Especialização em Hematologia Laboratorial - Anemias

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CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM HEMATOLOGIA LABORATORIAL

Aula Anterior: extensão sangüínea pré-analítico

Entrevista

Questionário  Qual a utilidade para você, do uso da quantificação do

grau de anisocitose, pecilocitose, micro/macro e formas eritróides no diagnóstico das anemias?  Entrevistado 1 = Entre + e ++ não considera. Acima de +++ = pesquisa possível causa Formas eritróides são mais indicativas que aniso/pecilo Macro/micro = Só pelo valor de VCM  Entrevistado 2 = não utiliza para diagnóstico a quantificação, a não ser que alguma forma eritróide relatada seja importante. O relato correto de formas eritróides é mais importante

Questionário  Qual o parâmetro você melhor observa para

o diagnóstico ou definição de um quadro de anemia? O que ele ajuda no diagnóstico?  Entrevistado 2 – hemograma como um todo e os valores dos índices  Entrevistado 1 = Ht/Hb – VCM e HCM Classifica a anemia e procura causa CHCM – não avalia

Questionário  Você vê a necessidade do uso do RDW como

novo parâmetro de diagnóstico?  Entrevistado 2 – Acha interessante , porém não tem conhecimento para usá-lo  Entrevistado 1 – é mais um valor agregado, já usa, vê discrepâncias mas acha útil

Questionário  Quais as etiologia de anemias que você mais

atende?  Entrevistado 2 – ferropriva (mulher) Anemia por deficiência de vit B 12 Beta talassemia, Hemolíticas (raras)  Entrevistado 1 – Anemia ferropriva (mulher), Anemia por doença crônica talassemia

Questionário  Qual a sua posição frente ao laudo que

possui a observação “ dupla população eritróide”?  Entrevistado 1 – nunca viu.

 Entrevistado 2 – Sim , Vê o contexto.

Questionário  Para você existiria uma melhor forma de quantificar as alterações hematológicas, descritiva ou em cruzes?  Entrevistado 1 – indiferente  Entrevistado 2 – não vê diferença

Questionário  Você concorda do laboratório frente ao quadro

hematológico, sugerir um exame complementar?  Entrevistado 1 – sim, concordo não vê problema, e acha necessário maior integração entre os setores  Entrevistado 2 – não, laboratório descreve, médico interpreta. Acha necessário maior entrosamento depende do tipo do médico

Questionário  Você tem conhecimento da evolução dos

aparelhos automatizados e suas variações em novos parâmetros hematológicos?  Entrevistado 1 –Não  Entrevistado 2 – Não

CRITÉRIOS DE LIBERAÇÃO DIRETA DO HEMOGRAMA

Critérios a serem avaliados:

Critérios para confecção de lâmina

Razões para se analisar uma lâmina:

Parâmetros utilizados para a realização da extensão sanguínea

Metodologia do trabalho

Metodologia do trabalho

Metodologia do trabalho

Conclusão:

 13.298 lâminas

analisadas

 15 laboratórios

envolvidos  1000 lâminas por laboratório  Todos os resultados foram analisados por um Cômite de

Experts

Critérios utilizados como verdadeiros positivos pelo Cômite

Regras x Extensão sanguínea  Regra atingida – Achados positivos na

extensão = Positivo Verdadeiro  Regra atingida – não encontra-se achados da regra na extensão – Falso Positivo  Regra não atingida – achados positivos na Extensão – Falso Negativo  Regra não atingida – não encontra-se acahdos da regra na extensão – Negativo Verdadeiro

Resultados:

Causas de Falso negativos

Regras estabelecidas no trabalho:

Regras estabelecidas no trabalho:

COMPARANDO CRITÉRIOS

DÊ SUA OPINIÃO............

