos casos em que a caracterização química dos extratos do dispositivo e as referências literárias indicarem que todos os componentes já haviam sido adequadamente avaliados previamente. No caso de dispositivos que contenham materiais já conhecidos como genotóxico, o teste de genotoxicidade pode não ser informativo, uma vez que um resultado positivo será atribuído à genotoxina conhecida, abrindo margem para a negligência de uma segunda genotoxina de outra fonte. Se o teste de genotoxicidade for realizado, um resultado negativo deve ser interpretado como negativo para os outros componentes do dispositivo ou produtos de interação, mas não necessariamente nega o risco da genotoxina conhecida. A caracterização química pode ser necessária para demonstrar em que medida a genotoxina é libertada do dispositivo. Para genotoxinas conhecidas, a determinação geral do benefício-risco dependerá da indicação do dispositivo e da exposição humana. Sendo assim, o teste é solicitado quando o perfil de genotoxicidade não foi adequadamente estabelecido. Tradicionalmente, solicita-se informações de genotoxicidade para dispositivos que terão contato prolongado (> 24 horas a 30 dias) ou permanente (> 30 dias) com sangue, osso, mucosa ou outro tecido; assim como para quaisquer materiais pioneiros em aplicações de dispositivos médicos, independentemente da duração do uso. Como não é possível detectar todas as genotoxinas em um único teste, recomenda-se realização de dois testes in vitro e um teste in vivo opcional:

i.

Ensaio de mutação genética bacteriana, conduzido com cepas de Salmonella typhimurium e Escherichia coli projetadas para detectar alterações ou mutações genéticas.

ii.

Ensaio in vitro de genotoxicidade em mamíferos, o qual pode ser um dos seguintes: ⋅

Ensaio de mutação do gene linfoma do rato. É preferível por detectar o conjunto de mecanismos mais amplo genotóxicos associado à atividade carcinogênica;

iii.

⋅

Ensaio in vitro de aberração cromossómica;

⋅

Ensaio de micronúcleos in vitro.

Ensaio de citogenética in vivo, especialmente para dispositivos contendo materiais novos cujas quantidades no extrato de teste estiverem acima do limite de detecção do ensaio. Devese realizar um dos seguintes: ⋅

Ensaio de micronúcleos da medula óssea;

⋅

Ensaio de aberração cromossómica da medula óssea;

⋅

Ensaio de micronúcleos do sangue periférico.

Resultado positivo em qualquer um desses ensaios indica genotoxicidade, e deve ser usado em conjunto com a avaliação de risco toxicológico com relação à carcinogenicidade para definir o benefíciorisco geral do dispositivo. Todos os ensaios devem ser realizados em extratos não diluídos, com exceção aos casos cuja citotoxicidade interfere no desempenho do teste. Para os ensaios in vitro baseados em células de mamíferos, recomenda-se que a citotoxicidade seja avaliada utilizando um método quantitativo. Para produtos combinados que incluem uma droga, a droga deve ser testada separadamente em um estudo de dose-resposta (não como um extrato), e o produto combinado final deve ser avaliado por métodos de extração padrão. g. Carcinogenicidade De acordo com a ISO 10993-3, o teste de carcinogenicidade determina o potencial tumorigênico de dispositivos médicos, materiais e/ou extratos usando exposições únicas ou múltiplas durante a maior parte da vida útil do animal testado. Resumidamente, define o potencial de um material que entra em contato com o paciente de causar ou incitar o crescimento de células malignas. Esses testes podem ser projetados para examinar tanto a toxicidade crônica quanto a tumorigenicidade em um único estudo experimental. Nesses casos, deve-se tomar cuidado maior na seleção da dose para assegurar que a mortalidade prematura por toxicidade crónica/cumulativa não comprometa a avaliação estatística dos animais que sobrevivem até ao final do estudo programado (isto é, tempo de vida normal). A FDA recomenda que o potencial de carcinogenicidade seja avaliado para dispositivos com contato permanente (exposição superior a 30 dias), o que inclui dispositivos em contato com superfícies quebradas ou comprometidas (por exemplo, feridas em cicatrização), bem como dispositivos de

comunicação externa e implantes. Se novos materiais forem usados para fabricar esses dispositivos, também se recomenda revisão da literatura de carcinogenicidade. Na ausência de informações de carcinogenicidade derivadas experimentalmente, pode ser necessária uma modelagem específica para os materiais em estudo, independente da duração do contato, para melhor entender seu potencial de carcinogenicidade. O objetivo de um estudo de carcinogenicidade a longo prazo é observar os animais de teste, durante a maior parte da sua vida, para o desenvolvimento de lesões neoplásicas, durante ou após a exposição a várias doses de uma substância de teste por uma via apropriada. Tal teste requer um planejamento cuidadoso e documentação do desenho experimental, uma alta qualidade de patologia e análise estatística imparcial. Dessa forma, para avaliar o risco carcinogênico do dispositivo médico em sua forma final, deve-se considerar as informações de genotoxicidade em conjunto com os seguintes elementos: i.

