TOZETTO,_A tese boa pg 21 a 37

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ADRIANA TOZETTO

CONTROLE DE QUALIDADE DE EDULCORANTES EM ADOÇANTES COMERCIAIS VIA ESPECTROMETRIA E MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

PONTA GROSSA 2005

ADRIANA TOZETTO

CONTROLE DE QUALIDADE DE EDULCORANTES EM ADOÇANTES COMERCIAIS VIA ESPECTROMETRIA E MÉTODOS DE CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA

Dissertação apresentada como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos, no Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Orientadora: Profa. Dra. Noemi Nagata Co-orientador: Prof. Dr. Ivo M. Demiate.

Ponta Grossa 2005

Ficha catalográfica elaborada por Cristina Maria Botelho- UEPG/BICEN

Tozetto, Adriana Controle de qualidade de edulcorantes em adoçantes comerciais via espectrometria e métodos de calibração multivariada / Adriana Tozetto. Ponta Grossa, 2005. 1144 f.

T757

Dissertação (mestrado)- em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Orientadora: Profa. Dra. Noemi Nagata Co-orientador: Prof. Dr. Ivo M. Demiate. 1-Análise multivariada. 2-Edulcorantes artificiais. 3Edulcorantes naturais. I.T. CDD: 664.117

Dedico esta dissertação à minha filha Amanda, meu marido Jean e minha mãe.

AGRADECIMENTOS

À Deus pelo dom da vida...

À meu companheiro Jean, o qual considero meu anjo. Obrigada pelo carinho e compreensão em todos estes anos.

À minha amada filha Amanda ....... Cor, brilho da minha vida.

À minha querida mãe pelos ensinamentos: como dedicação e perseverança.

Às minhas irmãs Ana Lúcia e Luciana pelo apoio.

À minha Orientadora Noemi agradeço pelos ensinamentos, pela sua dedicação em nosso trabalho e pela convivência.

Ao meu Co-orientador Ivo pelas preciosas contribuições tanto em nosso trabalho quanto na minha vida profissional.

Ao Prof. Carlos C. Stadler pelo incentivo, pois sem ele provavelmente não teria ingressado no curso de Mestrado.

À Prof. Neiva pelos ensinamentos e conselhos, os quais sempre foram transmitidos de forma carinhosa.

Ao Prof. Gilvan pela excelente coordenação deste curso de Mestrado.

À todos os meus colegas de curso, mas principalmente ao meu amigo Marcelo por todos estes anos de convivência.

À todos os funcionários do laboratório de Alimentos pela colaboração.

RESUMO

Nos últimos vinte anos, o consumo de alimentos diet e light tem aumentado sistematicamente, o que tem propiciado o constante desenvolvimento de produtos desse gênero. Grande ênfase tem sido dada àqueles produtos que substituem sacarose por um edulcorante de baixo conteúdo calórico. Sendo assim, torna-se necessário o desenvolvimento de técnicas rápidas, versáteis e de baixo custo para o controle de qualidade destes produtos.A Espectroscopia de Infravermelho Médio (FTIR-médio) e a Espectroscopia UV-Visível (UV-Vis) apresentam um conjunto de favoráveis características as quais deveriam garantir suas condições de ferramentas analíticas de primeira importância. No entanto, problemas como complexidade espectral e falta de seletividade, inviabilizam a utilização destas técnicas no controle de qualidade de produtos diet e light.A primeira parte deste trabalho descreve um estudo que objetiva avaliar a eficiência da Análise por Componentes Principais (PCA) associada com FTIR-médio para a classificação, certificação e caracterização da presença de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de mesa comerciais. Bons resultados foram obtidos, principalmente na classificação e distinção dos diferentes veículos que compõem este tipo de amostra, sendo possível observar uma tendência de análise semi-quantitativa dos mesmos. Características como rapidez, baixo custo e eficiência fazem desta técnica uma excelente opção para a análise qualitativa sugerida.A segunda parte deste trabalho tem por objetivo avaliar o método de Regressão de Mínimos Quadrados Parciais nas suas duas modalidades (PLSR1 e PLSR2) e Regressão por Componentes Principais (PCR) associadas com a técnica de UV-Vis na determinação quantitativa de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de mesa. Amostras com composição lactose/aspartame e lactose/esteviosídeo foram analisados via UV-Vis e a utilização de técnicas multivariadas permitiu contornar os problemas de intensa interferência espectral, principalmente para a análise dos edulcorantes intensos. Os modelos PLSR apresentaram melhor capacidade de previsão, sendo que o processo de otimização realizado de maneira particular (sistema PLSR1), demonstrou ganho significativo de eficiência nas análises quantitativas apenas para lactose/esteviosídeo. Palavras-chave: Análise Multivariada, Edulcorantes Artificiais e Naturais

ABSTRACT

In the last twenty years, the use of “diet” and “light” foods has been systematically increased, resulting in a constant development of products of this kind. Emphasis has been done to products that replace sucrose by sweeteners with low caloric contains. For this reasons the development of fast, versatile and low cost methodologies for the quality control of these products is absolutely necessary. Mid Infrared Spectroscopy (FTIR-mid) and UV-Visible Spectroscopy (UV-VIS) show a collection of favorable characteristics, which should guarantee a relevant position as analytical tool. However, problems related to spectral complexity and low selectivity usually makes unfeasible the use of these techniques in the quality control of " diet " and " light " products.The first part of this work describes a study that aims to evaluate the efficiency of the Principal Component Analysis (PCA) in the classification, certification and characterization of natural and artificial sweeteners in commercial products using mid-FTIR spectroscopy. Satisfactory results were obtained, mainly for classification and differentiation of the solvents, with tendency of semiquantitative analysis. Characteristics as speed, low cost and accuracy make this methodology an ideal choice for the quality control monitoring.The second part of this work describes a study that aims to evaluate the efficiency of the Partial Least Squares in two modalities (PLSR1 and PLSR2) and the Principal Component Regression (PCR) in the quantification of natural and artificial sweeteners in commercial products by UV-VIS spectroscopy.Commercial sweeteners with lactose/aspartam and lactose/steviosideo compositions were analyzed by UV-VIS using the multivariate techniques to resolve the serious overlapping problems, mainly in the analysis of intense sweeteners. The PLSR models present the best prevision capacity in the analysis of the studied systems. Additionally, the efficiency of the models was not significantly improved by the use of the PLSR1 system. Key-words: Multivariate Calibration, Sweetners

LISTA DE FIGURAS Figura 1

- Estrutura química do Esteviosídeo.............................................................

24

Figura 2

- Estrutura química do Aspartame................................................................

26

Figura 3

- Estrutura química da Sacarina Sódica, Sacarina Cálcica e Sacarina.........

30

Figura 4

- Estrutura química do Ciclamato de Sódio, Ciclamato de Cálcio e Ácido Ciclâmico...................................................................................................

31

Figura 5

- Estrutura química do Acesulfame-K..........................................................

35

Figura 6

- Estrutura química da Sucralose..................................................................

36

Figura 7

- Organização dos dados para Calibração Multivariada...............................

55

Figura 8

- Gráfico tridimensional do conjunto de dados composto por 35 amostras.

57

Figura 9

- (A) Gráfico tridimensional ilustrando os eixos das componentes principais. (B) Gráfico bidimensional da PC1 vs. PC2: scores representados por () e loadings por(----)................................................

58

- Estruturas químicas (A) Frutose, (B) Glicose, (C) Lactose e (D) Sacarose.....................................................................................................

75

- Espectro de infravermelho médio para as 22 amostras (Tabela 5) analisadas via PCA na região espectral entre 400 cm-1 a 4000 cm-1.........

76

- Gráfico de scores para as 1a e 2a componentes principais na análise de adoçantes de mesa......................................................................................

77

- Espectro de infravermelho médio para a amostra 5 e 6 na região espectral entre 752,19 cm-1 a 1284,5 cm-1.

78

- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes principais na análise de adoçantes de mesa...............................................

80

- Espectro de infravermelho dos adoçantes de mesa nos comprimentos de onda entre 752,19 a 1284,5 cm-1. (A) veículo lactose, (B) veículo maltodextrina e (C) veículo sacarose.........................................................

81

- Espectro de infravermelho médio na região espectral de interesse para Lactose pura e Sacarose pura.....................................................................

82

- Gráfico de scores para as 1a e 2a componentes principais para a análise dos adoçantes de mesa na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6..........................................................................................

83

Figura 10

Figura 11

Figura 12

Figura 13

Figura 14

Figura 15

Figura 16

Figura 17

- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes principais para a análise dos adoçantes de mesa na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6....................................................

84

- 1a derivada dos espectros FTIR-médio de padrões de Aspartame, Lactose e Sacarose.....................................................................................

85

Figura 20

- Espectro UV-VIS de soluções-padrão de Lactose e Aspartame................

88

Figura 21

- Espectro UV-VIS para as 20 misturas sintéticas de lactose e aspartame utilizados para a etapa de calibração do modelo PLSR1, PLSR2 e PCR..

89

- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame..................................................

91

- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e aspartame (cinza) com espectro completo (canais 1 a 600).......................

91

- Desenvolvimento do modelo PLSR2 para Lactose e Esteviosídeo na análise de adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de regressão nos comprimentos de onda entre 200 a 240 nm (canais 1 a 40)............................................................

92

- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais na análise de lactose e aspartame....................................................................................

93

- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais para lactose e aspartame separados................................................................................

94

- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame..................................................

95

- Curva de calibração convencional para a determinação de aspartame em diferentes concentrações de lactose.................................................................

98

- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40)...

100

Figura 18

Figura 19

Figura 22

Figura 23

Figura 24

Figura 25

Figura 26

Figura 27

Figura 28

Figura 29

Figura 30

- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais para os padrões de calibração; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage............................... 101

Figura 31

- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR1 na análise de Aspartame................................................................ 103

Figura 32

- Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage................................................... 104

Figura 33

- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40).............................................................. 106

Figura 34

- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) Valores reais vs valores previstos; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage................................................... 107

Figura 35

- Espectro UV-Vis na região entre 200 e 400 nm para Lactose e Esteviosídeo............................................................................................... 110

Figura 36

- Espectro UV-Vis de todas as misturas sintéticas de lactose e esteviosídeo utilizadas no conjunto de calibração para os comprimentos de onda entre 200 e 800 nm....................................................................... 111

Figura 37

- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e esteviosídeo (cinza) (A) com espectro completo; (B) Faixa espectral entre 200 e 280 nm (canal 1 a 80).............................................................. 113

Figura 38

- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo............................................... 114

Figura 39

- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais lactose e esteviosídeo separadamente....................................................................... 114

Figura 40

- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo............................................... 115

Figura 41

- Calibração univariada realizada para a determinação de esteviosídeo em altas concentrações de lactose.................................................................... 117

Figura 42

- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage............................................... 119

Figura 43

- Valores previstos pelo modelo PLSR1 vs valores reais na análise de lactose........................................................................................................

119

Figura 44

- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR1 na análise de esteviosídeo.............................................................. 122

Figura 45

- Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A)

Valores reais vs valores previstos pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage................................................... 123 Figura 46

- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PCR na análise de lactose e esteviosídeo................................................... 125

Figura 47

- Valores previstos pelo modelo PCR vs valores reais na análise de lactose e esteviosídeo................................................................................. 126

Figura 48

- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PCR na análise de lactose e esteviosídeo................................................... 126

LISTA DE TABELAS Tabela 1

- Edulcorantes naturais e/ou artificiais e sua concentração máxima permitida pela legislação brasileira no produto final.................................

18

Tabela 2

- Misturas binárias de edulcorantes..............................................................

21

Tabela 3

- Utilização de método colorimétrico na análise de açúcar em alimentos....................................................................................................

48

Tabela 4

- Utilização de biosensores na análise de açúcares em alimentos................

49

Tabela 5

- Composição declarada pelos fabricantes das amostras comerciais de adoçantes....................................................................................................

70

Tabela 6

- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame utilizadas para construção dos modelos multivariados de calibração...................................................................................................

71

- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame utilizadas para validação dos modelos multivariados de calibração...................................................................................................

72

- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e esteviosídeo utilizadas para construção dos modelos................................

73

- Faixa de concentração de lactose e esteviosídeo para a etapa de validação....................................................................................................

73

Tabela 10 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos...........

96

Tabela 11 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR2

97

Tabela 12 - Concentrações de aspartame e lactose com absorbância em 212 nm obtida de misturas sintéticas utilizadas na construção na calibração convencional..............................................................................................

97

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 13 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Lactose....................................................................................................... 101 Tabela 14 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1 (lactose)...................................................................................................... 102 Tabela 15 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Aspartame.................................................................................................. 105 Tabela 16 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1

(aspartame)................................................................................................. 105 Tabela 17 - Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos............... 107 Tabela 18 - Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PCR....

108

Tabela 19 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1, PLSR2 e PCR.......... 108 Tabela 20 - Resultados da análise de lactose e aspartame em amostras de adoçante comercial via modelo PLSR1 previamente otimizado............................... 109 Tabela 21 - Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos........... 115 Tabela 22 - Resultados obtidos para o modelo PLSR2 na etapa de validação externa. 116 Tabela 23 - Concentrações de esteviosídeo e lactose com absorbância em 211 nm obtida de misturas utilizadas na construção na calibração convencional.. 117 Tabela 24 - Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos................

120

Tabela 25 - Resultados da validação externa obtidos para o modelo PLSR1 para Lactose....................................................................................................... 120 Tabela 26 - Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos................

123

Tabela 27 - Resultados obtidos para o modelo PLSR1 na etapa de validação externa para a determinação de esteviosídeo.......................................................... 124 Tabela 28 - Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos............... 127 Tabela 29 - Resultados obtidos para o modelo PCR na etapa de validação externa..... 127 Tabela 30 - Comparação entre as Metodologias PLSR1, PLSR2 e PCR...................... 128 Tabela 31 - Resultado de previsão para a amostra comercial obtido para o modelo PLSR1 para lactose e PLSR1 para esteviosídeo........................................ 128

LISTA DE SIGLAS ATR BP-ANN

Refletância Total Atenuada Redes Neurais via Back propagation

CG

Cromatografia Gasosa

CP

Componente Principal

CLAE

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CLS

Mínimos Quadrados Clássicos

DNS

Ácido Dinitrossalicílico

FAO

Food and Agriculture Organization

FDA

Food and Drug Administration

FTIR-médio GRAS IDA JECFA/OMS

Infravermelho Médio com Transformada de Fourier Generally Recognized as Safe Ingestão Diária Admitida Comitê Conjunto de Especialistas em Aditivos Alimentares da Organização Mundial da Saúde

MLR

Regressão Linear Múltipla

NIR

Infravermelho Próximo

OMS

Organização Mundial da Saúde

PCA

Análise por Componentes Principais

PCR

Regressão por Componentes Principais

PLSR

Regressão de Mínimos Quadrados Parciais

PRESS

Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão

RBF-ANN RMSEP SST UV-VIS WHO

Redes Neurais via Radial Basis Function Raiz Quadrada da Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão Sólidos Solúveis Totais Ultra-Violeta Visível World Health Organization

SUMÁRIO 1

INTRODUÇÃO.......................................................................................

17

2 2.1 2.2 2.3

REVISÃO DA LITERATURA.............................................................. EDULCORANTE IDEAL......................................................................... LEGISLAÇÃO vs EDULCORANTES..................................................... EDULCORANTES AUTORIZADOS PELA LEGISLAÇÃO BRASILEIRA............................................................................................ Esteviosídeo............................................................................................... Aspartame.................................................................................................. Sacarina..................................................................................................... Ciclamato................................................................................................... Acesulfame-K............................................................................................ Sucralose.................................................................................................... MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DOS EDULCORANTES............... Edulcorantes Naturais................................................................................ Análises Físicas......................................................................................... Análises Químicas..................................................................................... Métodos Espectrofotométricos.................................................................. Métodos Titulométricos............................................................................. Métodos Cromatográficos......................................................................... Métodos Enzimáticos................................................................................ Métodos Espectrofotométricos.................................................................. Biosensores................................................................................................ Edulcorantes Artificiais............................................................................. CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA......................................................... Transformação de Dados........................................................................... Pré-Processamento de Dados..................................................................... Análise de Componentes Principais (PCA)............................................... Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e Regressão por Componentes Principais (PCR).................................................................

20 20 22

3 3.1 3.2

OBJETIVOS............................................................................................ OBJETIVOS GERAIS.............................................................................. OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................

67 67 67

4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.2.1 4.5.2.2

PARTE EXPERIMENTAL.................................................................... REAGENTES............................................................................................ MATERIAL VOLUMÉTRICO................................................................ EQUIPAMENTOS.................................................................................... PROGRAMAS COMPUTACIONAIS..................................................... PROCEDIMENTO ANALÍTICO............................................................. Amostras para o modelo PCA................................................................... Preparo das soluções para construção dos modelos PLSR e PCR............ Amostras com Associação de Lactose e Aspartame................................. Amostras com Associação de Lactose e Esteviosídeo..............................

68 68 68 68 69 69 69 70 70 72

5

RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................

74

2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.4 2.4.1 2.4.1.1 2.4.1.2 2.4.1.2.1 2.4.1.2.2 2.4.1.3 2.4.1.4 2.4.1.4.1 2.4.1.4.2 2.4.2 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4

23 23 25 29 31 34 35 37 37 38 39 39 42 42 45 45 48 50 53 55 56 57 61

5.1 5.1.1 5.2 5.2.1 5.2.1.1 5.2.1.1.1 5.2.1.1.2

ANÁLISE QUALITATIVA...................................................................... Análise por Componentes Principais (PCA)............................................. ANÁLISE QUANTITATIVA................................................................... Composição Lactose e Aspartame............................................................. Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame..... PLSR2........................................................................................................ PLSR1........................................................................................................ A) Lactose.................................................................................................. B) Aspartame............................................................................................. 5.2.1.2 Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame....... 5.2.2 Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo................................. 5.2.2.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo. 5.2.2.1.1 PLSR2........................................................................................................ 5.2.2.1.2 PLSR1........................................................................................................ A) Lactose.................................................................................................. B) Esteviosídeo.......................................................................................... 5.2.2.2 Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo....................................................................................................

74 74 87 88 89 89 98 99 103 105 110 111 111 118 118 121 124

6

CONCLUSÃO.......................................................................................... 130

7

REFERÊNCIAS......................................................................................

132

17

1

INTRODUÇÃO

Nos últimos vinte anos, o consumo de produtos light e diet vem aumentando sistematicamente, o que faz com que a indústria de gêneros alimentícios invista pesadamente em pesquisas orientadas à elaboração de novos produtos. Basicamente, estes produtos estão direcionados a pessoas que apresentam algum distúrbio no metabolismo de açúcares (ex: diabéticos) ou, mais recentemente, consumidores que estão em busca de produtos alimentícios de baixo teor calórico (NELSON, 2001). A regulamentação brasileira para estes produtos está definida pelas Portarias 27/98 e 29/98 da Secretária de Vigilância Sanitária, órgão do Ministério da Saúde. Segundo a Portaria 27/98, o termo light pode ser utilizado na rotulagem de alimentos em duas situações: a primeira considera apenas o conteúdo absoluto de nutrientes (sódio, açúcares, gorduras, colesterol ou valor energético), cujos teores considerados baixos são definidos como atributo que deve obedecer à legislação específica de cada alimento. A segunda situação compara os alimentos com teores reduzidos desses nutrientes a alimentos similares de um mesmo fabricante ou ao valor médio de três produtos similares de uma região. Essa comparação deve atender a uma diferença mínima de 25% do nutriente ou da caloria do produto. Ou seja, um produto que traga em seu rótulo a inscrição light não é suficiente para informar a sua identidade. Um produto pode ser light em relação ao conteúdo de gordura, mantendo a quantidade de calorias em comparação ao produto convencional. Segundo a portaria 29/98, os produtos diet são alimentos destinados a dietas com restrição de nutrientes e/ou podem ser empregados para o controle de peso. No caso das dietas com restrições, são raros os exemplos onde a ausência de um componente (carboidratos, gorduras, proteínas ou sódio) não seja obrigatória. Já os produtos destinados ao controle de peso apresentam dietas para suprir parcialmente as necessidades nutricionais de uma pessoa,

18

são destinados a reduzir ou manter o peso, quando utilizados em substituição às refeições, ou para ganhar peso, quando consumidos juntamente com as refeições. No lugar do termo diet, o rótulo do produto também pode usar expressões como: não contém, livre, zero, sem, isento de free, no, without (SUPER MIX, 2000). O enfoque deste trabalho será voltado a produtos diet e light, aqueles com restrição ou redução de carboidratos. Os produtos com estas características apresentam a adição de edulcorantes artificiais e naturais, cuja Resolução - RDC nº 3, de 2 de janeiro de 2001 estabelece os limites máximos permitidos pela legislação brasileira para tal adição em alimentos. A Tabela 1 traz os edulcorantes naturais e artificiais e sua concentração máxima permitida no produto final.