PLAQUETAS MÉTODOS DE CONTAGEM E ANÁLISE CELULAR

Antes da automação  Contagem de plaquetas

Método de Rees-Ecker:Câmara de Neubauer, visualização microscópica. Método de Fônio(indireto): Em extensão sangüínea – relação com o número de eritrócitos  Análise morfológica das plaquetas

Método de Rees-Ecker  Técnica:

20 ul de sangue total + 2 mL de corante de Rees-Ecker Corante de Rees-Ecker 3,8 g citrato de sódio 2 mL de formol a 40% 0,05 g de azul de cresil brilhante H2O (q.s.p. 100 mL

Método de Fônio

Contam-se as plaquetas em campos com número conhecido de eritrócitos, Realiza-se regra de três para obter o numero de plaquetas na quantidade total de eritrócitos Contados para o hemograma

Exemplo:  Contagem em 10 campos:

100 plaquetas em 2.000 eritrócitos Eritrócitos : 4.000.000/mm3 Regra de três: 100 plaquetas ----------- 2.000 eritrócitos Xplaquetas -------------- 4.000.000 eritrócitos X= 200.000 plaquetas

Depois da automação  Plaquetograma

- Contagem de plaquetas - Medida do tamanho plaquetário (VPM) - Hematócrito das plaquetas- Plaquetócrito - Indice de variação do tamanho das

plaquetas (PDW) Tecnologia a laser Tecnologia por impedância elétrica

VPM x PDW  Histogramas de plaquetas

VPM: Volume Plaquetário  VPM alto: trombose, estimulação da

produção de tromboxane, ADP. Condições genéticas: Sindrome de Bernard Soulier  VPM baixo: anemia ferropriva, anemia por deficiência de folato

Histograma de plaquetas

Grupos de estudo  Grupo 1: colesterol acima de 240 mg/dL e ou colesterol LDL acima de 160 mg/dL  Grupos 2: triglicerídeos acima de 150

mg/dL  Grupo 3 : colesterol acima de 240 mg/dL e triglicerideos acima de 150 mg/dL  Grupo controle: normolipêmico

Parâmetros Plaquetários

Parâmetros Plaquetários

Parâmetros Plaquetários

PDW: nas anemias

MAS, ...........

Anemias macrocíticas  VCM alto

- Deficiência de vitamina B 12 e ácido fólico - Alcoolismo - Hepatopatias - Coquetel HIV

DEFEITOS DE MATURAÇÃO DO NÚCLEO

Anemias macrocíticas

Anemias macrocíticas  Vitamina B 12 e ácido fólico

Macrócitos de aspecto oval: macroovalócitos Policromasia: rara ( não são reticulócitos) Hipercrômicos Presença de neutrófilos com 5 ou mais lobos (hipersegmentação) Observações: Macroovalócitos aparecem antes da elevação do VCM

Aspectos morfológicos

Anemia megaloblástica  RBC, HGB e HCT: diminuídos

 Aumento de VCM e HCM  RDW: alto  Técnica para confirmação de hipersegmentação neutrofílica  Diagnóstico diferencial: dosagem de ácido

fólico e vitamina B 12.

Anemia macrocítica: hepatopatia e abuso no consumo de álcool  Macrócitos não ovais

 Neutrofilos hipersegmentados: raros  Células em alvo: codócitos  Estomatócitos: alguns casos  Insuficiência hepática: acantócitos  RDW: geralmente normal

Anemia macrocítica: drogas que interferem na síntese do DNA

 Macrocitose com ou sem anemia: maioria dos casos sem anemia

 Estomatócitos  Neutrófilos hipersegmentados: raros

Avaliação de neutrófilos hipersegmentados  3 formas - Herbert = Número total de lobos nucleares de

100 neutrófilos divididos por 100 - Arneth = Estudo da porcentagem de células com 1 a 5 lobos ou mais em 100 neutrófilos - Ìndice de segmentação de neutrófilos = número de células com mais de 5 ou mais lobos multiplicado por 100, dividido pelo número de células com 4 lobos

Valores de referência  Herbert = até 3,42 para a média de lobos  Arneth = até 4 % de células com 5 lobos  Índice de segmentação = até 16,9%

Metodologia  Lâminas: concentrado de leucócitos X extensão do hemograma  Dosagem de ácido fólico: 3,0 a 17,0 ng/mL  Dosagem de vitamina B 12: 200 a 950 pg/mL

Resultados

Importância do achado morfológico  Marcador

precoce da deficiência de folato e vitamina B 12

• Metabolismo do ferro •Parâmetros tradicionais de diagnóstico do status do ferro •Limitações de diagnóstico •Novas tendências para o diagnóstico da deficiência de ferro