Formulações químicas completas e resíduos de fabricação para todos os componentes do dispositivo com potencial de contato com o tecido.

ii.

Quantidade total de extraíveis e lixiviáveis usando métodos de química analítica com uma sensibilidade apropriada (ppm ou ppb, por exemplo).

iii.

Quantidade de cada substância química presente em uma situação de pior exposição do paciente. Para esta avaliação, uma sugestão é supor que o paciente está exposto a 100% do produto químico no dispositivo ou a 100% do subproduto que pode ser gerado pelo dispositivo.

iv.

Potencial de genotoxicidade e carcinogenicidade dos produtos químicos, incluindo: ⋅

Revisão completa da literatura com termos de pesquisa identificados;

⋅

Avaliação de qualquer evidência de carcinogenicidade em estudos em animais in vivo de longo prazo (por exemplo, inflamação, lesões pré-neoplásicas ou descobertas em estudos com animais);

⋅

Relevância dos dados em animais para avaliar os riscos em seres humanos;

⋅

Avaliação de dados humanos a partir de estudos epidemiológicos, se disponíveis, ou quaisquer outros resultados relevantes de estudos clínicos de longo prazo, incluindo populações e estágios de vida suscetíveis, e local do implante do dispositivo e propensão do local para desenvolver tumores.

v.

Avaliação de risco de câncer e a avaliação se o potencial carcinogênico apresenta um risco aceitável ou não.

Antes de conduzir os procedimentos, recomenda-se que o patrocinador discuta os testes necessário com a agência reguladora, a fim de garantir que os ensaios sejam apropriados para avaliar os riscos carcinogênicos e que usem um tamanho de amostra estatisticamente adequado para obter um resultado válido.

h. Toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento Testes de toxicidade reprodutiva abrangem as áreas de reprodução, fertilidade e teratogenicidade (efeitos adversos de uma substância no embrião e no feto em desenvolvimento). Ao longo dos anos, verificou-se a reprodução e a fertilidade podem ser afetadas por muitas substâncias, frequentemente de maneira insidiosa, sem outros sinais de toxicidade. A fertilidade pode ser afetada em machos e fêmeas, e os efeitos podem variar de capacidade reprodutiva levemente diminuída a esterilidade completa. Dessa forma, o teste de toxicidade visa avaliar os efeitos potenciais das amostras sobre a função reprodutiva e sobre a morfologia embrionária, assim como sobre o desenvolvimento pré e pós-natal precoce. A decisão de realizar esse ensaio deve ser justificada com base na avaliação do risco de toxicidade para a reprodução e para o desenvolvimento, decorrente da utilização do dispositivo médico, da avaliação de biocompatibilidade ou de informações inadequadas na literatura. Na ausência de evidências para descartar riscos reprodutivos, testes e/ou sugestões de mitigações serão necessários. Isso pode incluir ensaios para os seguintes casos: i.

Novos materiais de implante, caso haja potencial de contato entre substâncias químicas e órgãos/tecidos reprodutivos ou embrião/feto, independente do tipo ou duração do contato;

ii.

Materiais ou componentes do dispositivo em contato com os órgãos reprodutivos;

iii.

Materiais reabsorvíveis ou substâncias lixiviáveis.

Caso os materiais do dispositivo puderem ser distribuídos sistemicamente (como, por exemplo, em dispositivos absorvíveis), e a literatura de toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento não estiver disponível, deve-se considerar testes em animais em idade reprodutiva. Vale ressaltar que, dada a influência da toxicidade reprodutiva na saúde da humanidade, as técnicas de teste ainda estão sendo desenvolvidas e aprimoradas e o conceito de testes combinados tem parecido cada vez mais promissor. i.

Análise de degradação

As avaliações de degradação in vivo devem ser realizadas em um modelo animal apropriado, caso o dispositivo seja projetado para ser absorvível, segundo as recomendações da agência reguladora. A ISO 10993-1 estabelece que os parâmetros que afetam a taxa de degradação devem ser descritos e documentados, e a taxa de degradação, assim como a resposta biológica ao dispositivo, devem ser relatados com base em dados fisiologicamente relevantes. Caso uma resposta biológica adversa seja observada, recomenda-se avaliações in vitro adicionais para identificar a fonte da toxicidade, como possíveis substâncias químicas preocupantes. Além disso, pode ser exigido ainda alguns testes no dispositivo médico em sua forma final, como testes de degradação ou testes de caracterização química. Antes de conduzir esses procedimentos, recomenda-se que o patrocinador discuta os testes necessário com a agência reguladora, a fim de garantir que os ensaios sejam apropriados para avaliar os riscos potenciais ao paciente (como riscos toxicológicos e perda de