Tabela 1- Edulcorantes naturais e artificiais e sua concentração máxima permitida pela legislação brasileira no produto final. EDULCORANTE NATURAL

Limite máximo (g/100g ou g/100mL)

Sorbitol, xarope de sorbitol, D-sorbita

quantum satis

Manitol

quantum satis

Isomalta, isomalte, isomalt

quantum satis

Esteviosídeo

0,045 - 0,060

Maltitol, xarope de maltitol

quantum satis

Lactitol

quantum satis

Xilitol

quantum satis EDULCORANTE ARTIFICIAL

Acesulfame de potássio

0,026- 0,035 (0,20 goma de mascar)

Aspartame

0,056-0,075 (0,40 goma de mascar)

Ácido ciclâmico e seus sais de Ca, K e Na

0,097- 0,130

Sacarina e seus sais de Ca, K e Na

0,022- 0,030

Sucralose, tricloro galacto sacarose (TGS)

0,019- 0,045 (0,25 goma de mascar)

quantum satis: quantidade livre. FONTE: ANVISA, 2004

19

Dentre a ampla variedade de produtos destinados à restrição ou redução de carboidratos existentes para comercialização, os adoçantes de mesa tem apresentado um grande crescimento, tanto em termos de consumo quanto em termos da variedade de produtos disponíveis. A definição de adoçante de mesa segundo a Portaria nº 38, de 13 de janeiro 1998 refere-se a todo produto formulado para conferir o sabor doce aos alimentos e bebidas. No caso dos produtos formulados para dietas com restrição de sacarose, frutose e glicose (dextrose), estes são designados como "Adoçante Dietético". Estes adoçantes podem conter e ser formulados à base de edulcorantes naturais e ou artificiais permitidos pela legislação (Tabela 1), sendo permitida a utilização de veículos (excipiente, diluente ou solvente) com as propriedades de conferir volume e/ou proporcionar diluição à concentração conveniente, facilitando o seu uso. Os veículos autorizados são: Água,

Álcool

etílico,

Amidos,

Amido

modificado,

Dextrinas,

Dextrose,

Fruto-

oligossacarídeos, Frutose, Glicerina ou glicerol, Isomalte, Lactose, Maltitol e seu xarope, Maltodextrina, Manitol, Polidextrose, Polietileno glicol, Propileno glicol, Sacarose, Sorbitol. Outro aspecto importante para a comercialização de adoçantes de mesa está relacionado a sua rotulagem, pois é a partir das informações nela inserida que os consumidores irão optar pelo produto que atenda as suas necessidades. A rotulagem de adoçantes dietéticos deve possuir principalmente, o nome do(s) edulcorante(s); a quantidade de sacarose, glicose (dextrose) ou frutose, quando for o caso; nas formulações contendo aspartame indicar a presença fenilalanina; dentre outros (ANVISA, 2004).

20

2

REVISÃO DA LITERATURA

2.1 EDULCORANTE IDEAL A opção de consumir adoçantes diet e/ou light, está relacionada ao desejo de apreciar o sabor doce nos alimentos, diminuindo-se ou até mesmo evitando-se a ingestão de açúcares. De acordo com Verdi e Hood em 1993, para satisfazer completamente o consumidor é necessário que um edulcorante ideal seja utilizado. Este edulcorante ideal deveria ser uma cópia exata das propriedades sensoriais da sacarose, isto é apresentar as seguintes características: não ter gosto residual, promover as propriedades funcionais da sacarose sendo quimicamente estável, com baixo teor calórico, poder adoçante igual ou superior ao da sacarose, ser solúvel, não ser tóxica, nem carcinogênica e economicamente acessível. Infelizmente, nenhum dos edulcorantes comercialmente disponíveis combina todas essas características, mas estas limitações podem ser parcialmente superadas pelo uso de uma combinação de edulcorantes (HANGER; LOTZ; LEPENIOTIS, 1996; LIM; SETSER; KIM, 1989; MATYSIAK; NOBLE, 1991). Hanger, Lotz e Lepeniotis em 1996 reportaram que misturas de edulcorantes de alta intensidade (ou não nutritivos), isto é que fornecem somente doçura acentuada, propiciam um perfil de sabor que mais se aproxima da sacarose, uma vez que atributos como off-flavours, gosto amargo e gosto residual dos edulcorantes são minimizados. Outras vantagens obtidas através da mistura de edulcorantes são a redução dos custos devido ao sinergismo, a melhora do poder edulcorante, o aumento da estabilidade em sistemas aquosos e a redução da exposição a substâncias químicas (VERDI; HOOD, 1993). Embora a primeira mistura de edulcorantes com sucesso tenha sido a sacarina/ciclamato (GELARDI, 1987), muitos outros estudos têm sido desenvolvidos para tentar melhorar as características e obter uma mistura que represente um edulcorante ideal. (HUTTEAU et al., 1998).

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Hutteau et al., em 1998 realizaram um estudo prévio das características fisiológicas de misturas binárias de edulcorantes de corpo (fornecem energia e textura aos alimentos), sacarose e maltitol, e edulcorantes intensos, acesulfame K, aspartame e ciclamato de sódio. Foram observadas características como sinergismo (percepção de doçura maior na mistura), aditividade (percepção de doçura igual na mistura) e supressão (percepção de doçura menor que a soma das intensidades dos edulcorantes individuais) para as diferentes misturas, conforme revela a Tabela 2.

Tabela 2- Misturas binárias de edulcorantes. Mistura

Taxa edulcorante

Edulcorante de corpo: edulcorante intenso

Edulcorante de corpo: edulcorante intenso

Sacarose - ciclamato de Na

75:25

Maltitol - ciclamato de Na

50:50

Maltitol-acesulfame-K

75:25

Aditividade

Sacarose - acesulfame-K

75:25

Supressão

Sacarose - aspartame

25:75

Maltitol - aspartame

25:75

Sinergismo

FONTE: HUTTEAU et al., 1998.

A resposta fisiológica mostrou que misturas de edulcorantes de corpo com aspartame exibiram supressão do sabor doce, enquanto aqueles com ciclamato ou acesulfame-K tendem a ter propriedades sinérgicas ou aditivas, respectivamente. A Tabela 2 também mostra a taxa de edulcorante de corpo: edulcorante intenso, na qual estas misturas exibem sinergismo, aditividade ou supressão do sabor doce (HUTTEAU et al., 1998). Muitas empresas de refrigerantes utilizam misturas de sacarina/aspartame ou acesulfame-K/ aspartame para melhorar o sabor de seus produtos. Em solução aquosa a combinação sacarina-aspartame-ciclamato na taxa de 1:5:8, respectivamente, resulta em uma melhora da doçura e a qualidade do sabor (definido pela redução em sabores não doces),

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comparados a estes edulcorantes sozinhos (BAKAL, 1991). Já no caso da combinação ciclamato/sacarina, a doçura derivada do ciclamato mascara o gosto amargo da sacarina em refrigerantes carbonatados com uma mistura de 10:1 e ainda proporciona uma doçura próxima à sacarose (BAKAL, 1991; VERDI; HOOD, 1993). Iop, Silva e Beleia em 1999 utilizaram um modelo de mistura experimental para exemplificar a aceitabilidade de sobremesas com baixa caloria contendo uma mistura de edulcorantes com combinações simples, binárias e terciárias de sacarina, ciclamato e esteviosídeo. O modelo incluiu diferentes combinações de edulcorantes de acordo com os limites estabelecidos pelas leis alimentares brasileiras. A mistura na sobremesa propicia uma diminuição calórica de 37 % quando comparada a um pudim adoçado com sacarose, e a textura equivalente dos produtos comerciais foi reproduzida com a adição de 0,01g/100mL de carragena. A adição de carragena foi necessária devido ao aumento da sinerese quando o açúcar é removido de sobremesas baseadas em amido. Dentre as combinações de edulcorantes testadas, a mais aceita pela avaliação sensorial foi sacarina/ciclamato na proporção de 0,755 : 0,245.

2.2 LEGISLAÇÃO vs EDULCORANTES Atualmente, existe uma preocupação muito grande relacionada à segurança na ingestão destes edulcorantes. Investigações sobre seus efeitos na espécie humana são cada vez mais importantes, uma vez que a procura por produtos contendo tais edulcorantes cresce a cada dia. Os edulcorantes artificiais, acesulfame-K, aspartame, ácido ciclâmico, sacarina, e neohesperidina são autorizados pelo Comitê Cientifico Europeu de Alimentos, como aditivo alimentar e também em adoçantes. Eles possuem um valor de ingestão diária aceitável (IDA –

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quantidade de um determinado composto que pode ser consumido diariamente, com segurança, durante toda a vida) de 0-9, 0-40, 0-11, 0-5 e 0-5 mg/Kg de peso corporal, respectivamente (GARNIER-SAGNE; LEBLANC; VERGER, 2001). Os edulcorantes de baixa caloria aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) são quatro: sacarina, aspartame, acesulfame-K e sucralose. No entanto, existem outros dois que estão em fase de avaliação, o alitame e o ciclamato.

2.3 EDULCORANTES AUTORIZADOS PELA LEGISLAÇÃO BRASILEIRA

2.3.1 Esteviosídeo Esteviosídeo é um edulcorante natural de alta intensidade, não nutritivo e extraído das folhas de Stevia rebaudiana (Bertoni), uma planta nativa do nordeste do Paraguai. Trata-se de um pó branco, cristalino e sem odor o qual é aproximadamente 300 vezes mais doce que a sacarose (SOEJARTO et al., 1983), com estrutura química conforme Figura 1. Está comercialmente disponível e é utilizado em muitos países incluindo Japão e alguns países da América do Sul como adoçante em uma ampla variedade de alimentos e bebidas. No entanto, na comunidade Européia, este edulcorante não é utilizado devido à exigência específica da União Européia a respeito das avaliações de segurança. Nos últimos anos, pesquisas biomédicas, principalmente nos países Asiáticos, demonstraram que nenhuma atividade tóxica significativa do esteviosídeo foi observada em uma grande variedade de sistemas biológicos e confirmaram ainda, a falta de efeitos mutagênicos (SUTTAJIT et al., 1993), tóxicos subcrônicos (AZE et al., 1991), carcinogênicos (XILI. et al., 1992), teratôgenicos

(YODYINGUARD;

BUNYAWONG,

(YODYINGUARD; BUNYAWONG, 1991).

1991),

ou

contraceptivo

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Figura 1- Estrutura química do Esteviosídeo FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

O metabolismo do esteviosídeo em humanos foi esclarecido a partir da identificação de metabólitos na urina e fezes após sua ingestão (KRAEMER; MAURER, 1994). Poucos são os dados disponíveis para a aplicação prática do esteviosídeo em alimentos e bebidas. Na realidade, existe um conhecimento muito limitado da sua estabilidade em diferentes condições de processamento e estocagem, sua interação com outros ingredientes ou aditivos alimentares. Os dados disponíveis mostram que o esteviosídeo possui boa estabilidade em solução aquosa, molho de soja e proteína vegetal hidrolisada armazenada a 30º C por trinta dias (SHIRAKAWA, ONISH, 1979), assim como, em bebidas carbonatadas e acidificadas com ácido cítrico e fosfórico em temperatura inferiores a 37ºC por longos períodos de estocagem (CHANG, COOK, 1983). No entanto, uma pequena degradação foi observada para a estocagem em vinagres sob aquecimento a 80º C (SHIRAKAWA, ONISH, 1979).

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Kroyer em 1999 realizou um estudo da estabilidade do esteviosídeo sob diferentes condições de processamento e estocagem, além dos efeitos de sua interação com vitaminas aquo-solúveis (ácido ascórbico, tiamina, riboflavina, piridoxina e ácido nicotínico), ácido orgânicos (acético, cítrico, tartárico), ácido fosfórico, outros edulcorantes de baixa caloria (sacarina, ciclamato, aspartame, acesulfame-K, Neohesperidina Dihidrochalcona) e com a cafeína no café e chá. Os resultados deste estudo demonstram que o esteviosídeo apresentou boa estabilidade até 120ºC, e decomposição em temperaturas acima de 140ºC. Em soluções aquosas este edulcorante manteve-se estável em uma faixa de pH entre 2-10 mesmo com tratamento térmico de 80ºC. Porém, sobre condições de extrema acidez (pH 1), uma significativa diminuição da concentração do esteviosídeo foi detectada. Não foram observadas mudanças significativas durante estudos de interação do esteviosídeo com outros edulcorantes de baixa caloria (mesmo após 4 meses de estocagem a temperatura ambiente), cafeína e as vitaminas do tipo B em soluções aquosas à 80ºC, até 4 horas de incubação. No entanto, foi observado um efeito protetor do esteviosídeo na degradação do ácido ascórbico. Os estudos da estabilidade do esteviosídeo em soluções ácidas mostraram uma tendência no aumento da decomposição do edulcorante em baixos valores de pH, dependendo do tipo de ácido empregado. Em soluções de concentrações de 10 g/L de ácido acético (pH 2,6), ácido cítrico (pH 2,1), ácido tartárico (pH 2,1) e ácido fosfórico (pH 1,6) perdas na concentração de esteviosídeo de 2, 22 ,33 e 75% respectivamente, foram observada após 4 meses de estocagem.

2.3.2

Aspartame

O aspartame foi descoberto por acaso em 1965 por James Schlatter, pesquisador dos laboratórios Searle nos Estados Unidos, durante o desenvolvimento de um novo medicamento para o tratamento da úlcera. O aspartame é o éster metílico de dois aminoácidos, a

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fenilalanina e o ácido glutâmico, ou seja éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina, sua estrutura aparece na Figura 2 (CÂNDIDO;CAMPOS, 1996).

Figura 2- Estrutura química do Aspartame FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Este edulcorante é o único entre os de alto grau de doçura que é metabolizado, sendo digerido como qualquer dipeptídeo. As esterases intestinais hidrolisam o metiléster e logo as peptidases liberam os aminoácidos. Uma pequena quantidade do dipeptídeo desmetilado entra pelo sistema de transporte dos dipeptídeos, consegue entrar nos enterócitos e, a seguir, as enzimas proteolíticas das células da mucosa completam a hidrólise. Ao final, ingressa no sistema portal: L-fenilalanina, ácido aspartico e uma pequena quantidade de metanol. Estes componentes são utilizados pelo corpo da mesma maneira que quando derivados de outros alimentos, tal como carne, leite, frutas e vegetais (SCHOR; MAZZEI; SUDERA, 1993). Segundo Butchko em 2002, a ingestão dos produtos metabolizados do aspartame (Lácido aspártico, L-fenilalanina e metanol), não deveria acarretar problemas à saúde, uma vez que na alimentação normal as quantidades destes três componentes são muito superiores. Por exemplo, um copo de leite desnatado contém 6 vezes mais fenilalanina e 13 vezes mais ácido aspártico, enquanto um copo de suco de tomate contém 6 vezes mais metanol que um volume equivalente de bebida adoçado com 100% de aspartame.

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Além disso, a fenilalanina é um aminoácido essencial para o crescimento, manutenção e desenvolvimento da vida. Apenas indivíduos com uma doença genética rara, a fenilcetonúria, devem ter uma dieta rigorosa restringindo o consumo de fenilalanina (ODACT; TIMUR; TELEFONEU, 2004). A fenilcetonúria é uma desordem genética (autossômica recessiva) ocasionada pela ausência ou diminuição da atividade da Lfenilalanina-4-monooxigenase que catalisa a hidroxilação de fenilalanina a tirosina, o que acarreta aumento nos níveis de fenilalanina e torna a tirosina um aminoácido essencial. O excesso de fenilalanina é transaminado e sua presença ou de seus metabólitos causam danos cerebrais. No Brasil, estima-se que 1 entre 14 mil crianças apresentem o problema, há 450 casos registrados no Brasil, 50 dos quais no Paraná, o diagnóstico é feito através do teste do pezinho, realizado no Paraná desde 1980 (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996). O aspartame possui boa estabilidade quando seco (4,0 a 4,5 % de umidade) e em condições adequadas de armazenagem, o produto permanece mais de cinco anos sem apresentar qualquer alteração significativa. Porém na presença de umidade ou em solução, a ligação éster presente na molécula de aspartame é instável e sob certas condições de temperatura e pH pode ocorrer a conversão do aspartame em aspartilfenilalanina e/ou a sua forma cíclica dicetopiperazina (DKP) e pequenas quantidades de β-aspartame. A DKP pode continuar sua conversão até aspartilfenilalanina que, por fim hidrolisa-se até seus compostos aminoácidos. Estes produtos de conversão não são doces, e não conferem nenhuma alteração no sabor (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996). A limitada estabilidade do aspartame impede a sua aplicação em produtos a serem fritos, cozidos, ou seja, onde o aspartame seria exposto a altas temperaturas de processamento por um longo período de tempo (BASTIN, 2004). Mas ele pode ser utilizado em vários processos alimentícios, incluindo UHT (Ultra High Temperature) e HTST (High Temperature

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Short Time). Ficou demonstrado em vários casos reais que, mesmo a altas temperaturas, em curtos períodos de tempo a perda de doçura do aspartame foi insignificante, não chegando a 3%. Outra opção para produtos submetidos a longos períodos de processamento seria a adição do aspartame nos últimos minutos do processo de aquecimento a fim de evitar perdas (NUTRASWEET, 2003?). O processo de aprovação do aspartame iniciou nos Estados Unidos em 1973 sendo liberado pela FDA em 1974. A segurança no consumo do aspartame e seus constituintes metabólicos por humanos foram verificados através de intensivos estudos toxicológicos em animais, utilizando-se doses maiores que aquelas possivelmente consumidas por pessoas. Os estudos farmacológicos em animais não revelaram efeitos do aspartame sobre o sistema nervoso central, aparelho digestivo, endócrino e reprodutor, nem sobre a resposta inflamatória a doses que superam em muito as concentrações alcançadas no consumo humano. Com base nos resultados dos estudos de toxicologia foi constado que no caso do aspartame a quantidade máxima sem qualquer efeito adverso é de 2000 á 4000mg/Kg de peso corpóreo (BUTCHKO et al., 2002). Antes da aprovação pelos sistemas de regulamentação, a segurança no consumo do aspartame e das concentrações plasmáticas de seus componentes foi estudada em crianças e adultos sadios, assim como em indivíduos obesos e pessoas portadoras de diabetes, que seriam os consumidores habituais. Após exaustivas avaliações, os resultados indicaram que o aspartame não possui efeitos embriotóxicos, teratogênicos, carcinógenos nem outros efeitos indesejáveis relacionados com o uso (SCHOR; MAZZEI; SUDERA, 1993). Baseados nos estudos toxicológicos obtidos com animais (geralmente realizados com roedores durante toda a vida dos mesmos) o Comitê Conjunto de Especialistas em Aditivos Alimentares da Organização Mundial da Saúde (JECFA/OMS) estabeleceu que a IDA de

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aspartame seria de até 40 mg/Kg/dia, valor que também corresponde ao IDA do aspartame em nosso país. Em decorrência da quantidade relativamente elevada para atingir o valor de IDA para aspartame (p.ex. um indivíduo de 60 Kg teria de consumir aproximadamente 13 latas de bebida por dia, ou 65 envelopes de adoçante de mesa ou 20 porções de iogurte, considerandose que tudo isso foi adoçado somente com aspartame), agências de regulamentação em mais de 100 países aprovaram o aspartame para o seu uso como edulcorante (SCHOR; MAZZEI; SUDERA, 1993).

2.3.3 Sacarina A sacarina foi descoberta em 1879 pelo químico norte americano Constantin Fahlberg, que trabalhava no laboratório de Ira Remsen na Universidade de John Hopkins nos Estados Unidos, quando estudava a oxidação das sulfonamidas (O-toluenosulfonamidas), substâncias obtidas de derivados de petróleo. Apesar de ter sido inicialmente usada como antisséptico e como conservante de alimentos, vem sendo comercializada como edulcorante desde 1900. Sua incorporação em alimentos aumentou significativamente durante as duas Guerras Mundiais em decorrência da escassez e racionamento de açúcar. Quimicamente corresponde a 2,3-dihidro, 3-oxobenzeno iso sulfanazol, sua estrutura apresenta-se na Figura 3. Ela pode ser comercializada sob a forma ácida, ou sob a forma de sais de sódio, cálcio ou amônia (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996), sendo aproximadamente 300 vezes mais doce que o açúcar. Apresenta um desagradável gosto residual que pode ser minimizado pela adição de pequenas quantidades de um aminoácido (glicina) ou pela combinação com ciclamato.

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Figura 3- Estrutura química da Sacarina Sódica, Sacarina Cálcica e Sacarina FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Cerca de 80% da sacarina ingerida por via oral é absorvida e excretada inalterada, sendo no máximo transformada no ácido 2-sulfamoilbenzóico. Ela apresenta uma absorção lenta e incompleta, sendo a eliminação renal rápida e completa. Estas características fazem com que doses administradas oralmente sejam em grande parte eliminadas nas primeiras vinte e quatro horas, ficando uma quantidade de cerca de 5 a 10% para ser excretada após este prazo (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996). O mais antigo dos edulcorantes artificiais é também aquele que, nos últimos 50 anos tem estado sujeito a constantes críticas. O Governo Canadense baniu o uso da sacarina como um aditivo a partir de estudos realizados na década de 70, cujos resultados mostraram uma possível ligação deste edulcorante com o desenvolvimento de câncer de bexiga urinária em ratos (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996).