DEFICIÊNCIA DE FERRO

Deficiência de Ferro Anemia ferropriva  Causada por deficiência de ferro  Microcítica e hipocrômica  Estoques de ferro baixo  Freqüente em crianças e gestantes

Metabolismo do Ferro Ferro:  Participa de vários processos vitais  Mecanismos oxidativos celulares(citocromos, peroxidases, etc)  Transporte de oxigênio

Metabolismo do Ferro

Metabolismo do Ferro  Necessidades diárias de ferro: • Homem adulto = 10 mg/dia

perda diária = 0,9 mg • Mulher adulta = 18 mg/dia perda diária = 0,4 mg/dia Período menstrual = 1,3 mg/dia Gravidez/Lactação = 4 mg/dia

Distribuição de ferro

Absorção de Ferro  Absorção do ferro : maior quantidade no

jejuno e duodeno  pH ácido : pH do estômago, ácido ascórbico ( Forma reduzida Fe +2, solúvel)  Absorvido : Liga-se a proteína de transporte (transferrina)  Restante : Liga-se a apoferritina (ferritina e hemossiderina para estoque)

Absorção de Ferro

Lumen Intestinal

Célula Intestinal

Plasma

Absorção de Ferro  IRF – Fator regulador de ferro:

(citoplasma de praticamente todas as células) • Sensor da concentração intracelular de

ferro • Controla a síntese de proteínas de absorção, utilização (transferrina) e estoque (ferritina)

Absorção de Ferro  IRF – fator regulador de ferro:

Sobrecarga : - diminui os receptores de transferrina (utilização e transporte) - aumenta ferritina ( estoque ) Depleção : - aumenta receptores de transferrina - diminui a ferritina

Absorção de Ferro

IRF: Atua na síntese de proteínas

Transferrina

Transferrina: 3 formas

•Sem ferro: apotransferrina •1 atomo de ferro: monotransferrina •2 atomos de ferro: • ditransferrina

Deficiência de Ferro

Hemocromatose

< 16% IST

Receptor de Transferrina Receptor De Transferrina

Deficiência de ferro  Afinidade da Transferrina com o receptor depende da sua saturação:  Apotransferrina: mínima afinidade

 Di-transferrina: máxima afinidade  Consequência: aumento de receptor de transferrina livre  RTfR – Marcador de deficiência de Ferro,

mesmo sem anemia

Diagnóstico da deficiência de ferro  Testes de diagnóstico da deficiência de ferro: • Tradicionais

1- Ferro Sérico * 2- TIBC 3- IST 4- Ferritina**

Metabolismo de Ferro

Metabolismo de Ferro  Valores de Normalidade

1 – Ferro sérico : 50 a 150 ug/dL 2 – CTLF – 250 a 450 ug/dL 3 – IS – 28 a 35 %

4 – Ferritina - 18 a 300 ng/mL 5 – Receptor de transferrina – 0,8 ug/dL a 1,6 ug/dL

Metabolismo de Ferro

Deficiência de Ferro  Desenvolve-se em estágios:

1 – Depleção dos estoques: sem anemia e microcitose

2 – Deficiência de ferro (eritropoiese ferro-dependente): Hb normal/parâmetros bioquímicos alterados 3 – Anemia Ferropriva : Hb baixa/ anemia e microcitose

Metabolismo de Ferro

Metabolismo de Ferro

Diagnóstico da deficiência de ferro  Parâmetros de diagnóstico

1 – Ferro sérico – sofre influências de: • 40% de variação diária (Variação circadiana) • Interferência nas metodologias -Dissociação incompleta de suas proteínas -pH utilizado (dissociação) -Contaminação do material de laboratório • Presença de processos infecciosos : diminuição • Doenças hepáticas: aumento

Diagnóstico da deficiência de ferro 2 – CTLF – capacidade total de ligação do ferro • Limitações semelhantes ao ferro sérico • Geralmente aumentado na anemia

ferropriva Dosagem de transferrina:ELISA

Diagnóstico da deficiência de ferro 3 – Saturação de Transferrina (ST%) • Relação ferro/ CTLF • Limitações das dosagens que a compõe