propriedades mecânicas). Todos os protocolos e relatórios da caracterização da degradação do produto devem ser fornecidos na submissão. 3. EXEMPLOS DE ENSAIOS IN VIVO E IN VITRO a. Citotoxicidade Utilizando a citotoxicidade podemos ressaltar que se faz necessário o ensaio de viabilidade celular. Como por exemplo no trabalho de CERTIN e BULLERMAN (2005), no qual para analisar micotoxinas do fungo Fusarium, que normalmente contaminam cereais. Para isso utilizou-se cultura de células e posteriormente a avaliação dose-respostas entre as células e as micotoxinas do fungo Fusarium. A análise foi realizada utilizando oxidação metabólica do MTT [3(4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 difenil brometo de tetrazólio], que posteriormente é solubilizado e assim obtido o resultado por meio de absorbância e quantificada a proliferação de células no meio. b. Sensibilização Até mesmo joias podem passar por testes de sensibilização, como no trabalho de IKARASHI, KANIWA e TSUCHIVA (2002) o GTS (tiossulfato sódio ouro) foi testado por LLNA e GPMT em porquinhos da índia fêmeas adultas. O teste de GPMT utilizou-se 10 animais para o teste e 5 animais como grupo controle. No mesmo, aplicou-se soluções solução salina de GTS e FCA (completo adjuvante de Freund). Após 6 dias, a injeção local foi tratada com 10% de lauril sulfato de sódio (SLS) em petrolato. 24 horas depois, a sensibilização foi reforçada por um patch ocluído de 48 h de 0,05 g de GST a 5% em petrolato colocado sobre a mesma região. 21 dias após a injeção intradérmica inicial, foi aplicado em todos os animais de forma tópica de 20 ml de 2 % e 5% de GST (na concentração máxima não irritante), 5% de tiossulfato de sódio em solução de etanol a 50% no flanco raspado. A reação cutânea dos locais de provocação foi determinada por avaliação visual às 48 e 72 h após a aplicação. O teste de LLNA grupos de 3 ratos foram expostos a 20 µL de solução (GST em DMSO 70%) e o grupo controle apenas ao veículo por três dias consecutivos. No quarto dia os nódulos linfáticos auriculares foram extirpados, agrupados e pesados. Uma suspensão unicelular de células linfonodais (LNC) foi preparada por desagregação mecânica. A LNC foi ressuspendida em meio de cultura e o número total de LNC foi determinado utilizando um contador de células automatizado. As suspensões de LNC foram semeadas em placas de cultura e cultivadas. Os aumentos no número de LNC em relação aos controles indicam a ativação total dos linfonodos induzida pelos produtos químicos testados.

c. Hemocompatibilidade

No trabalho de CERDA-CRISTERNA et al. (2011) a hemólise foi realizada utilizando-se microtubos de 200 µL, no qual preparou-se uma mistura de 1 para 9 de solução de polímero diluído e sangue total. As amostras foram incubadas durante 15, 60, 120 e 240 minutos a 37°C em rolos misturadores horizontais (a 35 rpm). Após a incubação, 600 gramas das amostras foram centrifugadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram recolhidos e misturados com reagente de cianometemoglobina. A hemoglobina liberada foi medida a 540 nm num leitor de microplacas (Anthos HT III, tipo 12600, Anthos, Salzburg, AU). Uma curva de calibração foi estabelecida usando a hemoglobina bovina como padrão. Saponina (0,8 mg / mL) e PBS foram usados como controles positivo e negativo, respectivamente. A hemoglobina total liberada do sangue total diluído no reagente de cianometemoglobina foi determinada como 100% de liberação de hemoglobina. A hemólise foi expressa como a porcentagem de hemoglobina liberada (% rHb) para o conteúdo total. d. Pirogenicidade Conforme o trabalho de MOHANAN, BANERJEE e GEETHA (2011) foram adicionadas em frascos separados: cinco amostras de gelatinas poliméricas para aplicações médicas, pirogênio cônico e soro fisiológico. Os frascos foram mantidos em repouso por duas horas e depois deixados em banho de água a 60°C até a solução ficar com aspecto de límpida. Então os frascos foram autoclavados a 121°C por 5 horas, resfriado até alcançar 37°C. A solução obtida foi utilizada para injeções intravenosas em coelhos. A análise de dados foi realizada pelas técnicas de lisado de amebócito de limulus e ELISA. Todos os coelhos tiveram sua temperatura corpórea monitorada, e conforme a ISO 10993, se a mesma estiver acima de 0,5°C o material analisado é dado como pirogênio. e. Implantação No trabalho de MEGÍAS BARRERA et al. (2018) foi analisada a implantação subcutânea de polipropilenos porosos. O teste foi realizado no dorso de seis ratos wistars, que consistiu no inserto subcutâneo de dois implantes redondos de diâmetro de 5 mm em cada lado, conforme a Figura. Os ratos foram sacrificados após três meses e a resposta tecidual microscópica local no local implantado e a toxicidade sistêmica em amostras histológicas de fígado e rins foram avaliadas por um patologista usando hematoxilina / eosina (H.E). f.