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2.3.4 Ciclamato

O ciclamato é um sal do ácido N-ciclo-hexil-sulfâmico usado como adoçante artificial não calórico em diversos alimentos e bebidas, e também na indústria farmacêutica. Aparece na composição dos produtos em três diferentes formas: ciclamato de sódio (C6H11NHSO3Na), ciclamato de cálcio (C12H24N2S2O6Ca) e ácido ciclâmico (C6H13NO3S), conforme Figura 4. É inodoro, solúvel em água, álcool e propilenoglicol, sendo mais estável que o aspartame e a sacarina, o que possibilita sua utilização em altas e baixas temperaturas (BARLATTANI, 1970).

Figura 4- Estrutura química do Ciclamato de Sódio, Ciclamato de Cálcio e Ácido Ciclâmico. FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

A descoberta do ciclamato ocorreu em 1937 por Michael Sveda, um aluno de graduação da Universidade de Ilinois (EUA), que casualmente descobriu seu sabor adocicado. Trata-se de um edulcorante 30 vezes mais doce que a sacarose, sem o sabor amargo da sacarina (AHMED; THOMAS, 1992).

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A partir da mistura de ciclamato com sacarina na proporção 10:1, houve um aumento do consumo de adoçantes artificiais nos Estados Unidos na década de 60. Em 1968, foram produzidas 7.718 toneladas de ciclamato, sendo 69% utilizado em bebidas, 19% em adoçantes de mesa, 6% em alimentos, 4% em itens não alimentares e 2% destinados para exportação (EGEBERG et al., 1970). Segundo Burbank e Fraumeni em 1970 foram consumidos, nesse país cerca de 8.943 toneladas de ciclamato. Em meados da década de 60 constatou-se que o ciclamato de sódio não era eliminado de forma invariável, mas poderia ser metabolizado como ciclohexalamina. Em 1969, a associação de ciclamato/sacarina foi interpretada pelo FDA como indutor de câncer de bexiga em ratos (PRICE et al., 1970; OSER et al., 1975). A partir desses estudos, seu uso foi proibido nos EUA após o Americano Department of Health, Education and Welfare concluir que o ciclamato não apresentava qualquer valor no tratamento da obesidade ou diabetes (EGEBERG et al., 1970). Apesar disso, o JECFA/OMS aprovou o uso do ciclamato de sódio em 1977 como adoçante em alimentos e bebidas em mais de 40 países, incluindo Brasil, Alemanha, Finlândia, Paquistão, África do Sul e Suíça (AHMED; THOMAS, 1992). Em função da proibição do uso dessa substância pelo FDA dos EUA em 1969, é possível observar uma redução dos estudos sobre os efeitos do ciclamato de sódio após a década de 70. Kroes et al. (1977), estudando a toxicidade em longo prazo do ciclamato, sacarina e ciclohexilamina em ratos, e seus efeitos na reprodução, constataram que nenhuma dessas substâncias apresentou efeito teratogênico ou afetou a reprodução. No entanto, a ciclohexilamina apresentou característica embriotóxica, o que pode ser explicado por evidências no transporte pela barreira placentária tanto do ciclamato quanto a ciclohexilamina expondo o feto a estas substâncias (SCHECHTER; ROTH, 1971).

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O ciclamato, quando ingerido em grandes quantidades, produz diarréia em humanos. De acordo com Egeberg et al. (1970) isso é aparentemente o resultado de um efeito osmótico, pois não há evidência de que essa substância agrave doenças gastrointestinais orgânicas. Tanto em seres humanos quanto em várias espécies animais, o ciclamato não é absorvido completamente no intestino (DICK et al., 1974). Quando absorvido, é rapidamente excretado na urina sem considerável acúmulo no sangue ou tecidos (COLLINGS, 1989). A maior parte do ciclamato não absorvido é normalmente eliminada nas fezes, mas uma quantidade variável pode ser convertida para ciclohexilamina por microorganismos que habitam o colon e o cecum (RENWICK; WILLIAMS, 1972). A conversão do ciclamato para ciclohexilamina em humanos é heterogênea, sendo que aproximadamente 76% dos usuários regulares convertem menos de 0,1% da dose ingerida de ciclamato, cerca de 8 a 10% convertem 1% ou mais, e 4% convertem 20% ou mais (AHMED; THOMAS, 1992). Collings (1971), investigando o metabolismo do ciclamato de sódio em humanos, constatou que a quantidade de ciclohexilamina excretada é proporcional a dose de ciclamato ingerida. O principal metabólito do ciclamato, a ciclohexilamina é rapidamente absorvida e excretada pelos rins, existindo pouca excreção fecal. As taxas de excreção urinária destes compostos indicam que pouco permanece nos tecidos ou fluidos corpóreos após sua administração prolongada e em doses elevadas (DICK et al., 1974). Vários produtos do metabolismo da ciclohexilamina foram identificados em humanos, como o ciclohexanol, a ciclohexanona e a trans-ciclohexanona-1,2-diol (KOJIMA; ICHIBAGASE, 1968). No entanto, a inexistência de diferenças entre as rotas de administração em relação à extensão do metabolismo da ciclohexilamina implica que os tecidos, mais do que a flora intestinal constitui o principal local para conversão desse metabólito (ROBERTS; RENWICK, 1985).

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Diversos estudos foram realizados em animais de laboratório visando verificar toxicidade do ciclamato de sódio ou da sua mistura com a sacarina (DALDERUP; VISSER, 1971). Os resultados revelaram poucos efeitos fisiopatológicos associados com a administração dessa substância, mesmo em doses elevadas. Atualmente, existem no Brasil diversos adoçantes de mesa à base desta associação, sendo que os mais vendidos possuem a proporção de duas partes de ciclamato para uma de sacarina (CARDELLO; SILVA; DAMÁSIO, 2000). Assunção et al. (1994) avaliando o conhecimento e a quantidade de adoçante consumida diariamente por 36 indivíduos diabéticos, constatou que 92% deles consomem adoçantes artificiais não calóricos à base de ciclamato e sacarina em quantidades inferiores à IDA. De acordo com a Food and Agriculture Organization (FAO) e o World Health Organization (WHO) Expert Committee on Food Additives, a IDA do ciclamato corresponde a 50 mg/kg de peso corporal (OSER et al., 1975).

2.3.5 Acesulfame-K

A descoberta do acesulfame-K por Karl Clauss e H. Jensen, da Companhia Hoechst, em 1967, na Alemanha, ocorreu acidentalmente quando um dos pesquisadores trabalhava no desenvolvimento de novos produtos e descobriram um composto de gosto doce, não sintetizado anteriormente. O nome inicial era acetosulfam e, em 1978, a Organização Mundial da Saúde (OMS) registrou o nome genérico acesulfame potassium salt, sendo que atualmente, foi abreviado para acesulfame-K (CÂNDIDO, CAMPOS, 1996). O acesulfame-K é um sal de potássio do 6-metil-l,2,3-oxatiazina-4-ona-2,2-dióxido, conforme Figura 5. Trata-se de edulcorante não calórico, sendo aproximadamente 200 vezes mais doce que a sacarose, e não apresenta gosto residual. Sua toxicidade e carcinogenicidade

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na reprodução foram estudadas em longo prazo, onde ficou demonstrado que o acesulfame-K é um edulcorante seguro com alto poder adoçante, não sendo metabolizado pelo organismo.

Figura 5- Estrutura química do Acesulfame-K FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

É utilizado em mais de 30 países em milhares de alimentos e bebidas, higiene bucal e produtos farmacêuticos (MUKHERJEE, CHAKRABARTIT, 1997). Mostra excelente estabilidade nas seguintes condições: na forma seca, a armazenamento prolongado, às alterações no processamento especialmente a temperaturas elevadas e pH baixo, em contato com outros ingredientes ou constituintes dos alimentos e ao ataque microbiológico (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

2.3.6

Sucralose A

sucralose,

1,6-dicloro-1,6-dideoxi-β-D-fructofuranosil-4-cloro-4-deoxi-α-D-

galactopiranose, conforme Figura 6, foi sintetizada em um laboratório da Universidade de Londres, em 1976. No estudo de reações químicas envolvendo a sacarose, os pesquisadores incorporaram nesta molécula 3 átomos de cloro e casualmente obtiveram um produto 600 vezes mais doce que a sacarose.

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Figura 06: Estrutura química da sucralose FONTE: (http://sci-toys.com/ingredients/sucralose.html)

Este edulcorante artificial apresenta maior estabilidade ao aquecimento e ao meio ácido que os edulcorantes baseados em peptídeos como o aspartame. Isto propicia a manutenção da sua característica mesmo durante cozimento e a pasteurização. Estudos sensoriais também mostraram que a sucralose não possui gosto residual amargo, apresentando um sabor muito similar ao do açúcar. Em função destas características, a sucralose pode tornar possível a fabricação um grande número de alimentos de baixa caloria, e alimentos e bebidas com baixo teor de açúcar. Estudos sugeriram que pequenas quantidades de sucralose poderiam passar através da placenta, no entanto estudos realizados por KILLE et al. em 2000 em ratas e coelhas grávidas não mostraram nenhum efeito na morfogenia do feto e em nenhum outro parâmetro de desenvolvimento fetal. Trata-se de um edulcorante não calórico, cujas ligações carbono-cloro são bastante estáveis, não sendo hidrolisadas durante a digestão ou metabolismo. Estas características fazem com que a sucralose seja totalmente excretada sem alteração pelas fezes de maneira muito rápida. Nenhum tipo de efeito é observado na glicose ou nas enzimas envolvidas na regulamentação do metabolismo de carboidratos, possibilitando que o mesmo seja ingerido por diabéticos. Não há indicação de estimulo a secreção da insulina ou redução a concentração de glicose no plasma (CÂNDIDO; CAMPOS, 1996).

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2.4

MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DOS EDULCORANTES

O uso e o desenvolvimento de novas técnicas analíticas na área da ciência e tecnologia de alimentos caminha paralelamente com o aumento do número de consumidores interessados na qualidade da sua alimentação. Conseqüentemente, procedimentos analíticos mais rápidos e eficientes, menos trabalhosos e onerosos são requeridos. Estas técnicas analíticas, geralmente apresentam o objetivo de fornecer informações sobre o processamento, controle de qualidade dos alimentos assegurando sua adequação à legislação vigente.

2.4.1 Edulcorantes Naturais

Uma importante classe de compostos, responsáveis por formar a base de muitos alimentos está representada pelos carboidratos. A qualidade e o valor calórico dos produtos alimentícios são em parte dependentes da quantidade e do tipo de carboidratos e da sua composição. Em decorrência da sua importância, existe um grande interesse na sua determinação. Muitos métodos são propostos para a análise destes compostos e entre as análises tradicionalmente empregadas podemos destacar as análises físicas, químicas e enzimáticas. Trata-se de técnicas perfeitamente aplicáveis, principalmente devido a sua simplicidade de operação e muitas vezes de baixo custo. Técnicas mais sofisticadas como as cromatográficas são muito precisas, porém com o inconveniente de serem complexas e onerosas, e muitas vezes de utilização inviável em empresas de pequeno e médio porte. Neste último, além de equipamentos caros, sofisticados e de difícil manutenção, há necessidade de pessoal capacitado para a operação.

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2.4.1.1 Análises Físicas

Entre as análises físicas de maior importância na indústria de alimentos estão à análise polarimétrica, índice de refração e densidade. A análise polarimétrica é extensivamente utilizada, principalmente nas usinas de cana de açúcar. Trata-se de um método preciso na determinação da concentração de sacarose se nenhuma outra substância opticamente ativa estiver presente. Porém se houver outros açúcares opticamente ativos, o resultado será uma somatória e não somente sacarose (MORGANO; MORIYA; FERREIRA, 2003). O índice de refração é um método rápido e simples, rotineiramente utilizado em indústrias para determinação da concentração de sólidos solúveis totais (SST), principalmente açúcares, em xaropes, mel e geléias. A medida do índice de refração de uma solução de carboidratos aumenta linearmente com a concentração, sendo dependente da temperatura (20 ºC) e do comprimento de onda em que é realizada a medida (λ = 589,3 nm) (). A densidade assim como o índice de refração relaciona-se com a concentração dos carboidratos presentes em solução. Sendo a densidade uma relação de massa por volume, o aumento da concentração de carboidratos aumenta a densidade da solução. Este parâmetro é rotineiramente utilizado na indústria para determinar a concentração de carboidratos, em sucos e bebidas (). Esses métodos relacionam uma propriedade física com a quantificação dos carboidratos, mas havendo outras substâncias presentes, tais como ácidos ou sais, estas se somarão ao resultado. Portanto, muitas vezes o resultado final não é um valor de açúcares, mas sim de SST.

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Em função dos problemas associados a cada uma destas técnicas, quando uma medida mais precisa é requerida outras técnicas devem ser utilizadas.

2.4.1.2 Análises Químicas

Numerosos métodos químicos são propostos para determinação de açúcares. Estão baseados na reação destas substâncias com outros componentes, formando complexos que são então quantificados. A maioria dos métodos químicos tradicionalmente empregados para a análise de açúcares está baseado na propriedade de óxido-redução de cátions (p.ex: cobre), que afetam a cor das soluções que os contêm, tornando-os adequados para usos analíticos. O Cu++, de característica cor azul anil quando em solução alcalina, ao ser reduzido estequiometricamente a Cu+ (Cu2O) proporciona ao meio de reação um precipitado vermelho-tijolo; este é o fundamento químico do reagente conhecido como licor de Fehling, utilizado para determinação de sacarose e açúcares redutores. A adequação desse fundamento químico à dosagem de carboidratos é a base para muitos procedimentos analíticos entre eles os métodos colorimétricos de Somogyi e Nelson (NELSON, 1944; SOMOGYI, 1945), titulométricos de Lane-Eynon (LANE; EYNON, 1923) e de Luff-Schoorl (SILVA; MONTEIRO; ALCANFOR et al, 2003).

2.4.1.2.1 Métodos Espectrofotométricos

O método colorimétrico de Somogyi e Nelson, por se tratar de uma técnica sensível e detectar baixas concentrações de açúcares (BREUIL; SADDLER, 1985), continua sendo muito utilizada (BRAGA; BOM PESSONI; DIETRICH, 1998, DEMIATE; KONKEL; PEDROSO, 2001, GUTIÉRREZ-MICELI et al., 2002, SHANLEY, 1973, SILVA et al., 2003;

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SRIVASTAVA; TRIPATHI; JAJU, 1986). Breuil e Saddler (1985) compararam os métodos de Somogyi-Nelson com àqueles que empregam o ácido dinitrossalicílico (DNS) para determinação de produtos de hidrólise de celulose e concluíram que o primeiro forneceu melhores resultados tendo sido menos susceptível aos interferentes presentes no meio. A determinação da concentração dos açúcares redutores pela técnica colorimétrica utilizando-se DNS é um método muito popular, relativamente rápido e conveniente. Porém este método tem algumas limitações, sendo susceptível a interferência de várias substâncias, incluindo baixa seletividade na análise de diferentes tipos de açúcares e sendo pouco preciso especialmente em baixas concentrações (BREUIL; SADDLER, 1985). Mesmo com tantos inconvenientes, esse método continua sendo muito utilizado em análises de alimentos (BREUIL; SADDLER, 1985, FONTANIELLA et al., 2003, HUTÑAN et al., 1999, OLIVEIRA et al., 2001, SILVA et al., 2003) e em alguns trabalhos é utilizado como um método de referência (AMÁRITA; FERNÁNDEZ; ALKORTA, 1997, FERREIRA et al., 2003, ROTARIU; BALA; MAGEARU, 2002). Dubois et al. (1956) desenvolveram uma técnica colorimétrica, conhecida como fenolsulfúrico, para a determinação de açúcares totais. A solução da amostra desenvolve uma cor amarela-alaranjada quando tratada com fenol e ácido sulfúrico concentrado, através de uma reação sensível com coloração estável. A concentração pode ser obtida realizando uma leitura em 490 nm para hexoses e 480 nm para pentoses e ácidos urônicos. Na literatura recente são encontrados diversos trabalhos nos quais esta técnica foi empregada (BRAGA; BOM PESSONI; DIETRICH, 1998, FERREIRA et al., 2003, HATANAKA et al., 1997, HUTÑAN et al., 1999, MELAMANE; PLETSCHKE; LEUKES, 2003, SILVA et al., 2003). Baseado no método de Dubois et al. (1956) uma metodologia para a determinação de lactose em queijos foi desenvolvida (BARNETT; TAWAB, 1957) sendo modificada em 1968

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(LAWRENCE, 1968). Acton em 1977 novamente modificou esta técnica tornando-a mais rápida e com uma melhor porcentagem de recuperação da lactose adicionada, entre 94,9% e 101,7%. Em 1999 a técnica de Acton foi utilizada para quantificar lactose em queijos minas frescal, e pelos resultados apresentados este método obteve uma excelente taxa de recuperação de lactose, principalmente quando aplicada a concentrações de até 40 µg mL-1 (CARUSO; OLIVEIRA, 1999). Outro método colorimétrico para a determinação de açúcares totais é denominado antrona-sulfúrico. O aquecimento e o forte meio ácido produzem hidrólise das ligações glicosídicas e desidratação dos monômeros, produzindo derivados do furfuraldeído. Estes reagem com antrona produzindo um composto de coloração característica (LAURENTIM; EDWARDS, 2003). A solução é resfriada e a absorbância é medida em 620 nm. Schweizer et al. (2000) utilizaram a técnica e a consideraram eficiente, visto que em comparação com a técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) a metodologia proposta apresentou uma superestimação de 10%. Outros trabalhos também utilizaram o método antrona-sulfúrico para determinação de carboidratos (GRANDY; ERICH; PORTER, 2000, GUTIÉRREZ-MICELI et al., 2002, MARTÍNEZ-BARAJAS, 2003, REIS et al., 2000, RODRÍGUEZ- TREJO; DURYEA; WHITE, 2002, SILVA et al., 2003). Para fins de comparação, Deng e Tabatabai em 1994 avaliaram as metodologias de Somogyi-Nelson, Azul da Prússia, DNS, Fenol-sulfúrico, Antrona-sulfúrico para análise de açúcares redutores no solo. As três últimas técnicas apresentaram baixa sensibilidade. Os métodos Azul da Prússia e Somogyi-Nelson foram os mais sensíveis e precisos, metais extraídos juntamente com o solo interferem no método de Somogyi-Nelson, a mesma interferência não acontece no método Azul da Prússia, porém à alta sensibilidade desta metodologia ocasiona imprecisão nos resultados.

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2.4.1.2.2 Métodos Titulométricos

Em função da morosidade dos métodos titulométricos e a dependência do resultado depender da prática do analista, estas técnicas têm sido substituídas. O método titulométrico de Lane, Eynon (1923) utilizado para a determinação dos açúcares redutores tem sido descartado pelos órgãos envolvidos com a cana de açúcar, mesmo depois de ter sido adaptada por Horii, Gonçalves (1991), onde a utilização do equipamento Redutec é incapaz de atender à demanda das indústrias que recebem um grande número de fornecedores e necessitam realizar cerca de 500 análises por dia. (ISEJIMA; COSTA; SOUZA JUNIOR, 2003) Silva et al. (2003) compararam métodos de determinação de açúcares redutores e açúcares totais, dentre os quais: métodos colorimétricos (DNS, antrona-sulfúrico, fenolsulfúrico,

Somogyi-Nelson);

métodos

titulométricos

(Lane-Eynon,

Luff-Schoorl,

complexometria de EDTA); método gravimétrico de Munson-Walker; método por índice de refração e o cromatográfico em camada delgada. Os resultados diagnosticaram que as metodologias que se fundamentam na espectrofotometria, se comportaram melhor que os métodos titulométicos e gravimétricos na determinação de açúcares redutores.