• ST abaixo de 16%: indica deficiência de

ferro

Diagnóstico da deficiência de ferro

4 – Ferritina • Forte correlação com os estoques de ferro • Métodos de alta precisão • Valores reduzidos : depleção de ferro • Valores aumentados : infecções, doenças hepáticas, leucemias. Etc • Proteína de fase aguda, o que limita sua utilização nestas condições

Diagnóstico da deficiência de ferro

5 – Receptor de transferrina • -não sofre influência na gestação, processos inflamatórios e infecciosos • Depleção de ferro – concentração aumenta • Relação RtF/Ferritina – utilizado no diagnóstico de depleção de ferro

Utilidade clínica dos testes convencionais

Sensibilidade/especificidade/ eficiência

Sensibilidade/especificidade/ eficiência

Falso Positivo: testes tradicionais

Diagnóstico da deficiência de ferro

 Diagnóstico de deficiência de ferro

1 – Não existe exame simples e único para o diagnóstico 2 – Ferro sérico perdeu importância e dosagens que dependam dele 3 – Devem ser feitas combinações de parâmetros 4 – Ferritina – Excluir possibilidade de processo agudo 5 – Receptor de Transferrina – não sofre influências como a ferritina 6 – Relação TfR/Ferritina – boa sensibilidade

Médias entre os métodos de referência

Métodos automatizados

Métodos de referência

Conclusões e um alerta

Diagnóstico diferencial da anemia ferropênica e anemias de doenças crônicas  Anemias de doenças crônicas

- Ferro sérico baixo - Incorporação defeituosa do ferro a

hemoglobina - Estoques de ferro normais (ferritina) - Resposta inadequada da eritropoetina a anemia

Provável mecanismo

Diagnóstico diferencial  Marcadores de fase aguda

Proteína C Reativa Fator de necrose tumoral (TNF) Interferon Gama Interleucina 1 VHS Obs: diminuem a sensibilidade das UFC ao efeito da eritropoetina

Metodologia

Metodologia

Resultados:

Resultados

Reticulócitos  CH r = Concentração de hemoglobina no

reticulócito - Detecta estágios precoces da deficiência de ferro - Monitoramento de terapia com eritropoietina - Monitoramento de terapia com ferro

CHr – Exemplo de Uso  Tratamento de anemia ferropriva - Nível de HGB = 1 mês

1,0 g/dL Ex: 12 para 13 g/dL - CHr = 1 a 2 semanas ou menos

Tratamento de microcitose

Marcadores do grupo controle

Relação CHr/sTfR ( CRP < 5 mg/L)

Relação CHr/sTfR ( CRP > 5 mg/L)

Estágios da Deficiência de Ferro

Metodologia e Objetivos do trabalho  Definiu DF pelo coloração da Prússia : padrão ouro  Dividiu os pacientes em 3 grupos:

 DF: completa depleção do estoque de ferro  COMBI: deficiência de ferro com alguma doença associada  ACD: estoque de ferro normal associado

com doenças crônicas

Metodologia e Objetivos do trabalho  Avaliar a “performace” da ferritina para diferenciar DF, ACD e COMBI.  Avaliar a “performace” do TfR para

diferenciar DF, ACD e COMBI.  Avaliar a “performace” do TfR /log ferritina

para diferenciar DF, ACD e COMBI.

Relação Ferritina x sTfR

IDA= Ferro ACD = crônica

Comportamento: IndiceTfR-Ferritina

Síntese da Hemoglobina

Diagnóstico diferencial das principais anemias microcíticas

USO DO RDW

Uso do RDW  Anemias Microcíticas

VCM < 80 FL RDW Normal :  Talassemia Menor  Anemia de Doença Crônica

RDW Alto :  Anemia por Deficiência de Ferro

Diagnóstico Diferencial Teste

Ferropenia

Talassemia

Inflamatória

VCM





N

RDW



N

/ N

HCM

+++

+

NO

Ferro



N/



IST



N

N

Ferritina



N/ 



Deficiência de Ferro X Talassemia Menor

 Principais causas de anemias microcíticas  Dependente da localidade  Exames complementares  Índices eritrocitométricos  VCM x RDW  Diagnóstico correto  Tratamentos desnecessários