Genotoxicidade

A seguir estão explicitados os exemplos mais comuns de testes de genotoxicidade para análise de mutação de gene, de aberração cromossômica e de aparecimento de micronúcleos. ⋅

Teste de mutação de gene → Ensaio de mutação reversa bacteriana de Ames

Esse é o teste mais comum para detecção de mutações genéticas. Nele, utiliza-se cepas de Salmonella typhimurium dependentes de histidina (apenas sobrevivem em meios ricos em histidina) como organismos de teste. Realiza-se então um tratamento mutágeno, incorporando extrato de fígado de rato a uma porção dos organismos de teste para simular a exposição de animais inteiros. Após a exposição ao extrato fluido do material de teste, os organismos são colocados em uma placa rica em ágar nutriente e isento de histidina, e em seguida são incubados durante um período de tempo especificado. As colônias são então enumeradas e esses dados são comparados com as contagens obtidas para condições de controle negativo. Nesse processo, algumas células são transformadas em células normais que sintetizam histidina e sobrevivem num meio normal, as quais são chamadas de revertentes (devido à mutação reversa). Uma vez que as cepas de teste não revertidas não crescerão sem histidina, qualquer crescimento adicional indica que a exposição a um agente genotóxico causou mutações pontuais que produziram cepas bacterianas que já não requerem histidina.

⋅

Teste de aberração cromossômica Visa detectar danos cromossômicos induzidos após uma divisão celular; as mudanças estruturais nos cromossomos são avaliadas enquanto as células estão no estágio de divisão metáfase. O modelo in vitro emprega células de ovário de camundongo chinês. Lacunas,

quebras e trocas são exemplos de aberrações observáveis e, quando a porcentagem das células com aberrações cromossômicas for maior que 4%, confirma-se alta probabilidade de mutação genética. ⋅

Teste de micronúcleos → Ensaio de micronúcleo da medula óssea de camundongo É um teste in vivo que visa detectar danos aos cromossomos ou ao aparato mitótico de células imaturas do sangue vermelho encontradas na medula óssea. Durante a divisão celular, cromossomos quebrados ou aparato mitótico celular danificado podem causar a incorporação de fragmentos cromossômicos em núcleos secundários em vez do núcleo principal. Esses núcleos secundários são muito menores que o núcleo principal e são chamados de micronúcleos. O desenvolvimento de eritroblastos em eritrócitos policromáticos (PCEs) promove a extrusão do núcleo principal, entretanto, se houver qualquer micronúcleo presente, ele permanecerá. Assim, o aumento no número de PCEs micronucleadas em animais tratados com o extrato de teste é uma indicação da presença de uma genotoxina.

g. Carcinogenicidade Como os testes de carcinogenicidade são realizados in vivo, as principais diretrizes são fornecidas pela OECD 451 e OECD 453. Normalmente, esse tipo de ensaio é realizado com roedores e a substância testada é mais comumente administrada por via oral, apesar de poder ser aplicada também por via dérmica ou por inalação. A substancia de teste é fornecida diariamente em doses graduais (no mínimo três leveis de dose) a diversos grupos de animais de teste, durante a maioria de sua vida útil, e os efeitos são cuidadosamente observados e documentados. Os animais devem ser abrigados individualmente ou em gaiolas com pequenos grupos do mesmo sexo. O ambiente deve ser mantido a uma temperatura de 22ºC (±3ºC), com umidade entre 30% e 70%

(preferencialmente entre 50% e 60%) e luz artificial (com exposição de 12h na luz e 12h no escuro). Os animais devem ser alimentados com dieta nutricional adequada para a espécie testada e água ilimitada. Os animais devem ser aclimatados às condições laboratoriais por pelo menos 7 dias antes do início do estudo, e o estudo deve começar antes de eles completarem 8 semanas de idade. O procedimento inicial é caracterizar os animais quanto à espécie, linhagem, sexo, peso e idade, e garantir uma variação mínima na sua amostra. Para garantir avaliação biológica e estatística, deve-se possuir dois grupos (um de fêmeas e outro de machos) de no mínimo 50 indivíduos cada, e um grupo de controle (que não será tratado com nenhuma substância). O estudo dura normalmente 18 a 24 meses, dependendo da espécie dos animais de teste, e eles devem ser acompanhados diariamente para morbidade ou mortalidade e para sinais específicos de relevância toxicológica, assim como devem ser pesados semanalmente. Ao final do estudo, os tecidos que devem ser avaliados são, no mínimo: ⋅

Todos os tecidos dos grupos dose alta e controle;

⋅

Todos os tecidos de animais morrendo ou mortos durante o estudo;

⋅

Todos os tecidos apresentam anormalidades macroscópicas, incluindo tumores;

⋅

Quando alterações histopatológicas relacionadas ao tratamento são observadas no grupo de altas doses, esses mesmos tecidos devem ser examinados de todos os animais em todas os grupos de outras doses.

⋅

No caso de órgãos pareados, por exemplo, rim, adrenal, ambos os órgãos devem ser examinados.