2.4.1.3 Métodos Cromatográficos

Os métodos cromatográficos são muito eficientes para a detecção e quantificação dos monossacarídeos e oligossacarídeos em alimentos. Muitas aplicações via CLAE (BARNES; NICOLSON; VAN WYK, 1995; FERNÁNDEZ-ARTIGAS; GUERRA-HERNÁNDEZ; GARCÍA-VILLANOVA, 2001; INDYK; EDWARDS; WOOLLARD, 1996; TRUGO; FARAH; CABRAL, 1995), cromatografia gasosa (CG) (COURTIN; VAN DEN BROECK;

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DELCOUR, 2000), cromatografia de troca-iônica com detecção amperométrica pulsada (DING; YU; MOU, 2002; FARINE;MALGOYRE; PUIGSERVER, 2001) e cromatografia de afinidade iônica (LAU; SHAO; LEE, 2000) são propostos para a determinação de açúcares. Todos eles apresentam como principal atrativo à possibilidade de análise simultânea de substâncias. A CLAE é atualmente a técnica cromatográfica mais importante para a análise de carboidratos devido à rapidez, seletividade, sensibilidade e precisão das medidas. Uma das principais vantagens da CLAE em comparação a CG é a rapidez, já que nas análises de CG muitas vezes há necessidade de derivatização dos compostos de interesse com o objetivo de torná-los voláteis. Sturm, Koron, Stampar em 2003 analisaram diferentes variedades de morangos pelo método CLAE para determinação de açúcares individuais (sacarose, glicose, frutose e xilose) e ácidos orgânicos em dois diferentes estágios de maturação. Os resultados comprovaram que a composição química das frutas varia significativamente entre os genótipos da planta e o estágio de amadurecimento. Já Pérez et al. em 1997, não obtiveram o mesmo sucesso ao tentar correlacionar a qualidade dos morangos com a determinação de SST, açúcar total, ácidos tituláveis e ácidos orgânicos. Como citado anteriormente, os SST não medem somente os açúcares, mas todas as substâncias dissolvidas, as quais apresentam diferentes índices de refração na água (ácidos, sais, etc) (BARTOLOMÉ; RUPÉREZ; FÚSTER, 1996). Outro trabalho desenvolvido por Bartolomé, Rupérez, Fúster em 1996 avaliou a influência do processo de congelamento e estocagem sob refrigeração em açúcares (sacarose, glicose e frutose) através de dois cultivares de abacaxi por CLAE. Estes resultados foram comparados com os SST determinados pelo índice de refração, onde se verificou uma correlação positiva

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entre os açúcares totais determinados por CLAE e SST, apesar dos valores de SST serem sempre maiores, pelos motivos já discutidos. Bernárdez, Miguéles, Queijeiro em 2003 utilizando CLAE equipado com detector universal de espalhamento de luz analisaram glicose, frutose e sacarose em diferentes variedades de castanha (C. sativa Mill) cultivadas em uma região da Espanha. O enfoque principal foi à quantificação da sacarose (um dos parâmetros mais importantes para avaliar a qualidade comercial desta fruta) cuja maior parte das variedades apresentou uma faixa entre 8 % a 15 % dependendo da localidade de cultivo. Resultados parecidos foram obtidos por pesquisadores franceses, indicando que os teores de sacarose das castanhas destes dois países são similares. Também utilizando CLAE, Yuan, Chen (1999) desenvolveram uma metodologia para a determinação simultânea de açúcares, ácido ascórbico, 5-HMF (5-hidroximetilfurfural), furfural e quatro outros compostos furânicos em sucos de frutas e bebidas. Outro trabalho desenvolvido por Lefebvre et al. (2003) também descreveram a determinação simultânea de carboidratos e produtos de fermentação de uma massa fermentada de trigo. Trabalhos com CG também evidenciam a determinação simultânea. Katona, Sass, Molnár-Perl em 1999 utilizaram cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de massa para a quantificação simultânea de mono, di e trissacarídeos, açúcares, álcoois e ácidos derivatizados em éter-éster trimetilsilil-oxima em dois cultivares de cenoura em função da data de colheita e condições de estocagem. Já García Baños, Olano, Corzo em 2000 descreveram uma metodologia mais específica para frutose, glicose, galactose, sacarose, lactose, maltulose e maltose, presentes em formulações enterais. A Cromatografia de troca aniônica (alto pH) com detecção amperométrica pulsada está se tornando uma alternativa atraente para a determinação de carboidratos, devido ao seu alto

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poder de resolução e sensibilidade. Problemas comumente encontrados durante a separação de alguns carboidratos (p.ex. maltose de lactose e sacarose (KAINE; WOLNIK, 1998) não acontecem na técnica de cromatografia de troca aniônica). Esta mesma técnica acoplada com detecção amperométrica pulsada foi empregada por Cataldi et al. em 2000 para obter um perfil completo dos açúcares presentes nas folhas e raízes da planta Oliveira (Olea europaea L. Cv. Coratina). Uma boa separação dos açúcares (mio-inositol, galactinol, mannitol, galactose, glicose, frutose, sacarose, rafinose e estaquiose) foi obtida, sendo encontrado maior proporção de glicose e manitol. Técnica semelhante foi utilizada por Farine et al. 2001 que monitorou os níveis de sacarose, D-glicose, D-frutose e oligossacarídeos em águas doces nas diversas etapas de extração de açúcar dos resíduos gerados no processamento da cana de açúcar.

2.4.1.4 Métodos Enzimáticos

Os métodos enzimáticos têm uma grande importância na análise de açúcares. Em muitos casos superam os métodos químicos e físicos, pois são mais seletivos. Esta maior seletividade permite identificar os açúcares individualmente em uma mistura. Os métodos enzimáticos mais empregados podem ser divididos em detecção espectrofotométrica ou biossensores.

2.4.1.4.1 Métodos Espectrofotométricos

Um exemplo do uso dos métodos enzimáticos espectrofotométricos para determinação da concentração de açúcares em alimentos é a quantificação simultânea de glicose, frutose e manose pela ação da enzima hexoquinase.

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Estes açúcares são convertidos em glicose-6-fosfato (G-6-P), frutose-6-fosfato (F-6-P), manose-6-fosfato (M-6-P), graças ao ATP que se transforma em ADP na presença da enzima hexoquinase. Posteriormente, a G-6-P é oxidada pelo NADP+ na presença de glicose-6fosfato-desidrogenase (G-6-P-DH).

Finalmente, F-6-P e M-6-P transformam-se pela ação da fosfoglicose-isomerase e da fosfomanose-isomerase, respectivamente, em G-6-P e segue-se o procedimento descrito acima. A quantidade de NADPH formado é proporcional a concentração de G-6-P na amostra e pode ser medida espectrofotometricamente em 340 nm (MATISSEK; SCHNEPEL; STEINER, 1998). As concentrações de maltose e sacarose também podem ser determinadas por esta técnica hidrolisando-se previamente estes açúcares. No entanto, durante esta etapa outros oligossacarídeos também podem ser convertidos e determinados simultaneamente . Utilizando o mesmo processo enzimático, hexoquinase/G-6-P-DH/ fosfoglicose isomerase Mota, Lajolo, Cordenunsi em 1997, determinaram sacarose, glicose e frutose durante o amadurecimento da banana (Musa spp.) medindo-se a produção de NADPH espectrofotometricamente. Para a determinação de sacarose, uma hidrólise prévia com invertase foi realizada e só então a determinação foi feita. Outro importante método enzimático colorimétrico é o que utiliza a enzima glicose oxidase (GOD), disponível em muitos kits comerciais. A glicose oxidase catalisa a oxidação

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da glicose para ácido glicurônico e peróxido de hidrogênio. Através de uma reação oxidativa de acoplamento catalisada pela peroxidase, o peróxido de hidrogênio formado reage com um grupo cromóforo doador de hidrogênio (DH2), por exemplo, o-dianisidina, 2,2’-azino-di-(3etilbenzotiazolina)-6-sulfonato (ABTS), o-toluidina, 2,6-diclorofenolindofenol ou também pode ser utilizado polivinilpirrolidona, alquilaurilsulfonato e polietilenoglicol. Os grupos cromóforos doadores de hidrogênio (DH2) citados anteriormente são oxidados a um derivado colorido D, cuja leitura da absorbância é realizada na região do visível, variando a absorção máxima pelo DH2 utilizado. Como a medida de absorbância é diretamente proporcional à concentração de peróxido, é possível quantificar o teor de glicose na amostra (BERGMEYER; BERNT, 1974), conforme mostra a equação 2 e 3.

O amido, um polissacarídeo constituído por monômeros de glicose, também pode ser determinado pelo método enzimático da GOD (DEMIATE; KONKEL; PEDROSO, 2001, DEMIATE; KONKEL; PEDROSO, 2001, HOLM et al. 1986). Esta análise envolve a utilização de amilases purificadas (GARCIA; CORDENUNSI; LAJOLO, 1985, MORALES; ESCARPA; GONZÁLES, 1997, MOTA; LAJOLO; CORDENUNSI, 1997), onde o amido gelatinizado é hidrolisado a glicose pela amiloglicosidase que é geralmente associada com um α- amilase, sendo o resultado, dado em termos de glicose e corrigido para amido por um fator de 0.90 (CHATEL; VOIRIN; LUCIANI, 1996, EMNEUS; NILSSON; GORTON, 1993).

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Trabalhos recentes abordando métodos espectrofotométricos químicos e enzimáticos e variações das metodologias abordadas anteriormente têm sido desenvolvidas. Particularidades destas inovações são mostradas na Tabela 3.

Tabela 3- Utilização de método colorimétrico na análise de açúcar em alimentos. AMOSTRA Leite

ANALITO Lactose

DETECÇÃO Metilamina em pH básico

LD / FL / E FL: 10 a 80 mg/ml

REFERÊNCIA NARINESINGH

et

al., 1992

(λ = 540 nm) E: 5 µM (galactose)

SHAPIRO; SHAMAY;

(λ = 405 nm)

E: 10 µM (lactose)

SILANIKOVE, 2002

Sangue, Soro Glicose

GOD/Hidroquinona/Fe (III)

FL: 0,001 a 1,0 mM

KATSUMATA;

e

(λ = 510 nm)

LD: 0,5 µM

SEKINE; TESHIMA,

Leite

de lactose

cabra

galactose

Plasma.

e Tio-NAD

Vinho

2000

Queijo

Lactose

parmesão Refrigerante

Glicose

GOD/Lactase/Iodeto/Molibidato/ FL> 0,015 %

BLAIS;

Álcool Polivinilíco (λ=490 nm)

1995

GOD/H2O2/Fe (III)

FL: 30 a 200 µM

(λ=570 nm)

LD: 10 µM

VAILHEN,

HARMS et al. 1999

GOD Glicose Oxidase; LD Limite de Detecção; FL Faixa Linear; E Erro.

2.4.1.4.2 Biosensores Entre as novas tendências nas análises enzimáticas destaca-se o uso dos biosensores, que desde o seu desenvolvimento, descrito por Clark e Lyons (1962) têm recebido grande atenção. Este dispositivo combina um sensor biológico responsável pela catálise de uma determinada reação que produz uma espécie passível de ser detectada por um transdutor de sinal. O sensor biológico pode ser de um tecido de planta ou animal, células inteiras, células microbianas, enzimas e seus cofatores anticorpo-antígeno e até hormônios. A técnica de tradução é geralmente eletroquímica, mas processos ópticos, piezoelétricos ou térmicos também podem ser utilizados. (IBAÑEZ; CIFUENTES, 2001)

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Trata-se de uma ferramenta de quantificação com grande potencial na área da análise de alimentos, principalmente em função de características como a alta seletividade, sensibilidade, velocidade analítica, assim como, requer condições amenas de temperatura e pH, com pequena manipulação da amostra para o processamento da análise. Muitos trabalhos têm sido desenvolvidos com biosensores, na Tabela 4 apresentam-se alguns trabalhos recentes utilizando esse procedimento.

Tabela 4- Utilização de biosensores na análise de açúcares em alimentos. SENSOR S.cerevisiae

AMOSTRA ANALITO Refrigerante sacarose

DETECÇÃO Eletrodo de O2

LD / FL FL: 0,01 a 30 mM

potenciométrico Invertase

Cana de

sacarose

Termométrica

FL: 0,10 a 0,50 M

Sensor amperométrico

Soluções

glicose,

E. coli (K12)

padrão

frutose e

(Monosac)

sacarose

FL> 4,0mM (Disac)

frutose

Sensor amperométrico

desidrogenase GOD

Soluções

THAVARUNGKUL et al. 1999

Células de

Mel

ROTARIU; BALA; MAGEARU, 2002

açúcar

Frutose

REFERENCIA

glicose

Sensor amperométrico

FL>2,5 mM

HELD et al., 2002

LD< 10 µM

BASSI; LEE; ZHU,

FL> 1,0 mM

1998

FL: 0,027 a 4,0 mM SHANKARAN;

padrão

UEHEARA; KATO, 2003

GOD

Soluções

glicose

Sensor amperométrico

FL> 2 mM

padrão GOD

Lactase

2000

Refrigerante glicose

Leite

COSNIER et al.,

lactose

S. cerevisiae

Eletrodo de carbono/

FL: 0,05 a 10 mM

ZHU; LI; ZHU, 2002

Eletroquimiolescência

LD: 26 µM

Eletrodo de CO2

FL: 0,5 a 10 %

AMÁRITA;

potenciométrico

(Semilog)

FERNÁNDEZ; ALKORTA, 1997

β- galactosidase Controle da GOD

Fermentação

lactose

Eletrodo de O2

FL> 30 g/L

potenciométrico

GOD Glicose Oxidase; LD Limite de Detecção; FL Faixa Linear.

YUAN; CHEN, 1999

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Embora esta técnica analítica apresente inúmeras vantagens, o uso industrial de biosensores ainda é limitado. Dentre as principais limitações é possível citar: alto custo dos sensores biológicos, o pequeno tempo vida útil e a necessidade de freqüente calibração do sistema.

2.4.2

Edulcorantes Artificiais

Os edulcorantes artificiais tais como a sacarina, ciclamato, acesulfame-K, aspartame e sucralose, têm sido amplamente utilizados pelo setor industrial. No entanto, é a indústria alimentícia que mais tem explorado seu emprego, desenvolvendo novos produtos e associações de edulcorantes que satisfaçam seus consumidores. Nas duas últimas décadas, o crescente consumo destes compostos e uma regulamentação mais restritiva imposta pela legislação têm propiciado o desenvolvimento de metodologias para detecção e quantificação de edulcorantes artificiais em alimentos. Até o momento, os métodos mais utilizados são a CLAE com detecção de UV-Vis, fluorescência ou ainda o método de cromatografia iônica. (CASALS et al., 1996; RUTER; RACZEK; LEBENSM, 1992; BIEMER, 1989). Infelizmente, trata-se de técnicas relativamente complexas, de alto custo e nem sempre aplicáveis para todos os edulcorantes. No caso da determinação de ciclamato via CLAE-UV, a absorção pobre deste composto inviabiliza esta análise, sendo necessário um pré-tratamento (oxidação) e derivatização para posterior quantificação. Para estes casos a cromatografia iônica de alta eficiência é uma alternativa, alguns trabalhos relatam a quantificação de sacarina sódica, ciclamato de sódio, bem como a determinação simultânea de diversos edulcorantes artificiais (BIEMER, 1989; CHEN et al., 1997; QU et al., 1999; CHEN; WANG, 2001).

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Outras técnicas não menos complexas tais como, eletroforese capilar com detecção potenciométrica (SCHNIERLE; KAPPES; HAUSER, 1998) e técnicas eletroquímicas baseadas no uso de eletrodo de carbono ou eletrodos íon-seletivo (FATIBELLO-FILHO; ANICETO, 1997), têm sido propostas para a detecção dos diversos edulcorantes. Filmes lipidícos também podem ser utilizados para detecção ou monitoramento contínuo de edulcorantes (NIKOLELIS; HIANIK; KRULL, 1999), uma vez que a produção de corrente eletroquímica transiente é diretamente proporcional à concentração das espécies de interesse. Dentre os edulcorantes artificiais mais empregados pela indústria, o aspartame apresenta as maiores dificuldades de quantificação. Isto é decorrente das técnicas existentes necessitarem de um tempo de análise muito grande e não possuírem a seletividade necessária para sua determinação em amostras comerciais (PEREIRA; MARCOLINO-JUNIOR; FATIBELLO-FILHO, 2000). Alguns destes procedimentos são espectrofotométricos, cuja seletividade pode ser melhorada por aplicação de procedimentos preliminares de extração. O método da ninidrina (VESELY; DÁVIDKOVÁ; PRUDEL, 1980), por exemplo, teve sua seletividade melhorada utilizando-se extrações prévias em carbonato de propileno ou mistura de isopropanol-metanol (1:1 v/v). Obviamente, as aplicações de procedimentos prévias atentam contra a performance analítica do procedimento, principalmente no que diz respeito ao tempo de análise. Métodos potenciométricos também estão disponíveis através da titulação do aspartame com dinitrofluoro benzeno e detecção do ponto de equivalência com eletrodo de íon seletivo de fluoreto (FATIBELLO-FILHO; MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999). A cromatografia gás-líquida (FURDA; MALIZIA; VERNIERI, 1975) e a CLAE (TYLER, 1984; STAMP; LABUZA, 1989; TSANG; CLARKE; PARRISH, 1985; VERZELLA; BAGNASCO; MANGIA, 1985) também têm sido utilizadas para determinação do aspartame. Esta última técnica apresenta a vantagem de possibilitar a determinação

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simultânea do aspartame com outros edulcorantes artificiais tal como acesulfame-K, sacarina. (FATIBELLO-FILHO; MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999). Entre as novas tendências é possível destacar o uso de biosensores (GUILBAULT; LUBRANO, 1988). Trata-se de procedimentos potenciométricos, fundamentados na utilização de enzimas imobilizadas, como por exemplo, L-Aspartase e carboxipeptidase A (FATIBELLO-FILHO et al., 1988), aspartato amino-transferase oxidase (VILLARTA, SULEIMAN, GUILBAULT, 1993), α-quimotripsina e álcool oxidase (CHOU, 1996), carboxil esterase e álcool esterase (ODACT, TIMUR, TELEFONEU, 2004). Entre os principais inconvenientes da técnica, destaca-se: o pequeno tempo de vida dos eletrodos em função da baixa estabilidade das enzimas e a seletividade significativamente menor que a esperada para sistemas enzimáticos. Outra proposta relata a utilização de um sensor amperométrico microbiano que utiliza células do Bacillus subtillis (RENNEBERG; RIEDEL; SCHELLER, 1985) imobilizadas em um eletrodo modificado de oxigênio com membrana de polietileno. Uma das desvantagens deste sistema está relacionada às sérias interferências causadas pelos aminoácidos constituintes do aspartame e pela glicose (FATIBELLO-FILHO; MARCOLINO-JUNIOR; PEREIRA, 1999). A eletroforese capilar é outra técnica utilizada para a determinação de aspartame. Walker; Zaugg; Walker em 1997 desenvolveram uma técnica que permite a determinação simultânea de aspartame, ácido benzóico e cafeína em dois minutos com resultados comparáveis aos produzidos através de CLAE. Para a determinação de sucralose Nikolelis e Pantoulias em 2000 desenvolveram uma técnica eletroquímica para a detecção rápida e sensível, baseado em uma bicamada de membrana lipídica em superfície estabilizada (MLBSE). A interação da sucralose com a MLBSE produz uma corrente eletroquímica em poucos segundos após o contato da

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membrana com o edulcorante. Uma metodologia envolvendo a técnica de cromatografia gasosa com coluna capilar também foi desenvolvida para a determinação de sucralose, sacarose, lactulose e manitol. (FARHADI et al., 2003).

2.5

CALIBRAÇÃO MULTIVARIADA Frente às barreiras que as técnicas tradicionais apresentam, é notável a necessidade de

desenvolvimento de procedimentos analíticos mais rápidos, seletivos, sensíveis e de baixo custo quando se objetiva aplicá-los ao setor de controle de qualidade. Em função destas necessidades e através dos avanços computacionais, principalmente na área da programação e interfaceamento de instrumentos aos computadores, um grande número de variáveis podem ser obtidas para uma única amostra, produzindo assim uma quantidade enorme de informações. Um exemplo notável é a intensidade de absorção em vários comprimentos de onda que é rotineiramente registrada em um único espectro. A posse desta grande quantidade de dados associada à utilização de ferramentas quimiométricas possibilita extrair informações relevantes mesmo a partir de dados químicos de natureza multivariada. A quimiometria por sua vez, pode ser definida como uma disciplina química que emprega métodos matemáticos e estatísticos para planejar e/ou selecionar experimentos de forma otimizada, a fim de fornecer o máximo de informação química com a análise dos dados obtidos (FERREIRA et al., 1999). De maneira geral, o procedimento da análise química é composto de duas etapas fundamentais. Na primeira, alguns tratamentos físicos e químicos são utilizados com o objetivo de transformar a amostra, levando-a a um estado físico e químico compatível com a técnica analítica disponível. Na segunda, modelos de calibração são desenvolvidos para obtenção de uma função de regressão que permita prever a quantidade da espécie de interesse,

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a partir de um parâmetro físico ou químico medido. Embora o método de calibração univariado seja o mais empregado, esta metodologia sub utiliza os dados. A utilização de apenas um parâmetro dificulta, e às vezes até impossibilita, a determinação de um constituinte ou constituintes em amostras cujos componentes apresentam interferências espectrais. A calibração multivariada, por sua vez, permite a determinação de um componente de interesse em matrizes complexas ou a análise de multicomponentes em sistemas mais simples, onde há severa interferência espectral. A calibração em análise multivariada é realizada com “n” espectros para um conjunto de amostras com composição conhecida em “p” valores de comprimento de onda diferentes, formando uma matriz X, com “n” linhas e “p” colunas. Uma matriz Y com os valores de concentração também deve ser formada contendo “n” linhas, correspondendo às diferentes amostras, e “q” colunas, indicando o número de diferentes analitos presentes nas amostras. O próximo passo é desenvolver um modelo matemático apropriado (determinando-se um vetor dos coeficientes de regressão – b) que melhor possa reproduzir Y a partir dos dados da matriz X (Eq. 4). Esse modelo é utilizado na fase de previsão (com um conjunto teste) para estimar as concentrações (Yteste) dos constituintes de novas amostras, a partir de seus espectros (Xteste) (Eq. 5). Como estas metodologias trabalham com matrizes de dados, o processo de isolar o fator Y da Eq. 4 para a obtenção da Eq.5, implica a utilização da matriz transposta de X, ou seja, (Xteste)t ( NAGATA ; BUENO ; PERALTA-ZAMORA, 2001).