Anemia Ferropriva/ Beta Talassemia Menor: Microcítica e hipocrômica

Maior causa de tratamentos desnecessários

DEFICIÊNCIA DE FERRO Características clínicas e laboratoriais

Observação 1  Heterogenicidade da deficiência de Ferro

Observação 2  Testes de diagnóstico da ferropriva

Tradicionais 1- Ferro Sérico * 2- TIBC 3- IST

4- Ferritina**

Observação 3

Observação 4

Síntese da Hemoglobina

BETA TALASSEMIA MENOR Características clínicas e laboratoriais

Síntese da Hemoglobina

Beta –Talassemia Menor  Quadro característico

1- VCM : abaixo de 70 fL 2- HCM : abaixo de 24 pg 3- Grau de anisocitose discreto 4- Eritrócitos : acima de 5 milhões 5- Ponteado basófilo

Observação 2 -Talassemia  Exames complementares

1- eletroforese de hemoglobina 2- metabolismo de ferro  Fonseca ( 1995) : Sobrecarga de ferro

RDW: parâmetro de diferenciação?

 Anemia ferropriva:

RDW alto  Beta Talassemia

Menor: RDW normal

Primeiros trabalhos:

Metodologia  85 pacientes: todos com VCM abaixo de 70

fL  Grupo ferropênico: indice de saturação abaixo de 10%  Grupo beta-talassêmico: eletroforese com A2 acima de 3,7%  Grupo alfa-talassêmico: biologia Molecular após critérios de exclusão

Metodologia  RDW : acima de 14%

 Indice : VCM – 5.(Hb) – RBA – 3,4  VCM/RBC

 histogramas

Histograma: importância

Diferenciação: métodos

Uso do RDW

Equipamento: Cell-DYn 1600



Carmen Silva (Unicamp – SP)

USO do RDW  Deficiência de

ferro:

Acima de 21 %

 Beta talassemia

Menor:

Indice não tem grande utilidade

USO DO RDW

USO DO RDW

Uso do RDW

Cell-DYn 3000 Melo, 2002

Uso do RDW  Conclusões do estudo

1- Somente o RDW não é confiável 2- O RBC acima de 5 milhões (marcador)

3- Necessidade de melhor metodologia

Uso do RDW

Failace, 2003

Cell-DYn, 4000

Uso do RDW Hemácias/RDW (%) 8,00

Hemácias (milhões)

7,00

6,00

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0

5

Beta Talassemia Menor

10

Traço Falciforme

15

20

Deficiência de Ferro

25

RDW (%)

30

Uso do RDW  Conclusões

1- RDW só diferencia em casos de elevação extrema 2- RBC é melhor marcador 3- RDW pouco acima da referência não é confiável 4- Equipamento : Coulter STKS 5- Railson/ Amauri A. Leite, 2003

USO DO RDW

Metodologia utilizada

RESULTADOS

USO DO RDW

RDW: pós tratamento na DF

FÓRMULAS MATEMÁTICAS ÚTEIS NA DIFERENCIAÇÃO ENTRE ANEMIAS FERROPRIVAS E BETA TALASSEMIAS MENOR

Formulas matemáticas

Algumas fórmulas TalassemiaX Ferropriva  Green : VCM2 x RDW/ Hb x 100

Talassemia Ferropriva Talassemia Ferropriva Talassemia Ferropriva

< 65 > 65 ( Coulter) < 73 > 73 Sysmex E – 5000 < 73 > 73 Technicon H. 1

Fórmula de Green Carmen, Unicamp-SP

USO DO RDW

 Fórmula : VCM –( Hb . 5) – RBC

Talassemia < 0 Ferropriva > 0 Obs. : Coulter (impedância)

Índice de England

Índice de England  Failace, 2003 ( Cell-Dyn 4000)

Média ferropriva : 16,2 Média talassemia : - 6,7

Obs. Nenhum caso discrepante

Anemia ferropriva/beta talassemia menor  Conclusões

1- Quadro heterogêneo da deficiência de ferro 2- Quadro característico da talassemia 3- Automação somente não é metodologia confiável 4- Uso de fórmulas é recomendado 5- Aparelho interfere na interpretação