E o relatório de resultados deve conter as seguintes informações: ⋅

Geral: dados de sobrevivência; alterações no peso corporal; consumo de alimentos, cálculos de eficiência alimentar, e consumo de água; dados toxicocinéticos, se disponíveis.

⋅

Descobertas clínicas: sinais de toxicidade; Incidência e gravidade de qualquer anormalidade; Natureza, severidade e duração das observações clínicas (transitórias ou permanentes).

⋅

Dados de necropsia: Peso corporal terminal; Pesos de órgãos e suas proporções, se aplicável; Descobertas de necropsia; Incidência e gravidade das anormalidades.

⋅

Histopatologia: Achados histopatológicos não neoplásicos; Achados histopatológicos neoplásicos; Correlação entre achados macroscópicos e microscópicos; Descrição detalhada de todos os achados histopatológicos relacionados ao tratamento, Descrição detalhada de todos os achados histopatológicos relacionados ao tratamento.

⋅

Tratamento estatístico dos resultados, quando apropriado: pesos corporais, pesos de órgãos, consumo de ração (ou consumo de água), incidência de tumores.

⋅

Discussão dos resultados incluindo: Discussão de quaisquer abordagens de modelagem; Dose: relação de resposta; Controle de histórico; Relevância para os seres humanos.

h. Toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento Os testes de toxicidade reprodutiva devem ser realizados segundo as OECD 414, 415 ou 416 e 421. No caso de esses documentos não abrangerem as informações necessárias para o dispositivo/material que deve ser testado, deve-se considerar as seguintes modificações: ⋅

Dose (no caso de dispositivos médicos de depósito de energia);

⋅

Via de aplicação (implante, parenteral, outro);

⋅

Μeios de extração (extratos aquosos e não aquosos);

⋅

Τempo de exposição (níveis elevados no sangue durante a organogênese, quando possível).

A norma é projetada para ser aplicada em ratos, e todas as condições dos testes (acomodação, alimentação e preparação dos animais, dosagem, condições ambientais) são semelhantes aos apresentados nas OECD 451 e OECD 453. Nesse ensaio recomenda-se dois grupos de 10 machos e 12 a 13 fêmeas, sendo que se espera uma ração de 1:1 para reprodução. Os resultados devem englobar: ⋅

Alterações corporais/ alterações de peso;

⋅

Consumo de alimentos e consumo de água, se disponível;

⋅

Dados de resposta tóxica por sexo e dose, incluindo fertilidade, gestação e quaisquer outros sinais de Toxicidade;

⋅

Duração da gestação;

⋅

Efeitos tóxicos ou outros efeitos na reprodução, descendência, crescimento pós-natal, etc.;

⋅

Natureza, gravidade e duração das observações clínicas (reversíveis ou não);

⋅

Número de fêmeas adultas com ciclo normal e anormal e duração do ciclo;

⋅

Número de nascidos vivos e perda pós-implante;

⋅

Dados do peso corporal dos filhotes

⋅

AGD de todos os filhotes (e peso corporal no dia da medição AGD)

⋅

Retenção no mamilo em filhotes machos,

⋅

Níveis hormonais da tiroide, filhotes de 13 dias, e machos adultos (e mães, e filhotes dia 4, se medidos)

⋅

Número de filhotes com anormalidades grosseiramente visíveis, avaliação bruta da genitália externa, número de filhotes menores que o normal;

⋅

Tempo de morte durante o estudo ou se os animais sobreviveram à terminação;

⋅

Número de implantes, tamanho da ninhada e peso da ninhada no momento da gravação;

⋅

Peso corporal ao sacrifício e dados de peso dos órgãos para os animais parentais; achados da necropsia;

⋅

Descrição detalhada dos achados histopatológicos;

⋅

Dados de absorção (se disponíveis);

⋅

Tratamento estatístico dos resultados, quando apropriado.

Um exemplo interessante nessa área é o estudo realizado por He. et. al. (2014). Visando alternativas para reduzir o uso de animais mamíferos nos testes de toxicidade reprodutiva, ele introduz a viabilidade de utilizar o peixe-zebra como um modelo de animal vertebrado, para a descoberta de drogas in vivo e para avaliar a toxicidade e segurança química. Numerosos estudos confirmaram que os peixes-zebra e os mamíferos são semelhantes em sua fisiologia, desenvolvimento, metabolismo e vias, e que as respostas do peixe-zebra a substâncias tóxicas são altamente preditivas das respostas dos mamíferos. Comparado aos testes convencionais de mamíferos, o teste do peixe-zebra para avaliar a toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento oferece várias vantagens experimentais, incluindo transparência de embriões e larvas, maior rendimento, menor período de teste, menor custo, menor quantidade de composto necessário, manipulação mais fácil e entrega direta de composto. i.