X = b*Y

Eq.04

Yteste = (Xteste)t * b

Eq.05

Os dados para a calibração multivariada podem ser organizados conforme ilustra a Figura 7. Os valores de absorbância dos espectros, a cada comprimento de onda, são as variáveis independentes, e as concentrações das amostras, as variáveis dependentes.

55

Existem vários métodos matemáticos para a realização dos processos de calibração multivariada, como a Regressão Linear Múltipla (MLR), Regressão por Componentes Principais (PCR), Mínimos Quadrados Clássicos (CLS) e a Regressão de Mínimos Quadrados

Absorbância

Parciais (PLSR).

Comprimento de onda (nm)

Figura 7- Organização dos dados para Calibração Multivariada.

Em qualquer uma destas metodologias multivariadas é comum a utilização de procedimentos de transformação e/ou pré-processamento dos dados para aumentar e melhorar a eficiência dos modelos ajustados a um determinado problema analítico.

2.5.1 Transformação de Dados

No caso dos procedimentos de transformação de dados, os métodos matemáticos empregados são orientados às linhas da matriz de dados X. As técnicas mais comuns da transformação dos dados são: (Pirouette User Guide) -

Primeira e segunda derivada (compensa o aumento de linha de base e melhoram a separação de sinais não totalmente sobrepostos)

-

Alisamento (diminui os ruídos)

56

-

Log 10 (enfatiza sinais com baixa intensidade)

-

Normalização (diminui o efeito das diferenças amostrais)

A aplicação de uma ou mais formas de transformação nos dados deve ser avaliada e estudada caso a caso, tomando-se certos cuidados para que a escolha seja adequada ao sistema que se está trabalhando. Nesta fase pode ser incluída ainda a redução ou eliminação de variáveis.

2.5.2 Pré-Processamento de Dados

Um procedimento comum e importante, realizado antes de qualquer método multivariado, é o pré-processamento de dados. Estes procedimentos permitem, a partir da análise multivariada, obter informações mais precisas e exatas dos dados processados. O procedimento de pré-processamento de dados é orientado às colunas da matriz de dados, sendo usualmente aplicados tanto nas variáveis independentes (matriz X) quanto nas variáveis dependentes (matriz Y). O pré-processamento denominado Dados Centrados na Média é amplamente utilizado em dados espectroscópicos. Basicamente, subtrai-se o valor de cada elemento da coluna (Xij) pelo valor médio dos elementos dessa coluna (xmj), obtendo-se como resultado, uma matriz onde todas as colunas tenham média zero. Esse procedimento facilita a visualização dos dados (translada o sistema de origem até o centro do conjunto de dados) (THOMAS, 1994).

1 n ∑ x ij n i =1

Eq. 6

x ij = x ij − xm j

Eq. 7

xm j =

57

2.5.3 Análise de Componentes Principais (PCA) Grande parte dos métodos multivariados modernos estão fundamentados na Análise de Componentes Principais (PCA). Trata-se de uma importante ferramenta da compressão de dados que permite a redução da dimensionalidade original, sem que haja perda de informação relevante (KATEMAN; BUYDENS, 1993; MATLAB USER’S GUIDE). Para ilustrar e facilitar a visualização dos principais aspectos envolvidos no PCA, um conjunto constituído por 35 amostras que se distribuem de maneira tridimensional será utilizado (Figura 8). Cada uma destas dimensões pode representar uma variável medida ou, no nosso caso particular, valores de intensidade registradas em 3 valores de comprimento de onda. Uma análise mais minuciosa desta ilustração indica que todo o conjunto amostral pode ser delimitado por uma caixa retangular, cuja maior particularidade está representada por uma pequena altura. Em primeira análise, observa-se também que nenhuma variável (Var1, Var 2 e Var 3) descreve uma parcela importante da variância apresentada pelos dados.

Var 2

Var 1

Var 3 Figura 8- Gráfico tridimensional do conjunto de dados composto por 35 amostras

Em função destes aspectos, e principalmente da característica mais fundamental do PCA (redução do espaço dimensional) uma rotação e/ou transformação dos eixos originais é realizada. Este novo sistema de eixos (mais comumente denominados como fatores,

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componentes principais, ou ainda variáveis latentes) apresenta a direção da máxima variância de dados, conforme pode ser observado na Figura 9.

PC2 Var 2

PC1

Var 1

PC1 PC3 PC2

A

B

Figura 9- (A) Gráfico tridimensional ilustrando os eixos das componentes principais. (B) Gráfico bidimensional da CP1 vs. CP2: escores representados por () e pesos por (----).

A primeira componente principal (CP1) tem a direção que descreve a máxima dispersão das amostras, sendo responsável pela explicação de grande parte da variância apresentada pelo conjunto. No entanto, apenas esta componente principal não é suficiente para explicar o comportamento global deste conjunto de dados, sendo necessária uma segunda componente (CP2), a qual deve ser ortogonal a primeira é responsável pela explicação de uma parcela importante da variância observada. Em princípio, é possível extrair tantas componentes principais quanto o número de variáveis. No entanto, dada à baixa variabilidade dos dados em torno da terceira componente principal (CP3), é possível que esta seja descartada. Este procedimento atende às duas grandes premissas do PCA, ou seja, a redução de variáveis, sem perda de informação relevante (KATEMAN; BUYDENS, 1993; FERREIRA, 1999).

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Em termos analíticos instrumentais, esta redução do espaço dimensional, conseguido através da seleção de poucas componentes principais, possibilita remover o ruído instrumental (ou variações aleatórias), bem como as informações redundantes fornecidas por variáveis altamente correlacionadas (colinearidade). A aplicação do PCA propicia a obtenção de duas novas informações extremamente úteis: os escores e os pesos (Figura 9B). Os escores são as novas coordenadas das amostras, no novo sistema de eixos das componentes principais. Como cada componente principal é construída pela combinação linear das variáveis originais, os pesos são os coeficientes desta combinação, ou seja, trata-se do peso que cada variável original contribui para a obtenção do novo sistema de eixos (FERREIRA, 1999). A interpretação conjunta dos escores e pesos originados por poucas componentes principais viabiliza a análise qualitativa de diversos tipos de amostras. Um dos principais usos do PCA em alimentos objetiva a classificação e detecção de diferentes tipos de adulterantes empregados em diversos produtos comerciais. Esta metodologia tem recebido grande atenção devido à rapidez da análise e baixo custo, propiciando resultados positivos e demonstrando seu potencial para o controle de qualidade. A utilização de métodos químicos via úmida para esta mesma finalidade, inviabiliza o trabalho de controle (mesmo das agências fiscalizadoras), uma vez que os métodos disponíveis são freqüentemente demorados, de alto custo e muitas vezes acompanhados do inconveniente de serem detectados por um número limitado de métodos (DOWNEY, 1998). A eficiência do PCA na análise de adulterantes em alimentos deve-se principalmente a possibilidade de associa-la à técnica de infravermelho médio. Esta técnica detecta bandas de absorção bem resolvidas, facilidade na identificação dos grupos funcionais e possui uma região de impressão digital (1200 a 700 cm-1), onde pequenas diferenças na estrutura e na

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constituição de uma substância resultam em uma significativa mudança na distribuição dos picos de absorção desta região do espectro (SKOOG; HOLLER; NIEMAN, 1998). Um grande número de trabalhos tem sido reportado utilizando espectroscopia de infravermelho médio com transformada de Fourier (FTIR-médio) em conjunto com PCA. Lai, Kemsley e Wilson em 1994 investigaram o potencial desta técnica para determinar a autenticidade de azeite de oliva refinado e azeite de oliva extra virgem. Apesar destas duas amostras de óleos serem quimicamente e espectroscopicamente muito semelhantes, elas foram corretamente classificadas, demonstrando o potencial desta metodologia para verificar a autenticidade destes produtos com grande rapidez. Zagonel, Peralta-Zamora e Ramos em 2004 desenvolveram um procedimento para monitorar a etanólise de óleo de soja degomado. Os reagentes (triglicerídeos) e os produtos (etil ésteres) envolvidos na etanólise possuem um espectro no infravermelho médio muito semelhante. Porém, quando os espectros derivados foram empregados na PCA, na região entre 1700-1800 cm-1, duas componentes principais mostraram capturar 99,95% da variância total dos dados espectrais. Um trabalho de classificação de carnes foi realizado por Al-Jowder, Kemsley, Wilson em 2002, utilizando espectroscopia de infravermelho médio e métodos quimiométricos, PCA, PLS e Análise Discriminante Linear (LDA) para a discriminação de adulterantes (coração, tripa, rim, e fígado) em carne de boi, mostrando-se eficiente. Sivakesava e Irudayaraj em 2002 classificaram adulterantes no mel por FTIR-médio através de refletância total atenuada. Os adulterantes considerados foram açúcares (glicose, frutose e sacarose) e açúcares invertidos (de cana de açúcar e de beterraba). Para classificação dos modelos foram utilizados LDA, compressão de dados via PCA e PLS, sendo que os adulterantes glicose, frutose e sacarose foram classificados com sucesso.

61

Dupuy et al. em 1997 também utilizaram PCA em conjunto com espectrometria de infravermelho médio (1500 cm–1 a 700 cm–1) e desenvolveram um método de classificação para amido de milho modificado. Apesar do grande potencial da análise por PCA, somente uma classificação parcial dos amidos em subgrupos foi possível. Isto é decorrente dos espectros de amido de milho serem muito semelhantes, o que torna a classificação mais difícil. Isto pode ser contornado incluindo dados de diversas amostras de todos os tipos de modificação do amido de milho encontrados na agroindústria.

2.5.4 Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e Regressão por Componentes Principais (PCR)

Dentre os métodos de análise multivariada quantitativos, destaque deve ser dado ao PLSR e ao PCR. Ambos são consideravelmente mais eficientes que os métodos multivariados tradicionais (MRL, CLS), principalmente para lidar com ruídos experimentais, colinearidade e não linearidade. Todas as variáveis independentes relevantes são incluídas nos modelos multivariados, o que implica que a calibração pode ser realizada eficientemente mesmo na presença de interferentes. Além disso, estes métodos são robustos, ou seja, seus parâmetros praticamente não se alteram com a inclusão de novas amostras no conjunto de calibração (FERREIRA et al., 1999). Particularmente, o PLSR tem se tornado uma ferramenta extremamente útil e importante nos diversos campos da ciência. Este método consiste em decompor as matrizes de dados X (variáveis independentes) e Y (variáveis dependentes) em uma soma de produtos de dois vetores (escores, t e u e pesos, p e q) cada um deles representando uma componente principal (Eq. 7 e 8). Esta metodologia pode ser aplicada em duas versões denominadas costumeiramente de PLSR1 e PLSR2. O algoritmo matemático é similar, sendo que no

62

PLSR1 um modelo é otimizado para cada um dos analitos, enquanto no PLSR2 um único modelo é obtido para todos os analitos simultaneamente. O procedimento de representar uma matriz de dados em termos de escores apenas modifica a maneira como se visualiza os dados e, portanto não ocorrem perdas de informação estatística relevante, com a vantagem de reduzir o espaço multidimensional das variáveis sem que haja correlação entre as mesmas.

X = t1p1 + t2p2 + .......+ tnpn + E

Eq.8

Y = u1q1 + u2q2 + .......+ unqn + E

Eq.9

Existem vários algoritmos matemáticos para calcular esta decomposição, sendo os mais populares conhecidos por NIPALS (GELADI; KOWALSKI, 1986) e Decomposição de Valor Singular (SVD). O modelo resultante para as decomposições mostradas na Eq. 8 e 9 estão representadas pelas Eq. 10 e 11.

X = TP’ + E

Eq. 10

Y = UQ’ + F

Eq. 11

Os elementos das matrizes T e U são os escores de X e Y respectivamente, e os elementos P e Q são os “pesos”. As matrizes E e F correspondem aos erros, ou seja o quanto o modelo construído não consegue explicar os dados originais. Um aspecto característico do método PCR é a construção das componentes principais utilizando unicamente a decomposição das respostas instrumentais (X) sem levar em consideração informações provenientes das concentrações (Y). Isto pode constituir uma fragilidade do método para aqueles casos em que o analito de interesse tem um sinal muito fraco e, portanto não influencia fortemente nas primeiras componentes principais, fazendo com que um número maior delas seja necessário para a construção do modelo.

63

A escolha entre estes dois métodos não pode ser aconselhada de uma forma genérica, uma vez que ambos são igualmente eficientes e as pequenas variações dependem de caso para caso. Muitos trabalhos trazem técnicas utilizando metodologias multivariadas em conjunto com técnicas espectrométricas para a análise quantitativa de alimentos. Lanza e Li (1984) utilizaram infravermelho próximo (NIR) em conjunto com PLSR para determinação de açúcares totais e açúcares individuais, empregando a 2a derivada dos espectros de transmitância em diferentes sucos de frutas como padrões de calibração. Bons resultados foram obtidos para açúcares totais, principalmente quando modelos de calibração separados foram feitos levando-se em consideração a qualidade dos sucos de frutas. Resultados com pouca precisão e sensibilidade foram obtidos para açúcares individuais, devido a forte sobreposição espectral de glicose, frutose e sacarose. No entanto, estudos realizados em material seco, cuja forma cristalina propicia maiores detalhes espectrais pela interação açúcar–açúcar possibilitou a determinação de açúcares individuais. Estes resultados são provavelmente decorrente da interação açúcar-água que faz os açúcares apresentarem espectros muito similares, devido a forte absorção da água nesta região. Li, Goovaerts, Meurens em 1996 conseguiram obter bons resultados com a combinação da técnica NIR e os métodos MLR e PLSR na determinação e quantificação de glicose, frutose, sacarose e ácido cítrico, em sucos de laranja. O extrato seco foi utilizado para evitar o alargamento das bandas pela sobreposição das bandas vibracionais da água, e melhores resultados foram obtidos empregando-se o método PLSR. Rambla, Garrigues, Guardiã em 1997 aplicaram NIR e PLSR para identificar e quantificar, glicose, frutose, sacarose e açúcares totais em misturas sintéticas, assim como em sucos de frutas empregando medidas de transmitância com 1º derivada. A calibração foi realizada de duas maneiras: com substâncias puras de cada um dos carboidratos e com

64

misturas binárias e ternárias de glicose, frutose e sacarose. Percebeu-se que os espectros glicose, frutose e sacarose absorvem em regiões muito parecidas, e a água novamente é o grande empecilho da determinação. Entre 1300 a 1800 nm observaram-se algumas diferenças nos espectros sendo possível identificar e quantificar nesta região o conteúdo de açúcares totais. Entre 2050 e 2300 nm grandes diferenças entre os compostos foram verificadas, possibilitando a quantificação de cada carboidrato separadamente em amostras contendo misturas. A primeira derivada eliminou problemas como a absorção da radiação de fundo em amostras reais (decorrentes da dispersão de partículas sólidas) e intensificou as diferenças entre os espectros correspondentes aos três carboidratos, porém a sensibilidade da determinação analítica foi reduzida. Também utilizando PLSR e técnicas de Espectrometria de Infravermelho Próximo com Transformada de Fourier (FT-NIR) foram determinadas as concentrações dos açúcares individuais (glicose, frutose e sacarose) em sucos de maçã e laranja. O modelo PLSR foi otimizado empregando-se validação cruzada e dados espectrais transformados para 2a derivada. A habilidade de previsão do modelo foi avaliada em sucos de frutas, comparando-se os resultados com a CLAE e as técnicas enzimáticas convencionais. Modelos gerados pelos espectros de transmitância forneceram as melhores performances analíticas com taxa de recuperação dos açúcares de 93%. A determinação de glicose e frutose nos sucos de maçã e laranja por NIR apresentou boa precisão e exatidão quando comparando-se aos métodos analíticos convencionais. No caso da sacarose, os resultados apresentaram-se superestimados no suco de maçã somente quando comparados com o método CLAE (RODRIGUEZ-SAONA et al., 2001). García- Alvarez et al. em 2002 realizaram um trabalho para determinar os parâmetros polarimétricos do mel por espectroscopia de transflectância NIR em conjunto com PLSR modificado (MPLSR), utilizando os dados espectrais com 1a e 2a derivada. Para isto, 156

65

amostras de mel foram coletadas durante os anos de 1992 (45 amostras), 1995 (56 amostras) e 1996 (55 amostras). A calibração foi realizada com 118 destas amostras, e a validação foi feita com as demais 38 amostras, utilizando todas as amostras coletadas nos três anos. Os resultados foram comparados com métodos polarimétricos convencionais evidenciando que a metodologia proposta não é efetiva para a análise quantitativa da sacarose no mel, sendo aceitável apenas como um método semi-quantitativo com um intervalo de confiança de 9,5% para os méis utilizados neste estudo. Utilizando FTIR-médio um método totalmente automatizado foi desenvolvido para a rápida determinação de ácidos orgânicos (ácido cítrico, málico e tartárico) e açúcares (glicose, frutose, e sacarose) em refrigerantes por injeção seqüencial. Dois modelos PLSR foram desenvolvidos, um para açúcares e outro para os ácidos orgânicos, baseados na análise dos padrões contendo todos os seis analitos. O método desenvolvido foi aplicado em amostras naturais, e seus resultados estão de acordo com os obtidos pelo método enzimático. O método desenvolvido é caracterizado pelo seu pequeno tempo de análise, simplicidade experimental e seu potencial para a aplicação em rotinas de análises envolvendo processos de controle de qualidade (LeTHANH; LENDL, 2000). Cadet et al. em 1991 aplicaram FTIR-médio com Refletância Total Atenuada (ATR) para determinar e quantificar sacarose em suco de cana-de-açúcar clarificado, utilizando PCR. Em decorrência da complexidade da matriz amostral (açúcares, ácidos orgânicos e aminoácidos), o espectro da sacarose pura mostrou-se muito diferente do espectro da sacarose em uma mistura. Em decorrência deste aspecto, os melhores resultados foram obtidos quando a calibração foi realizada com uma mistura de sacarose, frutose e glicose em água. Um trabalho mais amplo realizado por Cadet em 1999 utilizou PCR para processar espectros de FTIR-médio com ATR, com o objetivo de determinar não apenas sacarose, mas também glicose e frutose em amostras de suco de cana-de-açúcar, obtendo bons resultados.

66

O FTIR-médio e vários métodos de calibração multivariada PLSR, MLR e PCR foram utilizados para determinação de glicose, frutose e sacarose em extratos secos em amostras de diversos tipos de sucos de frutas. Os resultados apresentaram erros menores que 10%, comparáveis à determinação por CLAE, e com a vantagem do preparo das amostras e as leituras no espectrofotômetro serem dez vezes mais rápida que a técnica cromatográfica (DUPUY et al., 1992). Bellon (1993) propõe um método utilizando FTIR-médio, ATR e métodos multivariados (MLR, PCR e PLSR) para determinar a concentração de açúcares nos processos on-line de fabricação de vinhos. Os modelos PLSR1 com a 1a derivada dos espectros forneceram os melhores resultados, com erros 1,4; 1,4; 4,9% para frutose, sacarose e glicose, respectivamente. Utilizando um espectrofotômetro na faixa do visível Ni, Huang e Kokot em 2003, realizaram a determinação quantitativa de glicose, frutose e lactose em amostras de alimentos, baseada na cinética dos açúcares individuais empregando-se ferricianeto de potássio (K3Fe(CN)6) como oxidante. As cinéticas de oxidação destes açúcares foram otimizadas e processadas por métodos quimiométricos (PLSR, PCR, CLS, redes neurais artificiais com back propagation BP-ANN ou radial basis function RBF-ANN) utilizando a 1a derivada ou os dados cinéticos originais. Os resultados mostraram que a calibração baseada nos dados com aplicação da 1a derivada mostrou vantagens na fase de previsão dos analitos e os métodos RBF-ANN e PLSR apresentaram os menores RMSEP relativos (5,6 e 6,8 respectivamente) quando comparados aos outros métodos multivariados, tal como o CLS (RMSEP relativo de 8,7).

67

3

OBJETIVOS

3.1 OBJETIVOS GERAIS Através do presente trabalho propõe-se estudar a potencialidade de algumas alternativas multivariadas de calibração, para viabilizar a determinação qualitativa e quantitativa da classe de edulcorantes (naturais e artificiais) em adoçantes comerciais, via Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e Espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis).