 Objetivo: Determinar a eficiência da relação

MICRO/HYPO como diferencial Deficiência de Ferro e Beta Talassemia

Conclusões  Deficiência de Ferro = HYPO > 10%  Beta Talassemia = MICRO 20%

 Relação MICRO/HYPO

< 0,9 – indicativo de deficiência de Ferro > 0,9 – indicativo beta talassemia menor

DEFICIÊNCIA DE FERRO ESTÁGIO INICIAL HGB = 11,6 G/DL RBC = 4,52 VCM = 78,6 FL HGB conc. = 326 g/L HYPO = 15,4% MICRO = 3,7% M/H = 0,2

DEFICIÊNCIA DE FERRO ESTÁGIO ANEMIA HGB = 6,8 G/DL RBC = 3,75 VCM = 70,6 FL HGB conc. = 246 g/L HYPO = 71,1% MICRO = 21,3% M/H = 0,3

BETA TALASSEMIA MENOR HGB = 13,3 g/dL RBC = 6,18 VCM = 67,2 fL HGB conc. = 321 g/L HYPO = 4,5% MICRO = 21,6% M/H = 4.8

BETA TALASSEMIA MENOR HGB = 11,1 g/dL RBC = 6,27 VCM = 56,8 fL HGB conc. = 313 g/L HYPO = 10,6% MICRO = 66,3% M/H = 6.3

Diagnóstico das Anemias II  Normocíticas

VCM de 80 a 97 fL RDW normal : Anemia de doença crônica Insuficência Renal crônica RDW alto : Anemia Sideroblástica Síndrome Mielodisplásica

Diagnóstico das Anemias III  Macrocíticas

VCM > 97 fL RDW Normal : Alcoolismo, Hepatopatias Anemia Aplástica Drogas Antivirais RDW Alto: Megaloblástica Hemólise

Anemias Hemolíticas CONSIDERAÇÕES LABORATORIAIS

Anemias hemolítica auto-imune  Características dos anticorpos envolvidos:

A - IgG = Autoanticorpos quentes Ativa complemento (C3b) Soro de Coombs poliespecífico:positivo - Dependente da quantidade de IgG ligado ao eritrócito

Teste de Coombs

Teste direto

Teste direto de Coombs

Teste indireto

Teste indireto

Teste direto de Coombs  1 a cada 10.000 indivíduos normais: Coombs     

positivo 10% da anemias com características de hemólise: Coombs negativo Motivo: limitação metodológica Teste tradicional: detecta cerca de 300 moléculas de IgG por célula Entre 100 a 200 moléculas: hemólise significativa Métodos automatizados: a partir de 100 moléculas

Teste de Coombs

Anemias hemolítica auto-imune  Características dos anticorpos envolvidos:

A - IgM = Autoanticorpos Frios Ativa complemento (C3b) Entre 4 a 20ºC Nas lavagens: IgM se perde Soro de Coombs poliespecífico:positivo

Anemias hemolítica auto-imune  Características dos anticorpos envolvidos:

A - IgG de Donath-Landsteiner = Se liga ao eritrócito abaixo de 20ºC Ativa o complemento a 37º C

Crioaglutininas  Crioaglutininas: Predominante IgM

Aspectos clínicos;  Crônica: anemia moderada, esplenomegalia, icterícia - Cianose em extremidades - Mais comum em idosos  Transitória: - Sindrome hemolítica aguda - Após infecções: M.pneumoniae, Epstein-Barr, citomegalovírus, gripe A

Suspeita de Crioaglutininas

Aspectos laboratoriais  Aglomerado de  

 



eritrócitos Policromatofilia Esferócitos Elevação do VCM Histograma com duas populações Teste de Coombs direto:positivo

Não confundir com roleaux

Dependente do título

Resultados Paciente com crioaglutinina a 20 ºC

Pontilhado: paciente controle

Resultados  Linha completa:

-a 37º C - VCM: 85 fL  Linha pontilhada: - A 26º C - VCM: 97 fL  Linha em círculos: - A 20º C - 110 fL

Relato dos casos

Relato dos casos

Avaliação