Análise de degradação

Não há padronização de ensaios para análise de degradação e a maioria dos trabalhos relacionados ao tema são de cunho acadêmico e realizados in vivo. Meischel et. al. (2017), por exemplo, analisou o efeito da degradação de ligas de magnésio nos ossos vizinhos ao implante. Portanto, ele relacionou a a microdureza e a resistência mecânica do osso à troca de Magnésio e Cálcio em Hidroxiapatita. Após a operação e implantação, os valores de microdureza tornaram-se temporariamente menores, mas após a completa degradação dos implantes, os valores foram idênticos aos dos espécimes sem implantes. Yang et. al. (2015), por outro lado, estudou a degradação de implantes de poli(carbonato de trimetileno) – PTMC – com diferentes pesos moleculares. Foi evidenciada maior taxa de degradação na PTMC de alto peso molecular, assim como aumento na hidrofobia da superfície com o melhoramento da estabilidade de forma. Os resultados indicam que a PTMC estabilizada de forma é um candidato promissor para implantes subcutâneos clínicos, especialmente devido à sua taxa de degradação ajustável. 4. COMENTÁRIOS A Tabela 1 apresenta o escopo para o desenvolvimento de uma avaliação de biocompatibilidade, sumarizando todos testes e sua obrigatoriedade em relação à natureza do contato com o corpo e o tempo de exposição.

Tabela 1: Processos de avaliação de biocompatibilidade [ISSO 10993-1, 2009]

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Dispositivo de superfície

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Superfície Danificada ou Comprometida

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Membrana Mucosa

Dispositivo de Tecido+/ Osso/ Comunicação Dentina Externa Sangue circulatório

+

Tecido / Osso Dispositivo de Implante Sangue

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x: Pontos recomendados para consideração pela ISO 10993-1:2009* o: Pontos adicionais recomendados para consideração pela agência regulatória dos EUA (FDA)*

Degradação@

B

Pele intacta

Toxicidade Reprodutiva / de Desenvolvimento#

x

C - permanente (> 30 dias)

Carcinogenicidade

Toxicidade subaguda / subcrônica

x

B - prolongado (> 24h a 30 dias)

Toxicidade crônica

Pirogenicidade Mediada por material

x

Contato

Hemocompatibilidade

Toxicidade Sistêmica Aguda

Categoria

Implantação

Irritação ou Reatividade Intracutânea

A

A - limitado (≤ 24h)

Genotoxicidade

Sensibilização

Efeito Biológico

Citotoxicidade

Dispositivo médico caracterizado por Natureza de contato com o Duração do corpo contato

Observação *: Todos os “x”s e “o”s devem ser abordados na avaliação de segurança biológica, seja pelo uso de dados existentes, por testes adicionais específicos ou por um motivo pelo qual o processo não requer avaliação adicional. Nota +: O tecido inclui fluidos de tecido e espaços subcutâneos Nota ^: Para todos os dispositivos utilizados em circuitos extracorpóreos Nota #: A toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento deve ser abordada para novos materiais, materiais com toxicidade /de desenvolvimento conhecida, dispositivos com populações-alvo relevantes (por exemplo, mulheres grávidas) e/ou dispositivos em que haja probabilidade de presença local de materiais do dispositivo em os órgãos reprodutivos. Nota @: A informação de degradação deve ser fornecida para quaisquer dispositivos, componentes do dispositivo ou materiais que permaneçam em contato com o tecido que se destina a degradar.

Dessa forma, é possível notar que a citotoxidade é um ensaio primordial para biomateriais, normalmente sendo base para os demais. Dentre os métodos de citotoxidade encontrados na literatura, são similares entre si. A citocompatibilidade é um ensaio que pouco difere-se da citotoxidade, este último utiliza-se um controle tóxico para as células, como DMSO, enquanto a citocompatibilidade não. Os ensaios seguintes são mais específicos quanto a destinação do mesmo. Segundo a ISO 10993 os testes que envolvem sensibilização, irritações ou reações intracutâneos são necessárias para todos dispositivos para implantes e externos, porém se comparado à citotoxidade, há menos conteúdo na literatura. Os ensaios de hemocompatibilidade, devido ao destino de utilização serem mais restritos, normalmente são encontrados na literatura ensaios específicos para os determinados fins. Como por exemplo os stents, dispositivos mais relevantes quando o teste é de hemocompatibilidade. Os ensaios de implantação e pirogenicidade são mais comuns e com menos diversidade nos métodos que os de hemocompatibilidade. Os ensaios de genotoxicidade são exigidos para todos os dispositivos de comunicação externa e implantes que tiverem exposição maior ou igual a 24 horas. Entretanto, vale ressaltar que a FDA recomenda avaliações de genotoxicidade para um conjunto mais amplo de dispositivos /exposição de tecidos do que o descrito na norma ISO 10993-1: 2009. Por exemplo, para todos os dispositivos usados em circuitos extracorpóreos, mesmo que o contato seja inferior a 24 horas, as avaliações de genotoxicidade são recomendadas devido à alta área de superfície, ao aumento do potencial associado à lixiviação química e à introdução de qualquer líquido lixiviável na circulação sistêmica. Os ensaios de carcinogenicidade, por sua vez, são dispensados para todas as categorias pela ISO e são apenas exigidos pela FDA para alguns casos. Segundo a agência regulatória americana, os dispositivos que terão um contato de mais de 30 dias com os tecidos devem passar por testes de carcinogenicidade. As avaliações devem ser fornecidas (geralmente através de uma avaliação de risco) para as seguintes categorias de dispositivos: dispositivos permanentes em contato com superfícies danificadas ou comprometidas e todos os dispositivos permanentes de comunicação externa e implantados.