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS -

Analisar qualitativamente adoçantes comerciais através da técnica de Espectrometria de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) associada à metodologia de Análise por Componentes Principais (PCA).

-

Avaliar a performance na identificação e classificação de diversos edulcorantes naturais e artificiais em marcas comerciais de adoçantes.

-

Analisar quantitativamente associações de lactose/aspartame e lactose/esteviosídeo, empregando-se as metodologias multivariadas de Regressão de Mínimos Quadrados Parciais (PLSR1 e PLSR2) e Regressão por Componentes Principais (PCR) aos dados espectrais extraídos da técnica de Espectrofotometria UV-Vis.

-

Selecionar os modelos de melhor desempenho considerando-se os dados de validação cruzada e validação externa.

-

Determinar quantitativamente os analitos de interesse em adoçantes de mesa vendidos nos supermercados locais.

-

Comparar os resultados com as informações cedidas pelo fabricante.

68

4

PARTE EXPERIMENTAL

4.1 REAGENTES

Todos os reagentes utilizados durante a preparação de amostras, análise via infravermelho (FTIR-médio) e de soluções (análise via espectrofotometria UV-Vis) foram de grau analítico PA. Os padrões de edulcorantes artificiais foram gentilmente cedidos pela Nutrasweet e pela Lowçucar. A água desionizada, utilizada para o preparo e diluição das soluções, foi obtida através de um sistema de purificação Permution Desionizador.

4.2

MATERIAL VOLUMÉTRICO

O preparo de soluções foi realizado utilizando-se balões volumétricos. As alíquotas foram tomadas em pipetas volumétricas previamente calibradas, ou através das micropipetas de volume variável citadas abaixo: -

Micropipeta Eppendorf com variação de volume no intervalo de 500-5000 µl.

-

Micropipeta Brand com variação de volume no intervalo de 100-1000 µl.

4.3 EQUIPAMENTOS

-

Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu ,modelo Multispec 1501.

-

Espectrômetro de Infra-Vermelho Shimadzu, modelo FTIR 8.400.

-

Prensa Shimadzu S72-120 KN

-

Balança Eletrônica BG 400 Gehaka

69

-

Balança Eletrônica ADA 210/C

-

Balança Eletrônica LAC 214 Quimis

-

Estufa com Circulação e Renovação de ar TE-394/2 Tecnal

4.4

PROGRAMAS COMPUTACIONAIS

-

Microcal OriginTM (Versão 5.0)

-

MATLAB for Windows (versão 4.0) utilizando-se o programa PLS Toolbox (versão 1.5)

-

Pirouette for Windows 3.11.

4.5 PROCEDIMENTO ANALÍTICO 4.5.1 Amostras para o modelo PCA Os adoçantes de mesa foram obtidos nos supermercados locais e a Tabela 5 apresenta a composição de cada adoçante de mesa utilizado neste trabalho. Para a análise destas amostras via FTIR, foram preparadas pastilhas contendo cerca de 1 mg do adoçante e 100 mg de KBr (grau analítico Merck). Para tal, processos de homogeneização e trituração da amostra e KBr foram realizados com o auxílio de um almofariz e pistilo de ágata. Posteriormente, toda a massa foi transferida cuidadosamente para o pastilhador onde uma pressão de 60 KN foi aplicada para a confecção da pastilha. As pastilhas foram secas à temperatura amena (60º C) por 6 horas, para garantir que os edulcorantes com instabilidade a altas temperaturas não fossem degradados. Os espectros foram obtidos na região de 4000 a 400 cm–1, resolução de 4 cm-1 (16 varreduras realizadas). Anterior as medidas de IV das amostras foi obtido um espectro da pastilha do branco (contendo apenas 100 mg de KBr).

70

Tabela 5- Composição declarada pelos fabricantes das amostras comerciais de adoçantes. Amostra

Veículo (%)

Edulcorantes

1

Lactose (93,75%)

Aspartame

2

Lactose (95,7%)

Aspartame

3

Dextrose e Maltodextrina

Aspartame

4

Lactose (93,75%)

Aspartame

5

Lactose

Ciclamato, Sacarina, Aspartame e Acesulfame-K

6

Lactose

Ciclamato, Sacarina, Aspartame e Acesulfame-K

7

Maltodextrina (91,0%)

Ciclamato e Sacarina

8

Maltodextrina

Sorbitol, Ciclamato e Sacarina

9

Lactose e Maltodextrina

Aspartame, Acesulfame-K

10

Lactose e Maltodextrina

Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo

11

Maltodextrina (80,0%)

Esteviosídeo

12

Maltodextrina (95,5%)

Ciclamato, Sacarina

13

Sacarose

Sucralose

14

Sacarose (99,7%)

Sucralose

15

Sacarose (97,0%)

Ciclamato, Sacarina e Aspartame

16

Sacarose (96,5%)

Ciclamato e Sacarina

17

Sacarose (99,7%)

Aspartame

18

Lactose (95,0%)

Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo

19

Lactose (93,0%)

Esteviosídeo

20

Lactose (95,0%)

Ciclamato, Sacarina e Esteviosídeo

21

Lactose (95,0%)

Aspartame

22

Lactose (95,4%)

Aspartame

4.5.2 Preparo das soluções para construção dos modelos PLSR e PCR 4.5.2.1 Amostras com Associação de Lactose e Aspartame As soluções-estoque de aspartame e lactose foram preparadas pela simples pesagem do padrão em balança analítica e posterior dissolução com água desionizada em balão volumétrico de 100 mL. Obteve-se então uma solução de concentração 1 g/100mL de aspartame, e outra contendo 2 g/100 mL de lactose.

71

Todas as outras soluções empregadas para este estudo (misturas sintéticas para a fase de calibração e previsão) foram obtidas por diluição com água desionizada de ambas as soluções-estoque. A Tabela 6 mostra a concentração de cada edulcorante nas 20 soluções empregadas para a construção dos modelos de calibração PLSR e PCR. Para a etapa de previsão foram preparadas 5 misturas sintéticas (Tabela 7) com concentrações dentro da faixa estabelecida no conjunto de calibração.

Tabela 6- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame utilizadas para construção dos modelos multivariados de calibração. Concentrações (g/100mL) Amostras

Lactose

Aspartame

1

0,264

0,00397

2

0,264

0,01191

3

0,264

0,01588

4

0,264

0,02382

5

0,272

0,00397

6

0,272

0,01191

7

0,272

0,01588

8

0,272

0,02382

9

0,280

0,00397

10

0,280

0,01191

11

0,280

0,01588

12

0,280

0,02382

13

0,288

0,00397

14

0,288

0,01191

15

0,288

0,01588

16

0,288

0,02382

17

0,296

0,00397

18

0,296

0,01191

19

0,296

0,01588

20

0,296

0,02382

72

Tabela 7- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e aspartame utilizadas para validação dos modelos multivariados de calibração. Concentrações (g/100mL) Lactose

Aspartame

0,272

0,0198

0,264

0,0079

0,288

0,0198

0,296

0,0079

0,280

0,0198

Os espectros de todas estas soluções foram obtidos em um Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu, modelo Multispec 1501 na região de 200 a 800nm com resolução de 1nm.

4.5.2.2 Amostras com Associação de Lactose e Esteviosídeo

As soluções-estoque de aspartame e esteviosídeo foram preparadas pela simples pesagem do padrão em balança analítica e posterior dissolução com água desionizada em balão volumétrico de 100 mL. Obteve-se então uma solução de concentração 2 g/100mL de lactose e outra contendo 0,1 g/100 mL de esteviosídeo. Todas as outras soluções empregadas para este estudo (misturas sintéticas para a fase de calibração e validação) foram obtidas por diluição com água desionizada de ambas as soluções-estoque. A Tabela 8 mostra a concentração de cada edulcorante nas 20 soluções empregadas para a construção dos modelos de calibração PLSR1 e PLSR2 e PCR. Para a etapa de previsão foram preparadas 5 misturas sintéticas (Tabela 9) com concentrações dentro da faixa estabelecida no conjunto de calibração. Os espectros das soluções foram obtidos em um Espectrofotômetro UV-Vis Shimadzu, modelo Multispec 1501 na região de 200 a 800 nm com resolução de 1 nm.

73

Tabela 8- Misturas sintéticas e suas respectivas concentrações de lactose e esteviosídeo utilizadas para construção dos modelos. Concentrações (g/100mL) Amostras

Lactose

Esteviosídeo

1

0,264

0,006

2

0,264

0,0148

3

0,264

0,024

4

0,264

0,032

5

0,272

0,006

6

0,272

0,0148

7

0,272

0,024

8

0,272

0,032

9

0,280

0,006

10

0,280

0,0148

11

0,280

0,024

12

0,280

0,032

13

0,288

0,006

14

0,288

0,0148

15

0,288

0,024

16

0,288

0,032

17

0,296

0,006

18

0,296

0,0148

19

0,296

0,024

20

0,296

0,032

Tabela 9- Faixa de concentração de lactose e esteviosídeo para a etapa de validação. Concentrações (g/100mL) Lactose

Esteviosídeo

0,264

0,0092

0,272

0,0268

0,280

0,018

0,288

0,012

0,296

0,030

74

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISE QUALITATIVA

A autenticidade é um critério importante para a qualidade dos alimentos, principalmente para produtos diet e light, pois a composição declarada na embalagem determina o preço do produto e possibilita que os consumidores escolham os edulcorantes naturais e artificiais que acreditam ser o mais seguro para a sua saúde. A troca de edulcorantes caros por edulcorantes baratos pode ser muito lucrativa para as indústrias, pois geralmente os consumidores não percebem a modificação, uma vez que o sabor do alimento adulterado pode ser muito semelhante ao produto legítimo. Infelizmente, ainda não existem técnicas rápidas e de baixo custo para a classificação e detecção de adulterantes. As técnicas atualmente disponíveis para este fim são complexas, requerem grande tempo de análise e alto custo, como por exemplo, as técnicas cromatográficas.

5.1.1 Análise por Componentes Principais (PCA)

Na literatura atual a PCA têm recebido muita atenção pela sua capacidade de classificação e também pela possibilidade de detecção de adulterantes. Além da sua grande capacidade de discriminação sob condições muito similares, ela conta muitas vezes com uma análise instrumental rápida e de baixo custo. A eficiência do PCA na análise de adulterantes em alimentos deve-se principalmente a possibilidade de associá-la à técnica de FTIR-médio, a qual possui características que possibilitam a classificação e detecção de adulterantes de forma única.

75

As amostras objetos deste estudo possuem estruturas semelhantes e muitas vezes grupos funcionais iguais, como pode ser evidenciado nas Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 apresentadas anteriormente e também na Figura 10.

(A)

(C)

(B)

(D)

Figura 10- Estruturas químicas (A) Frutose, (B) Glicose, (C) Lactose e (D) Sacarose. FONTE: CÂNDIDO; CAMPOS, 1996.

Esta semelhança estrutural e a mistura de edulcorantes nos produtos comerciais fazem com que o espectro de FTIR-médio dos adoçantes seja muito semelhante. Estas características impossibilitam a diferenciação e/ou classificação dos diferentes adoçantes apenas pela simples análise visual dos espectros. A Figura 11 mostra a grande quantidade de informação similar que os espectros de FTIR-médio de adoçantes comerciais possuem, o que evidencia a necessidade de uma ferramenta que possibilite analisar qualitativamente este tipo de amostras. A Análise por Componentes Principais (PCA) foi a ferramenta analítica empregada com o intuito de classificar os adoçantes de mesa de acordo com a sua composição, ou seja, certificar e caracterizar a presença dos edulcorantes naturais e artificiais. Esta análise foi realizada inicialmente pelo processamento dos dados da transmitância de toda faixa espectral

76

do infravermelho (4000 cm-1 a 400 cm-1, conforme mostra a Figura 11) utilizando o programa Pirouette for Windows 3.11. Foram testados os dados originais e alguns tipos de transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de préprocessamento com dados centrados na média.

Figura 11- Espectro de infravermelho médio para as 22 amostras (Tabela 5) analisadas via PCA na região espectral entre 400 cm-1 a 4000 cm-1.

A melhor classificação para os adoçantes de mesa foi obtida pela aplicação da 1a derivada aos dados espectrais. Geralmente, este procedimento realiza uma espécie de deconvolução parcial de sinais não totalmente sobrepostos, o que possibilita que pequenas diferenças sejam mais bem evidenciadas por este tipo de transformação. A análise de escores da CP1 vs CP2 (Figura 12) apresenta uma clara separação das amostras pelos veículos que a compõem.

CP2

77

CP1

Figura 12- Gráfico de escores para as 1a e 2a componentes principais na análise de adoçantes de mesa.

Pela análise de escores é possível observar que para altos valores de CP1 estão as amostras de adoçantes de mesa que possuem o veículo lactose (1, 2, 4, 5, 6, 18, 19, 20, 21 e 22) e para baixos valores de CP1 apresentam-se as amostras com veículo sacarose (13, 14, 15, 16 e 17) e maltodextrina (7, 8, 11 e 12). Enquanto isso, a CP2 propicia duas outras separações, a dos outros veículos (sacarose e maltodextrina) e também uma que envolve a participação dos edulcorantes artificiais utilizados para a produção dos adoçantes de mesa. Na primeira, as amostras com veículo sacarose agrupam-se na região positiva da CP2, enquanto inversamente as amostras com veículo maltodextrina na região negativa da CP2. A segunda separação que a CP2 propicia é menos evidente e retrata diferenciações entre as amostras com veículo lactose. Para altos valores de CP2 encontram-se as amostras

78

com composição lactose e aspartame e para baixos valores de CP2 encontram-se as amostras com composição lactose e diversos edulcorantes. Neste ponto da análise é possível observar a localização errônea (Figura 12) em termos de escores da amostra 6 (composição: lactose, ciclamato, sacarina, acesulfame e aspartame), que aparece no grupo das amostras de composição lactose e aspartame em valores positivos de CP1 e valores positivos de CP2. Em função das características desta amostra, sua localização correta deveria ser valores positivos de CP1 e negativos de CP2, junto das amostras com composição lactose e uma combinação de edulcorantes, mas especificamente junto da amostra 5 já que possuem a mesma composição. Comparando os espectros das amostras 5 e 6 na região entre 752,19 a 1284,5 cm-1, é possível observar uma grande semelhança de bandas, diferindo-se apenas nos valores de transmitância. Esta característica pode ser decorrente da concentração distinta dos componentes destes adoçantes ou da diferenças cristalinidade das amostras na preparação das pastilhas de KBr.

95

Amostra 5 Amostra 6

90 85

Transmitância (%)

80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 700

800

900

1000

1100

1200

1300

-1

Comprimento de onda (cm )

Figura 13- Espectro de infravermelho médio para a amostra 5 e 6 na região espectral entre 752,19 cm-1 a 1284,5 cm-1.

79

Este comportamento anômalo ocasionou a retirada da amostra 6 do conjunto de amostras em estudo e, portanto uma nova PCA foi realizada, mantendo as mesmas características analisadas anteriormente. As amostras 9 e 10 não foram citadas anteriormente pois possuem uma particularidade, ambas contém na sua composição dois diferentes veículos, lactose e maltodextrina. A localização destas amostras em termos de escores mostra que elas não apresentam nem valores muito positivos (igual às amostras contendo veículo lactose) e nem negativos (igual às amostras contendo veículo maltodextrina) na CP1, indicando que o veículo deve ter realmente uma composição mista e uma menor concentração de lactose. Uma tendência similar ocorre com a amostra 3, que possui como veículo a mistura de maltodextrina e dextrose. Em função das diferenças de composição, enquanto as amostras que possuem exclusivamente maltodextrina aparecem agrupadas em valores negativos de CP1 e CP2, a amostra 3 particularmente aparece deslocada no sentido de valores mais negativos de CP2 que as demais amostras. Para evidenciar as regiões espectrais de FTIR-médio importantes para a organização em grupos verificada pelos escores (Figura 12), é necessário observar o gráfico de pesos (Figura 14) que mostra os comprimentos de ondas imprescindíveis na forma de pesos (positivos ou negativos) para classificação observada.

Pesos

80

-1

Comprimento de onda (cm )

Figura 14- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) componentes principais na análise de adoçantes de mesa.

A análise dos pesos para esta CP fica muito prejudicada, pois há uma grande quantidade de comprimentos de onda, sendo grande parte deles compostas por valores de peso próximo de zero (variáveis de menor importância). Isto dificulta a visualização dos comprimentos de onda realmente importantes para a classificação das amostras. Em função destes aspectos, os comprimentos de onda com valores de pesos próximos de zero foram sistematicamente retirados, sem que houvesse a perda das características de classificação observadas anteriormente. Constatou-se que a região espectral de maior importância (valores altamente positivos e negativos de pesos) para a classificação das amostras encontra-se entre 752,19 a 1284,5 cm-1. Nesta região, é possível observar similaridades entre os espectros dos adoçantes com o mesmo veículo, conforme mostra a Figura 15.

81

100 90

Amostra 1 Amostra 2 Amostra 4 Amostra 5 Amostra 6 Amostra 9 Amostra 10 Amostra 18 Amostra 19 Amostra 20 Amostra 21 Amostra 22

Transmitância (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 700

800

900

1000

1100

1200

1300

-1

Comprimento de onda (cm )

(A)

120

Transmitância (%)

100

Amostra 3 Amostra 7 Amostra 8 Amostra 10 Amostra 11

80

60

40

20 700

800

900

1000

1100

1200

1300

-1

Comprimento de onda (cm )

(B)

120 110 100

Transmitância (%)

90 80

Amostra 13 Amostra 14 Amostra 15 Amostra 16 Amostra 17

70 60 50 40 30 20 10 700

800

900

1000

1100

1200

1300

-1

Comprimento de onda (cm )

(C)

Figura 15- Espectro de infravermelho dos adoçantes de mesa nos comprimentos de onda entre 752,19 a 1284,5 cm-1. (A) veículo lactose, (B) veículo maltodextrina e (C) veículo sacarose.

82

Destaque deve ser dado ao espectro da amostra 3 (em preto) na Figura 15 (B) que apresenta um comportamento espectroscópico diferenciado em função da mistura de veículos presentes nesta amostra (maltodextrina e dextrose). Esta diferença também foi evidenciada anteriormente na primeira PCA. Portanto, são estas similaridades (Figura 15) e diferenças (Figura 16) nos dados espectrais desta região que fazem com que os adoçantes de mesa possam ser agrupados de maneira distinta. Aqueles que possuem o mesmo veículo se agrupam em um mesmo quadrante no gráfico de escores, enquanto amostras com veículos diferentes não.

110

Lactose Sacarose

100

Transmitância (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 700

800

900

1000

1100

1200

1300

-1

Comprimento de onda (cm )

Figura 16- Espectro de infravermelho médio na região espectral de interesse para Lactose pura e Sacarose pura. A classificação obtida via PCA, baseia-se principalmente nos diferentes tipos de veículos que compõem os adoçantes de mesa comerciais e não no tipo de edulcorante artificial utilizado na sua fabricação. Isto ocorre porque o espectro FTIR-médio dos adoçantes corresponde ao espectro de uma mistura, veículo + edulcorantes. Como o veículo é o componente em maior quantidade (correspondem a mais de 90% do conteúdo total em todas as amostras) o espectro é muito semelhante ao espectro do veículo puro. Este resultado não

83

indica a falta de representatividade dos edulcorantes artificiais, mas sim das suas baixas concentrações e da alta sobreposição espectral devido à combinação de vários edulcorantes artificiais. Com estas evidencias um novo modelo foi construído com as seguintes características: 1a derivada dos dados de transmitância na região de comprimentos de onda entre 752,19 a 1284,5 cm-1, com dados centrados na média e sem a amostra 6. Com este novo modelo, duas componentes principais são responsáveis pela distinção entre os veículos. A 1a componente principal descreve 62,53% da variância dos dados, enquanto a 2a componente principal 19,67%, totalizando 82,21%. A Figura 17 mostra os escores da nova PCA, cuja classificação para as amostras permanece a mesma do modelo anterior. No entanto, durante a análise dos pesos (Figura 18), é possível identificar os comprimentos de onda com os pesos responsáveis pela classificação

CP2

das amostras. (pesos mais positivos ou negativos).

CP1

Figura 17- Gráfico de escores para as 1a e 2a CP para a análise dos adoçantes de mesa na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6.

84

Figura 18- Gráfico de pesos para as 1a (vermelho) e 2a (verde) CP para a análise dos adoçantes na faixa espectral entre 752,19 a 1284,5 cm-1 e sem a amostra 6.

Analisando o gráfico de escores, Figura 17, observa-se claramente que todas as amostras que possuem o veículo lactose em sua composição encontram-se em altos valores positivos de CP1. Através da análise dos pesos, Figura 18, verifica-se que os valores mais positivos de peso para a CP1 ocorre em sinais localizados no comprimento de onda 902,62 cm-1 (alto valor positivo de peso = 0,2016), 1043,42 cm-1 (peso = 0,1583), 1099,35 cm-1 (peso = 0,1305) e 879,48 cm-1 (peso = 0,1108). Estes sinais estão presentes no espectro derivado da lactose pura, mas não dos outros edulcorantes, conforme mostra a simbologia * na Figura 19. Por outro lado, as amostras que apresentam na sua composição o veículo sacarose ou maltodextrina encontram-se em valores negativos de CP1. Observando-se o gráfico de pesos, verifica-se que os valores mais negativos de peso para a CP1 ocorre em um sinal localizado no comprimento de onda 871,76 cm-1 (alto valor negativo de peso = -0,2020), seguido pelo sinal em 1016,41 cm-1 (valor negativo de peso = -0,1612). Isso indica que a ausência de sinais

85

característicos da lactose e/ou a presença de um sinal na região de 871,76 cm-1 e 1016,41 cm-1 (conforme simbologia * na Figura 19) separa os veículos que compõem os adoçantes de mesa. A Figura 19 mostra o espectro derivado de aspartame, lactose e sacarose puros, para ilustrar os sinais nos seus respectivos comprimentos de onda, associados à classificação das amostras de adoçantes.

6

* * **

4

Derivada da Transmitância

Aspartame Lactose Sacarose

2

*

*

* 0

*

-2

*

-4

-6 800

850

900

950

1000

1050

1100

1150

1200

-1

Comprimento de onda (cm )

Figura 19- 1a derivada dos espectros FTIR-médio de padrões de Aspartame, Lactose e Sacarose.

Em relação a CP2, é possível realizar 02 distinções. Na primeira, as amostras com escores negativos na CP1 formam dois subgrupos, ou seja, aquele com escores positivos na CP2 (amostras com veículo sacarose) e o outro com escores negativos na CP2 (amostras contendo veículo maltodextrina). Neste último caso, uma amostra (smp3) apresenta um comportamento diferenciado, localizando-se nas regiões mais negativas de CP2. Este aspecto é provavelmente decorrente da presença (dextrose) com sinal nos comprimentos de onda

86

842,83 cm-1 e/ou 1031,85 cm-1, sinais estes que apresentam valor de peso negativo na CP2, sendo –0,1816 e –0,1649 respectivamente. A segunda distinção possível de ser realizada analisando-se a CP2 está relacionada ao agrupamento deslocado na região positiva de CP1. Uma pequena diferença pode ser observada entre as amostras compostas basicamente por lactose/aspartame (se localizam na região positiva de CP2) daquelas composta por lactose/mistura de edulcorantes artificiais (tendendo à região negativa de CP2). Este deslocamento para regiões positivas de CP2 das amostras contendo apenas lactose/aspartame pode ser associado aos pesos (Figura 18) que indicam que os valores mais positivos de peso para a CP2 ocorre em sinais localizados no comprimento de onda 1143,42 cm-1 (alto valor positivo de peso = 0,1530) e 1074,28 cm-1 (peso = 0,1078). Estes sinais estão presentes no espectro derivado do aspartame puro conforme mostra a Figura 19 associada à simbologia *. Associando-se as informações cedidas por alguns fabricantes de adoçantes de mesa e a análise deste modelo multivariado é possível inferir dados para uma análise semi-quantitativa da concentração do veículo lactose (amostras com valores positivos de CP1) que compõem algumas destas amostras. Este conjunto pode ser subdivido em 4 subgrupos (destacados na Figura 17). Os subgrupos 1 e 2 estão localizados em valores positivos na CP2, enquanto os subgrupos 3 e 4 em valores negativos de CP2. Os subgrupos 1 e 2, são constituídos por amostras cuja composição é feita somente de lactose e aspartame. Através de dados fornecidos pelos fabricantes, a concentração de lactose para as amostras que fazem parte do subgrupo 1 é de aproximadamente 95%. No segundo subgrupo, a concentração de lactose cai para 93,75%. No caso dos subgrupos 3 e 4 estão as amostras cuja composição é feita de lactose e uma mistura de edulcorantes artificiais, e a mesma tendência exposta anteriormente pode ser

87

observada. Ou seja, para o subgrupo 3 as amostras possuem uma concentração de lactose de 95% e o subgrupo 4 esta concentração cai para 93%. Em função dos resultados apresentados neste item, é possível observar que a técnica de FTIR-médio acoplado a métodos multivariados além de demonstrar seu grande potencial na classificação, dá evidências da possibilidade de realização de uma análise semiquantitativa para os componentes majoritários das amostras analisadas. Esta ferramenta de baixo custo e simples operação possibilita um controle qualitativo eficiente no qual apenas as amostras suspeitas poderiam ser levadas para uma análise mais minuciosa.

5.2 ANÁLISE QUANTITATIVA

Nesta etapa, o objetivo maior está representado pelo desenvolvimento de uma metodologia eficiente na quantificação de edulcorantes naturais e artificiais em adoçantes de mesa via processos de calibração multivariada (PLSR1, PLSR2 e PCR) acoplados a espectrofotometria de UV-Vis. A espectrofotometria de UV-Vis apresenta uma série de características favoráveis, é uma técnica consolidada, de fácil implementação, baixo custo e alta sensibilidade. No entanto, a sua utilização como recurso quantitativo fica seriamente comprometida devido a sua baixa seletividade. A utilização de metodologias multivariadas acopladas à técnica de UV-Vis têm demonstrado superar de maneira muito eficiente esta dificuldade, isto porque toda a informação fornecida pela técnica instrumental utilizada é explorada, condição que favorece a previsão de uma resposta de interesse, com discrepância mínima, mesmo em condições severas de interferência inter-espécies.

88

5.2.1 Composição Lactose e Aspartame

O aspartame é um dos edulcorantes que possui as maiores dificuldades de determinação e quantificação, pois as técnicas hoje existentes requerem um tempo de análise muito grande e não possuem a seletividade necessária para sua determinação em amostras comerciais. Em função do grande número de produtos que possuem aspartame na sua composição e sabendo que tanto este analito quanto à lactose absorvem no UV-Vis, este sistema foi selecionado para desenvolvimento deste trabalho. Em função da baixa seletividade da técnica UV-Vis, foi possível observar uma alta interferência espectral na região do ultravioleta entre os dois compostos de interesse (lactose e aspartame), conforme mostra a Figura 20. 0.10

Aspartame Lactose

Absorbância (u.a.)

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00 200

250

300

350

400

Comprimento de onda (nm)

Figura 20- Espectro UV-VIS de soluções-padrão de Lactose e Aspartame.

Os modelos de calibração multivariada foram desenvolvidos utilizando-se 20 misturas sintéticas, sendo cada um deles, posteriormente validado por um conjunto de 5 misturas

89

sintéticas (conforme descrito no item 4.5.2.1, página 71). Os espectros foram inicialmente processados na sua totalidade (200 nm a 800 nm). 1.6 1.4

Absorbância (u.a.)

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -0.2 200

300

400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 21- Espectro UV-Vis para as 20 misturas sintéticas de lactose e aspartame utilizados para a etapa de calibração do modelo PLSR1, PLSR2 e PCR.

5.2.1.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame 5.2.1.1.1 PLSR2 Durante a fase de calibração o conjunto composto pelos espectros das 20 misturas sintéticas (Tabela 6, página 71) foi correlacionado com as suas respectivas concentrações. Nesta etapa, além da utilização dos dados espectrais na sua forma original, foram testados alguns tipos de transformação de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de pré-processamento com dados centrados na média, utilizando-se o programa PLS Toolbox em ambiente Matlab para Windows. Na procura de um modelo que representasse adequadamente a quantificação de todo o conjunto de elementos que compõe a matriz em questão, inúmeros modelos foram desenvolvidos e com base nos vários modelos, verificou-se que a capacidade de previsão é

90

influenciada por vários fatores, tais como: transformações dos dados e regiões espectrais relevantes. Combinando todos estes fatores o número de modelos de calibração desenvolvidos foi muito grande e todos com capacidade de previsão distinta, porém somente um modelo foi escolhido. O modelo PLSR2 foi desenvolvido inicialmente utilizando-se dados espectrais na forma original, dados centrados na média e procedimento de validação cruzada. Neste último procedimento, a calibração pode ser repetida n vezes (n = número de amostras), sendo que em cada oportunidade uma das amostras do conjunto de calibração é retirada e utilizada como amostra de previsão. Uma vez que todas as amostras tenham sido tratadas como objeto de previsão, é possível estimar a Soma dos Quadrados dos Erros de Previsão (PRESS) dada pela Eq. 12 e escolher o número de componentes principais com obtenção do menor PRESS.

PRESS = Σ (CREAL – CPREVISTO)2

Eq. 12

Sendo assim, a partir do procedimento de validação cruzada foi possível verificar que após a 3a componente principal não existe nenhum ganho significativo em termos de minimização do PRESS, conforme mostra a Figura 22. Além disso, estas 3 primeiras CP já são responsáveis pela explicação de aproximadamente 97,32% da variância dos dados. O gráfico de coeficientes de regressão, Figura 23, indica que existem regiões no espectro de UV-Vis com pouca informação analítica para o controle analítico em questão. Basicamente, trata-se daquelas regiões que apresentam coeficientes de regressão próximos de 0 (zero). Com base nos vários modelos desenvolvidos percebeu-se que a retirada das regiões com pouca informação analítica contribui para a melhora da capacidade de previsão do modelo. Portanto somente a região espectral entre 200 a 240 nm foi mantida.

91

3

x 10

-3

2.5

PRESS

2

1.5

1

0.5

0

0

2

4 6 8 Número de Componentes Principais

10

12

Figura 22- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame.

6

x 10

-3

4

Coeficientes de Regressão

2 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12

0

100

200

300 400 Número de Variáveis

500

600

700

Figura 23- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e aspartame (cinza) com espectro completo (canais 1 a 600).

92

A construção de um novo modelo de calibração com dados originais na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canais 1 a 40), foi realizada. O procedimento de validação cruzada evidenciou a minimização do PRESS desenvolvendo um modelo com 3CP (Figura 23A) responsáveis pela explicação de 95,95% da variância dos dados. Este dado foi confirmado através da análise do conjunto de validação externa que apresentou melhor capacidade de previsão, realizando a análise com menor erro relativo de previsão. O modelo embasado nos coeficientes de regressão (Figura 24B) mostra claramente que a região espectral escolhida apresenta informação analítica relevante para o controle quantitativo em questão. 3

x 10

-3

2.5

PRESS

2

1.5

1

0.5

0

0

2

6

x 10

4 6 8 Número de Componentes Principais

10

12

(A)

-3

4

Coeficientes de Regressão

2 0 -2 -4 -6 -8 -10 -12

0

5

10

15

20 Canais

25

30

35

40

(B) Figura 24- Desenvolvimento do modelo PLSR2 para Lactose e Aspartame na análise de adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de regressão nos comprimentos de onda entre 200 a 240 nm (canais 1 a 40).

93

A Figura 25 mostra que as concentrações previstas pelo modelo são muito próximas do valor real. No entanto, o PLSR2 por se tratar de um modelo que engloba uma otimização global para todos os analitos em questão, apresenta uma curva com uma ampla faixa de concentração. Este fato faz com que dois conjuntos sejam observados, àqueles com baixa concentração representados pela previsão de aspartame (menor concentração) e àqueles com alta concentração representados pela previsão de lactose (maior concentração).

0.35

0.3 4 3 2 1

Valor Previsto

0.25

17 19 18 1320 14 15 9 16 12 11 10 5 8 7 6

0.2

0.15

0.1

0.05 20 16 4 8 12 3 19 11 7 18 6 14 10 215 9 17 5 1 13 0 0 0.05

0.1

0.15 0.2 Valor Real

0.25

0.3

0.35

Figura 25- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais na análise de lactose e aspartame.

Com o intuito de melhorar a visualização da concordância entre os valores reais e previstos pelo modelo construído para ambos analitos, seus dados foram separados, gerando a Figura 26. Nela é possível observar que existe uma tendência pouco linear para os dados de lactose, enquanto para aspartame os valores previstos são bem concordantes com os valores reais.

Valor Previsto

Valor Previsto

94

0.300 0.295 0.290 0.285 0.280 0.275 0.270 0.265 0.260 0.255 0.260 0.025

Lactose 0.265

0.270

0.275

0.280

0.285

0.290

0.295

0.300

Valor Real

0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 0.000

Aspartame 0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

Valor Real

Figura 26- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais para lactose e aspartame separados.

O gráfico dos resíduos em função da leverage (Figura 27) é utilizado para mostrar evidências que sugerem a existência de amostras anômalas (outliers) no conjunto utilizado para construir o modelo. Na literatura, é descrito que padrões com um valor de leverage (medida de influência de uma amostra no modelo de regressão) maior que 3p/n (onde p corresponde ao número de componentes principais considerados para o modelo e n ao número de padrões de calibração) (FERREIRA, ANTUNES, MELGO, 1999) podem ser consideradas como diferentes das demais e com isso representar anomalias que prejudiquem o modelo de calibração. Por outro lado, o contrário também pode ocorrer. Amostras com alta leverage, e baixo resíduo podem ser informativas e, portanto importantes para a construção do modelo de calibração. No caso do modelo em questão, o limite do valor de leverage é de 0,45, e portanto nenhum padrão de calibração se encontra fora do limite pré-estabelecidos. Considerando-se que os resíduos na forma de student apresentam uma distribuição normal é possível aplicar um teste t para verificar se as amostras estão dentro da distribuição

95

com um nível de confiança de 95%. De acordo com antecedentes bibliográficos (FERREIRA, ANTUNES, MELGO, 1999), amostras com resíduo superior a 2,5podem corresponder a amostras anômalas, devendo ser cautelosamente estudadas. Uma amostra com alta leverage e alto resíduo na forma de student apresenta indícios suficientes para ser considerada uma amostra anômala, pois ela é muito diferente das amostras do conjunto de calibração e os valores previstos pelo modelo recém-construído são bastante discordantes dos valores reais. A partir destas premissas, constatou-se que nenhum dos padrões de calibração apresenta comportamento anômalo.

2.5 1

2 8 Resíduos na forma de Student

1.5

10 20 2 2

13

1 19 6

0.5

9 1218 16

15

0 11 -0.5

11 7

4 10 14 3 18 5 13 16 6 12 4 19

7 -1

20

17 8 9

-1.5

17

15

1 5

3 -2 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25 Leverage

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

Figura 27- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e aspartame.

A otimização do modelo de calibração PLSR2 para a associação lactose/aspartame contou também com a utilização de um conjunto de validação externa (Tabela 7, página 72), sendo que para cada modelo desenvolvido calculou-se os valores da Raiz Quadrada da Soma dos Erros de Previsão (RMSEP, Eq. 13), conforme mostra a Tabela 10.

96

RMSEP = (Σ(CREAL – CPREVISTA)2/n)1/2

Eq. 13

Onde: CREAL é a concentração real, CPREVISTO é a concentração estimada pelo modelo e n é o número de amostras do conjunto de validação. O modelo mais adequado (destacado em negrito na Tabela 10) foi aquele utilizando dados originais, pré-processamento com dados centrados na média e escolha de 3 CP. A Tabela 11 mostra os resultados da previsão e erros relativos para a determinação de lactose e aspartame do conjunto de validação externa (Tabela 7, 72) empregando-se o modelo mais adequado.

Tabela 10- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos RMSEP

RMSEP

Nº de

Lactose

Aspartame

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,0209

8,00 E-3

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0209

3,85 E-4

3

1 derivada, todos os comprimentos de onda

0,0205

7,40 E-4

4

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0202

6,40 E-4

3

2a derivada, todos os comprimentos de onda

0,024

1,20 E-3

7

Metodologia PLSR2

a

Considerando que o aspartame é um edulcorante com grandes dificuldades de análise, e as concentrações empregadas são muito baixas, os resultados da sua previsão para o conjunto de validação externa foram satisfatórios. O mesmo não pode ser dito para a análise quantitativa de lactose. Embora sua concentração seja muito superior ao aspartame, percebe-se que os valores previstos são praticamente iguais para todas as amostras do conjunto de validação externa. Ou seja, parece que o método analítico aplicado não consegue diferenciar as concentrações de lactose estudadas (que variam de 0,27 a 0,30 g/100 mL). Em função destes aspectos, um método

97

univariado foi realizado para confirmar a influência das diferentes concentrações de lactose na análise de aspartame.

Tabela 11- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR2. Concentração real

MODELO PLSR

(g/100 mL)

Conc. prevista (g/100 mL) e Erro relativo (%)

Lactose

Aspartame

Lactose

Erro

Aspartame

Erro

0,272

0,0198

0,2947

8,3

0,0199

0,5

0,264

0,0079

0,2985

13,1

0,0079

0,0

0,288

0,0198

0,2968

3,0

0,0195

-1,5

0,296

0,0079

0,3009

1,6

0,0071

-10,1

0,280

0,0198

0,2993

6,9

0,0198

0,0

Para este fim, dados de absorbância no comprimento de onda de absorção máxima do aspartame (212 nm) foram coletados para diferentes concentrações de aspartame e lactose, conforme mostra a Tabela 12.

Tabela 12- Concentrações de aspartame e lactose com absorbância em 212 nm obtida de misturas sintéticas utilizadas na construção na calibração convencional. Concentração (g/100mL)

Absorbância (u.a.)

Lactose

Aspartame

212 nm

0,264

0,00397

0,781

0,272

0,01191

1,1219

0,280

0,01588

1,1095

0,288

0,02382

0,9776

0,264

0,00794

0,8885

98

Uma representação gráfica destes dados é apresentada na Figura 28, cuja dispersão dos dados indica que não existe uma linearidade na relação concentração de aspartame e absorbância em 212 nm na presença de diferentes concentrações de lactose. Estes resultados evidenciam que embora o modelo multivariado não consiga distinguir as diferentes concentrações de lactose (na faixa estudada) este dado tem influência na absorção molecular em 212 nm e impede que o aspartame possa ser determinado quantitativamente sem conhecimento da concentração de lactose.

1.15 1.10

Absorbância (u.a.)

1.05 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

[Aspartame] (%)

Figura 28- Curva de calibração convencional para a determinação de aspartame em diferentes concentrações de lactose.

5.2.1.1.2 PLSR1 Uma vez que o sistema PLSR1 otimiza um modelo para cada composto de interesse, é possível realizar um ajuste mais fino, obtendo-se, na maioria dos casos, modelos com melhor capacidade de previsão. Evidentemente, a aplicação desta forma operacional envolve alguns problemas de caráter prático, principalmente relacionados com a necessidade de investir maior tempo para a elaboração do modelo.

99

Embora cada modelo tenha sido desenvolvido de maneira isolada, procurando-se condições particulares que promovessem uma melhor capacidade de previsão, a estratégia de trabalho, foi praticamente a mesma. Desta forma, os resultados serão apresentados e a discussão será realizada apenas para aqueles casos onde uma interpretação diferenciada do que foi apresentado anteriormente seja necessária.

A) Lactose O modelo de calibração PLSR1 foi inicialmente desenvolvido utilizando toda a faixa espectral, 200 a 800 nm, conforme Figura 21. Durante esta etapa foram testados os dados originais e alguns tipos de transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de pré-processamento com dados centrados na média. Tal como observado nos estudos envolvendo o processo PLSR2, verificou-se que uma melhora na capacidade de previsão do modelo utilizando-se dados originais. Assim como no modelo anterior (PLSR2), o gráfico de coeficientes de regressão, indica que existem regiões no espectro de UV-Vis com pouca informação analítica para o controle analítico em questão. As regiões que apresentam coeficientes de regressão próximos de 0 (zero) foram retiradas, restando somente a região espectral entre 200 a 240 nm (canais 1 a 40). O modelo PLSR1 foi então desenvolvido a partir do procedimento de validação cruzada e os resultados de PRESS em função do número de componentes principais demonstraram que a partir da 3a CP não ocorrem melhoras significativas no PRESS (Figura 29A) sendo explicado 94,47 % da variância dos dados. A retirada de boa parte da região espectral inicial, propicia a construção de um modelo com os coeficientes de regressão apresentados na Figura 29B. Novamente, os dados da validação cruzada foram confirmados

100

através dos resultados da capacidade de previsão do modelo para o conjunto de validação externa. Apesar do sistema estudado PLSR1 envolver a quantificação de apenas 1 analito (lactose), é possível verificar que um maior número de componentes principais é necessário para melhorar a capacidade de previsão do modelo multivariado. A necessidade de duas CP a mais, provavelmente é decorrente da modelagem de não-linearidades do sistema estudado.

-3

-4

9

x 10

4

8

2

7 Coeficientes de Regressão

0

PRESS

6 5 4 3

-2 -4 -6

-8

2

-10

1 0 0

x 10

2

4 6 8 Número de Componentes Principais

10

12

-12 0

5

10

15

20 Canais

(A)

25

30

35

40

(B)

Figura 29- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40).

Pode ser observado que o gráfico de valores previstos vs valores reais (Figura 30A), não se caracteriza pela formação de dois grupos e uma melhor visualização do ajuste do modelo pode ser observada. Este fato é decorrente da curva apresentar somente valores para a concentração de lactose (concentração majoritária). Outro fato relevante é a presença de 5 agrupamentos que representam as cinco diferentes concentrações de lactose empregadas nas soluções utilizadas para construção do conjunto de calibração.