Testes de degradação e de toxicidade reprodutiva e de desenvolvimento ainda não são exigidos para nenhum tipo de dispositivo ou substância. 5. CONCLUSÃO Os produtos químicos que interagem com o DNA produzem lesões que, após a influência de vários processos de reparação, podem levar a alterações genéticas ao nível do gene, p. mutações genéticas ou pontuais, pequenas deleções, recombinação mitótica ou várias alterações cromossômicas microscopicamente visíveis, e testes estão disponíveis para investigar cada um desses eventos. Os testes atuais de curto prazo não podem, é claro, imitar todos os estágios do processo carcinogênico e são frequentemente considerados como detectando apenas o evento que leva à fase de iniciação, ou seja, a capacidade de induzir uma lesão de DNA mutagênico ou clastogênico. O principal valor desses procedimentos, portanto, reside na sua capacidade de identificar substâncias que podem, sob certas condições de exposição, causar câncer por um mecanismo predominantemente genotóxico ou induzir a fase inicial do processo carcinogênico. É evidente, a partir da complexidade do processo carcinogênico em comparação com a relativa simplicidade dos testes de curto prazo, que, embora forneçam informações qualitativas úteis, é necessária considerável cautela em sua interpretação em termos de atividade carcinogênica. Uma vez que nenhum teste único provou ser capaz de detectar mutagenes e carcinógenos de mamíferos com um nível aceitável de precisão e reprodutibilidade, é prática científica comum aplicar esses testes em "baterias". Informações iniciais sobre a mutagenicidade de uma substância podem ser obtidas usando testes que medem mutações genéticas e danos cromossômicos. Como são necessários procedimentos separados para investigar esses pontos de extremidade, é necessária uma bateria de teste. Apesar de vários métodos in vitro bem estabelecidos estarem disponíveis e oficialmente aceitos para avaliação de risco genotóxico, eles ainda necessitam de alta demanda de testes in vivo em animais para serem validados. Os ensaios de genotoxicidade, apesar de mostrarem alta sensibilidade (e, portanto, baixa taxa de falsos negativos), os métodos in vitro atuais mostram uma especificidade relativamente baixa e, portanto, alta taxa de resultados falsos positivos, o que tipicamente leva a seguir testes in vivo desnecessários para a confirmação destes resultados. De fato, sabe-se agora que é possível limitar estes falsos positivos: 1) utilizando células humanas competentes para a proteína p53; 2) escolha de medidas de citotoxicidade baseadas na proliferação celular; 3) checar cuidadosamente a fonte e a caracterização das células; 4) teste com concentração máxima reduzida. Além disso, novos métodos e estratégias que visam o número de animais e desenvolver modelos mais assertivos, continuam sendo desenvolvidos nos últimos anos, e os resultados parecem bem promissores. Do mesmo modo, visando melhora da eficácia dos testes e diminuição do uso de animais, as avaliações em ensaios carcinogênicos recentes de grandes conjuntos de dados levaram à percepção de que a farmacologia primária de um composto é um fator muito importante na determinação do resultado

de um estudo de carcinogenicidade. Um fator adicional é a indução de enzimas hepáticas responsáveis pelo metabolismo, que pode ser estabelecida a partir de estudos com duração mais curta. De qualquer forma, vale lembrar que esses ensaios in vivo apresentam normas muito genéricas e voltadas para teste de drogas e pouco aplicáveis para casos de implantes ou novos biomateriais. Todos as diretrizes de ensaios in vivo assumem parâmetros de ensaio praticáveis apenas para avaliação de drogas e substâncias, não indicando Ensaios de degradação, por exemplo, não apresentam nenhum tipo de norma e são realizados no geral in vivo, de acordo com os critérios e parâmetros escolhidos pelo próprio pesquisador. Inúmeros trabalhos e publicações feitas nos últimos anos norteiam as metodologias atuais, mas ainda existe um déficit de padronização desses estudos. Além disso, os trabalhos realizados sobre degradação são muito recentes e a literatura sobre o assunto ainda é bastante escassa, o que cria barreiras para o aumento da aplicação de biomateriais na medicina, dada a volatilidade dos resultados. 6. REFERÊNCIAS CERDA-CRISTERNA, B. I.; FLORES, H.; POZOS-GUILLÉR, A.; PÉREZ, E. Hemocompatibility assessment of poly (2-dimethylamino ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-based polymers. Jour of Contr Rel. v. 153. p- 269-277. 2011. CETIN, Y.; BULLERMAN, L. B. Cytotoxicity of Fusarium mycotoxins to mammalian cell cultures as determined by the MTT bioassay. Food and Chem Tox. v.43, n.5, 755-764. 2005. DESESSO, H.M. Future of Developmental Toxicity Testing. Current Opinion in Toxicology, Vol. 3, p. 1-5, 2017 EKDAHL, K. N.; LAMBRIS, J. D.; ELWING, H.; RICKLIN, D.; NILSSON, P. H.; TERAMURA, Y.; NICHOLLS, I. A.; NILSSON, B. Innate immunity activation on biomaterial surfaces: A mechanistic model and coping strategies. Adv Drug Delivery Rev. Nova Iorque. v. 63, n. 12, p- 10421050, 2011. FUKOMORI, N. T. O. Determinação de endotoxina bacteriana (pirogênio) em radiofármacos pelo método de formação de gel validação. 2008. 77 f. Dissertação (Mestrado em Ciência em Tecnologia Nuclear – Aplicação) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008. HE, J.H.; GAO, J.M.; HUAND, C.J.; LI, C.Q. Zebrafish models for assessing developmental and reproductive toxicity. Neurotoxicology and Teratology, Vol. 42, p. 35-42, 2014. IKARASHI, Y.; KANIWA, M.; TSUCHIYA, T. Sensitization potential of gold sodium thiosulfate in mice and guinea pigs. Biom. v. 23, p- 4907-4914. 2002. INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-1, "Biological evaluation of medical devices - Part 1: Evaluation and testing within a risk management process", 2016. INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-3, "Biological evaluation of medical devices - Part 3: Tests for genotoxicity, carcinogenicity and reproductive toxicity", 2003. INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-5, "Biological evaluation of medical devices - Part 5:

Tests for in vitro citotoxicity", 2009. INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-10, "Biological evaluation of medical devices - Part 10: Tests for irritation and skin sensitization", 2010. INTERNATIONAL STANDARD ISO 10993-11, "Biological evaluation of medical devices - Part 11: Tests for systemic toxicity", 2006. LAAN, J. W.; DUIJNDAM, B.; HOORN, T.; WOUTERSEN, R.; WATER, B. Changing the field of carcinogenicity testing of human pharmaceuticals by emphasizing mode of action. Current Opinion in Toxicology, Vol. 3, p. 55-61, 2017. MADIA, F.; FAFFAELLA, C. In vitro genotoxicity testing – Can the performance be enhanced? Food and Chemical Toxicology, Vol. 106, No. B, p. 600-608, 2016. MEGÍAS BARRERA, J.; GARCÍA-CONSUEGRA, L.; NOVOA, A.; COSTILLA, S.; JUNQUERA, S.; ASCANI, G. Histological and radiological evaluation of subcutaneous implants in mouse of a 3Dprintable material (Fulcure 720) and experimental application in mandibular reconstruction. J Stomatol Oral Maxillofac Surg v. 119, p. 88-92. 2018. MEICHEL, M.; HORMANN, D.; DRAXLER, J.; TSCHEGG, E.K.; EICHLER, J.; PROHASKA, T.; STANZL-TSCHEGG, S. E. Bone-implant degradation and mechanical response of bone surrounding Mg-alloy implants. Journal od the Mechanical Behavior of Biomedical Materials, Vol. 71, p.307-313, 2017. MOHANAN, P. V.; BANERJEE, S.; GEETHA, C. S. Detection of pyrogenicity on medical grade polymer materials using rabbit pyrogen, LAL and ELISA method. Jour of Pharma and Biom Analysis v. 55, n. 5, p. 1170-1174. 2011. NESSLANY, F. The current limitations of in vitro genotoxicity testing and their relevance to the in vivo situation. Food and Chemical Toxicology, Vol. 106, No. B, p. 609-615, 2016. ROGERO, S. O.; LUGÃO, A. B.; IKEDA, T. I.; CRUZ, Á. S. Teste in vitro de Citotoxicidade: Estudo Comparativo entre Duas Metodologias. Mat Reserch. v. 6, n. 3, p-317-320, 2003. SILVA, V. F. Padronização do teste de ativação de monócitos para detecção de pirogênios in vitro em substituição ao teste in vivo: verificação da aplicabilidade do ensaio à vacina meningocócica C conjugada. 2017. 123 f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Imunobiológicos) - Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2017. TEMENOFF, J. S.; MIKOS, A. G. Biomaterials. The Intersection of Biology and Materials Science. 1. ed. New Jersey: Pearson Prentice Hall, 2008. YANG, L.; LI, J.; ZHANG, W.; JIN, Y.; ZHANG, J.; LIU, Y.; YI, D.; LI, M.; GUO, J.; GU, Z. The degradation of poly(trimethylene carbonate) implants: The role of molecular weight and enzymes. Polymer Degradation and Stability, Vol. 122, p.77-87, 2015.