101

0.3

2.5

0.295 0.29

2

Resíduos na forma de Student

13 14 15 16

0.285 Valor Previsto

1

17 19 18 20

9 12 11 10

0.28 5 8 7 6

0.275 0.27

1.5 20 2

1 19 0.5 16 15

0 11

0.265

4 3

-0.5

0.26

2

-1

0.265

17

10 14 3 6

13

12

4

7 8 9

1 0.255 0.26

18

0.27

0.275

0.28 Valor Real

0.285

0.29

0.295

0.3

-1.5 0

0.05

0.1

0.15

5 0.2

0.25 Leverage

0.3

0.35

0.4

0.45

(A)

0.5

(B)

Figura 30- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais para os padrões de calibração; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage.

A análise de amostras anômalas foi realizada da mesma maneira descrita anteriormente. Não foram identificadas anomalias em função dos valores de resíduos na forma de student, nem em função da leverage (Figura 30B). Levando-se em consideração todos os aspectos abordados, vários modelos foram construídos e todos eles avaliados a partir do valor de RMSEP obtido para o conjunto de validação externa (Tabela 13). Conforme destacado em negrito, o melhor modelo apresentou as seguintes características: dados originais de absorbância na faixa de 200 a 240 nm, com pré-processamento de dados centrados na média, e ausência de amostras anômalas.

Tabela 13- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Lactose Metodologia PLSR 1

RMSEP

Nº de

Lactose

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,0209

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0209

3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0220

3

2a derivada, todos comprimentos de onda

0,0220

6

102

Os resultados de previsão do modelo de melhor desempenho para o conjunto de validação externa são apresentados na Tabela 14.

Tabela 14- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1 (lactose). Concentração Real (g/100 mL) Lactose 0,272

MODELO PLSR1 Concentração Prevista e Erro Relativo Lactose (g/100 mL) Erro Relativo (%) 0,2947 8,3

0,264

0,2985

13,1

0,288

0,2969

3,1

0,296

0,3009

1,6

0,280

0,2994

6,9

Conforme pode ser observado na Tabela 14 este procedimento levou ao estabelecimento de um modelo com capacidade de previsão muito similar ao modelo PLSR2 (Tabela 11) com os mesmos problemas relatados anteriormente, ou seja, com valores de previsão sempre muito parecidos. Como se trata de um modelo multivariado totalmente otimizado para a análise de lactose, os resultados continuam a indicar que a metodologia adotada é pouco eficiente na análise requerida. Uma possível explicação para tal ocorrência está associada à baixa absortividade molar que a lactose apresenta na técnica espectrofotométrica, o que dificulta a previsão de concentrações similares deste composto mesmo sendo este majoritário da amostra. Um exemplo numérico pode dar a dimensão da justificativa apresentada: uma solução contendo cerca de 1% de lactose tem uma absorbância (u.a.) no UV-Vis de 0,0549. Como a diferença nas concentrações dos padrões de calibração e validação é menor que 1%, as diferenças nos valores de absorbância são ínfimas.

103

B) Aspartame A otimização de um modelo PLSR1 para a quantificação de aspartame seguiu etapas muito semelhantes àquelas apresentadas para a quantificação de lactose. O mesmo conjunto de calibração foi utilizado (20 misturas sintéticas, Tabela 6 página 71), sendo testado o emprego dos dados na sua forma original, assim como, alguns tipos de transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento de pré-processamento com dados centrados na média. Dentre os vários modelos construídos, o de maior capacidade de previsão apresentou as seguintes características: dados originais de absorbância na faixa espectral entre 200 nm e 240 nm e dados centrados na média. O procedimento de validação cruzada indicou a necessidade de um modelo contendo 3 CP para minimização do PRESS (Figura 31), sendo explicados 99,72% da variância dos dados. 1

x 10

-4

0.9 0.8 0.7

PRESS

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

0

2

4 6 8 Número de Componentes Principais

10

12

Figura 31- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR1 na análise de Aspartame.

104

O gráfico de valores previstos vs valores reais obtidos via PLSR1 (Figura 32A), apresenta somente a faixa de concentração para aspartame, permitindo uma melhor visualização dos dados. É possível perceber que a análise de aspartame apresentou grande concordância entre os valores previstos e reais. O comportamento dos padrões de calibração em termos de resíduos na forma de student e leverage (Figura 32B), evidencia que todos os padrões apresentam resíduos ≤ 2,5, apenas o padrão 1 apresenta leverage um pouco maior que o limite de 0,45. Como este padrão apresenta a menor concentração de aspartame, sua presença no conjunto de calibração pode ser muito informativa para a construção do modelo. Em função deste aspecto, a retirada deste padrão do conjunto de calibração foi testada, não acarretando melhora na capacidade de previsão do modelo.

0.025

2 16 20 4 12 8

8 1.5 10 Resíduos na forma de Student

0.02

Valor Previsto

3 15 19 7 11 0.015 18 14 6 2 10 0.01

0.005

13

1

2

12 9 6

0.5

-0.5

4

14

0 11

18

7

20

5 16

19 17

-1 1

1 17 5 9 13

-1.5

15 3

0

0

0.005

0.01

0.015

0.02

Valor Real

0.025

-2 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25 Leverage

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

(A) (B) Figura 32- Modelo PLSR1 otimizado para análise de aspartame em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage.

Os modelos otimizados foram aplicados ao conjunto de validação externa obtendo os seguintes valores de RMSEP, Tabela 15.

105

Tabela 15- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1 desenvolvidos para Aspartame Metodologia PLSR1

RMSEP

Nº de

Aspartame

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

4,85 E-4

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

3,85 E-4

3

a

6,50 E-4

4

a

9,50 E-3

4

1 derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm 2 derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

Os erros relativos para o melhor modelo PLSR1 obtido para aspartame (dados originais, dados centrados na média e 3CPs) foram iguais aos valores obtidos para o modelo PLSR2 em 100% das amostras (Tabela 16).

Tabela 16- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PLSR1 (aspartame). Concentração Real (g/100 mL) Aspartame 0,0198

MODELO PLSR1 Concentração Prevista e Erro Relativo Aspartame (g/100 mL) Erro (%) 0,0199 0,5

0,0079

0,0079

0,0

0,0198

0,0195

-1,5

0,0079

0,0071

-10,1

0,0198

0,0198

0,0

5.2.1.2. Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Aspartame

O modelo PCR foi construído de maneira similar ao modelo PLSR2 previamente descrito. Os mesmos tipos de transformação e pré-processamento de dados foram testados, resultando em modelos muito similares aos obtidos anteriormente. No caso da otimização do modelo PCR, foram empregados dados originais e centrados na média, sendo o número ideal de componentes principais obtidos via procedimento de validação cruzada. Conforme mostra a Figura 33A, após a 3a CP não existe nenhum ganho significativo em termos de minimização

106

do PRESS. Além disso, estas 3 CP já são responsáveis pela explicação de aproximadamente 95,85% da variância dos dados. Embora o algoritmo matemático que rege a construção do modelo PCR seja diferenciado do PLSR, é possível observar pelos dados obtidos, que ambas metodologias propiciam similaridade de resultados. De acordo com o gráfico dos coeficientes de regressão (Figura 33B) a região espectral entre 200 a 240 nm continua sendo aquela que apresenta informação analítica relevante para a análise pretendida.

-3

3

-3

x 10

6

x 10

4 2.5 Coeficientes de Regressão

2

PRESS

2

1.5

1

0 -2 -4 -6 -8 -10

0.5 -12 0

0

2

4 6 8 Número de Componentes Principais

10

12

-14 0

5

10

15

20 Canais

25

30

35

40

(A) (B) Figura 33- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Coeficientes de Regressão para lactose (preto) e aspartame (cinza) na faixa espectral entre 200 e 240 nm (canal 1 a 40).

A Figura 34A mostra-se muito semelhante à Figura 25 (modelo PLSR2). Como já comentado anteriormente o gráfico fornece poucas informações uma vez que uma ampla faixa de concentração pode ser observada. Este fato faz com que a visualização do ajuste do modelo para os dois grupos em particular fique bastante prejudicada.

107

0.35

2.5

5 8 7 6

17 19 18 1320 14 15 9 16 12 11 10

8 1.5 Resíduos na forma de Student

4 3 2 1

0.25 Valor Previsto

1

2

0.3

0.2

0.15

0.1

10

6

0.5 15

0 11

11 7 7

-1 0.05

17 16 4 10 14 3 5 18 1316 6 12 4 19 17 8

9

20

1

5

15

-1.5

16 20 4 8 15 3 12 11 7 14 18 619 2 10 1 5 9 13 0 17 0 0.05

18 129

19

-0.5

20 2 2

13

1

3 0.1

0.15 0.2 Valor Real

0.25

0.3

0.35

-2 0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25 Leverage

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

(A) (B) Figura 34- Modelo PCR otimizado para análise de lactose e aspartame em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage.

Para o modelo PCR, o limite máximo do valor para leverage é 0,45 (3p/n). A Figura 33B evidencia que o padrão 1 apresenta valor um pouco acima deste limite, no entanto com baixo valor de Resíduo na forma de Student. Em função destes aspectos e dos antecedentes dos modelos anteriormente construídos o padrão 1 foi mantido no conjunto de calibração. Na Tabela 17 são apresentados os valores de RMSEP de alguns modelos PCR desenvolvidos.

Tabela 17- Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos Metodologia PCR

RMSEP

RMSEP

Nº de

Lactose

Aspartame

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,0208

5,06 E-4

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0208

3,85 E-4

3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 240nm

0,0192

7,51 E-4

4

2a derivada, todos os comprimentos de onda (trocar)

0,0130

1,50 E-3

3

108

Para o melhor modelo obtido (dados originais, dados centrados na média e 3CPs) os resultados da análise de lactose e aspartame e seus respectivos erros relativos para as amostras que compõem o conjunto de validação são apresentados na Tabela 18.

Tabela 18- Resultados de previsão para o conjunto de validação externa via PCR. Concentração Real (g/100 mL) Lactose Aspartame 0,272 0,0198

MODELO PCR Conc. Prevista (g/100 mL) e Erro Relativo (%) Lactose Erro % Aspartame Erro % 0,2946 8,3 0,0199 0,5

0,264

0,0079

0,2985

13,1

0,0079

0,0

0,288

0,0198

0,2967

3,0

0,0195

-1,5

0,296

0,0079

0,3009

1,6

0,0071

-10,1

0,280

0,0198

0,2992

6,8

0,0198

0,0

Também neste caso, é possível constatar problemas nos resultados obtidos para a análise de lactose. Este fato indica a independência do problema, com o algoritmo matemático utilizado e reforça a justificativa dada anteriormente. Comparando-se os modelos de melhor capacidade de previsão em cada uma das modalidades (PLSR2, PLSR1 e PCR) é possível observar que os resultados de previsão são praticamente iguais, conforme evidencia os valores de RMSEP apresentados na Tabela 19.

Tabela 19- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR1, PLSR2 e PCR. Metodologia RMSEP Lactose PLSR1

RMSEP Aspartame Nº de CP

0,0209

PLSR1

3 3,85 E-4

3

PLSR2

0,0209

3,85 E-4

3

PCR

0,0208

3,85 E-4

3

109

De acordo com os dados da Tabela 19 é possível observar que qualquer um dos 3 modelos otimizados produzem resultados de previsão praticamente idênticos. Em função destes resultados, o modelo PLSR2 foi escolhido para prever o sistema estudado devido a sua praticidade de aplicação. Nesta etapa foram utilizadas 6 amostras de adoçantes de mesa comerciais com a composição estudada, conforme mostra a Tabela 20.

Tabela 20- Resultados da análise de lactose e aspartame em amostras de adoçante comercial via modelo PLSR2 previamente otimizado. Concentração declarada

MODELOS PLSR2

(g/100 mL)

Concentração prevista (g/100 mL)

Lactose

Aspartame

Lactose

Aspartame

0,2812

0,0188

0,3042

0,0175

0,2812

0,0188

0,3034

0,0196

0,2862

0,0108

0,3002

0,0155

0,2850

0,0120

0,3035

0,0136

0,2871

0,0114

0,3031

0,0125

0,2860

0,0114

0,3043

0,0156

Embora o sistema estudado seja bastante complexo em termos analíticos e espectrofotométricos, os resultados obtidos para a análise de aspartame foram satisfatórios, principalmente quando se consideram características como: baixo custo e pequeno tempo de análise. Em duas amostras analisadas (destacadas em negrito na Tabela 20) foi possível observar uma discrepância maior do valor previsto com aquele declarado pelo fabricante para a quantificação de aspartame (informações de embalagem, ou por contato direto). Como o modelo otimizado apresentou boa capacidade de previsão para este analito, esta discrepância pode ser decorrente da heterogeneidade das amostras no preparo do adoçante.

110

Para a análise da lactose esta metodologia não demonstrou eficiência, porém para este analito há disponíveis diversas técnicas de análise (conforme item 2.4.1 da revisão da literatura).

5.2.2 Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo

Na literatura recente não são relatadas técnicas para a análise de esteviosídeo, porém por se tratar de um edulcorante natural vem se destacando entre os consumidores. O crescente aumento no número de produtos com este edulcorante, evidencia a necessidade de desenvolvimento de técnicas para analisá-lo. Uma vez que o esteviosídeo apresenta absorção molecular no UV-Vis e conhecendo-se as características associadas a esta técnica, uma proposta de aplicação de métodos multivariados para esta quantificação foi estudada. A Figura 35 mostra a interferência espectral associada ao sistema lactose/esteviosídeo.

1.2

Lactose Esteviosídeo

Absorbância (u.a.)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 200

300

400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 35- Espectro UV-Vis na região entre 200 e 400 nm para Lactose e Esteviosídeo

111

A metodologia multivariada foi conduzida basicamente da mesma maneira apresentada anteriormente para o sistema lactose/aspartame. Ou seja, inicialmente desenvolvendo modelos de calibração PLSR2, seguidos da construção dos modelos PLSR1 para cada componente de interesse e por último a metodologia PCR. Os modelos foram desenvolvidos a partir de 20 misturas sintéticas, conforme Tabela 8 página 73, enquanto para a etapa de validação um conjunto de 5 misturas sintéticas (Tabela 9 página 73 foram utilizadas. Os espectros foram processados na faixa entre 200 nm à 800 nm, região correspondente a ultravioleta e visível (UV-Vis), conforme Figura 36.

1.0

Absorbância (u.a.)

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 200

300

400

500

600

700

800

Comprimento de onda (nm)

Figura 36- Espectro UV-Vis de todas as misturas sintéticas de lactose e esteviosídeo utilizadas no conjunto de calibração para os comprimentos de onda entre 200 e 800 nm.

5.2.2.1 Modelo PLSR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo 5.2.2.1.1 PLSR2 Durante a fase de calibração o conjunto composto pelos espectros das 20 misturas sintéticas (Tabela 8, página 73) foi correlacionado com as suas respectivas concentrações. Nesta etapa, além da utilização dos dados espectrais na sua forma original, foram testados alguns tipos de transformação de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao

112

procedimento de pré-processamento com dados centrados na média. Com base nos vários modelos desenvolvidos, verificou-se que a capacidade de previsão do modelo é altamente influenciada pelo tipo de transformação utilizada. Na procura de um modelo que melhor representasse a quantificação de todo o conjunto de elementos que compõe a matriz em questão, inúmeros modelos foram desenvolvidos e com base nos vários modelos, verificou-se que a capacidade de previsão é influenciada por vários fatores, tais como: transformações dos dados e regiões espectrais relevantes. Combinando todos estes fatores o número de modelos de calibração desenvolvidos foi muito grande e todos com capacidade de previsão distinta, porém somente um modelo foi escolhido (àquele mais robusto e com melhor capacidade de previsão). No modelo PLSR2 otimizado empregou-se dados espectrais na forma original, centrados na média e procedimento de validação cruzada. Foram mantidos os comprimentos de onda relevantes (faixa espectral mantida foi entre 200 a 280 nm, canais 1 a 80) conforme podemos evidenciar na Figura 37A e 37B. A retirada dos comprimentos de onda com coeficiente de regressão próximo de zero, propiciou o desenvolvimento de um modelo com melhor capacidade de previsão. O processo de validação cruzada evidenciou no modelo PLSR2 que após a 3a componente principal não há nenhum ganho significativo na diminuição do erro de previsão (PRESS), conforme Figura 38, sendo estas responsáveis por 96,25% da variância dos dados. Uma vez que o sistema em estudo possui dois analitos, esperava-se no mínimo duas componentes principais, uma componente principal para cada elemento de interesse. A necessidade de uma CP a mais, provavelmente é decorrente da modelagem de nãolinearidades do sistema estudado.

113

0.015

Coeficiente de Regressão

0.01

0.005

0

-0.005

-0.01

-0.015

-0.02 0

100

200

300 400 Número de Variáveis

500

600

700

(A) 0.015

Coeficiente de Regressão

0.01

0.005

0

-0.005

-0.01

-0.015

-0.02 0

10

20

30 40 50 Número de Variáveis

60

70

80

(B) Figura 37- Coeficientes de Regressão do PLSR2, na análise de lactose (preto) e esteviosídeo (cinza) (A) com espectro completo; (B) Faixa espectral entre 200 e 280 nm (canal 1 a 80).

114

3

x 10

-3

2.5

PRESS

2

1.5

1

0.5

0

0

2

4

6 8 10 Número de Componentes Principais

12

14

Figura 38- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo.

A Figura 39 demonstra as concentrações previstas e reais pelo modelo desenvolvido. Evidenciando uma boa concordância entre estes dados.

Valor Previsto

0.30 0.29 0.28 0.27

Lactose

0.26 0.260

0.265

0.270

0.280

0.285

0.290

0.295

0.300

Valor Real

0.03

Valor Previsto

0.275

0.02

0.01

Esteviosídeo 0.00 0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

Valor Real

Figura 39- Valores previstos pelo modelo PLSR2 versus valores reais lactose e esteviosídeo separadamente.

115

Um detalhe importante ocorrido durante a construção do modelo PLSR2 desenvolvido para esta matriz está representado pelos baixos valores de resíduos e leverage para todos os padrões de calibração (Figura 40), não havendo dúvidas com relação à inexistência de amostras anômalas. 2 13 1.5

Resíduos na forma de student

18 19

3 3

1 14 0.5

17

6 15 6 12

0

11

16 1 7

11 15

-1

19

8

20 5

17 10

14

-0.5

-1.5

20

2

8

4

2

9

16 10 4

12

5

7

18

13 9

-2 0.05

0.1

0.15 Leverage

0.2

0.25

Figura 40- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PLSR2 na análise de lactose e esteviosídeo

O modelo descrito anteriormente foi empregado na determinação de lactose e esteviosídeo no conjunto de validação externa apresentando os seguintes valores de RMSEP, Tabela 21.

Tabela 21- Comparação via RMSEP entre os modelos PLSR2 desenvolvidos Metodologia PLSR2

RMSEP

RMSEP

Nº de

Lactose

Aspartame

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,022

1,66 E-3

4

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,021

1,50 E-3

3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,0157

2,60 E-3

4

2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

7,11 E-3

3,53 E-3

6

116

Os resultados e erros relativos obtidos para o melhor modelo (destacado em negrito na Tabela 21) são apresentado na Tabela 22.

Tabela 22- Resultados obtidos para o modelo PLSR2 na etapa de validação externa Concentração real

MODELO PLSR2

(g/100 mL)

Conc. prevista (g/100 mL) e erro relativo (%)

Lactose

Esteviosídeo

Lactose

Erro

Esteviosídeo

Erro

0,264

0,0092

0,2991

13,3

0,0108

17,4

0,272

0,0268

0,2967

9,1

0,0267

-0,4

0,280

0,0180

0,2978

6,3

0,0207

15

0,288

0,0120

0,2993

3,9

0,0127

5,8

0,296

0,0300

0,3008

1,6

0,0292

-2,7

Para a determinação de lactose, o mesmo problema evidenciado no sistema lactose/aspartame se repetiu. Sendo assim uma curva analítica convencional foi realizada para verificar a real influência da concentração de lactose na determinação de esteviosídeo, uma vez que o modelo multivariado dá indícios de não diferenciar concentrações similares de lactose. Para isto, valores de absorbância em 211 nm (comprimento de onda máximo para esteviosídeo) de uma mistura sintética contendo esteviosídeo e em uma alta concentração de lactose, foram correlacionados à concentração de esteviosídeo, conforme Tabela 23.

117

Tabela 23- Concentrações de esteviosídeo e lactose com absorbância em 211 nm obtida de misturas utilizadas na construção na calibração convencional. Absorbância 211 nm

Concentração (g/100mL) Lactose

Esteviosídeo

(u.a.)

0,264

0,0060

0,573

0,272

0,0148

0,699

0,280

0,0240

0,795

0,288

0,0320

0,766

0,296

0,0268

0,636

0,296

0,0300

0,676

A Figura 41 mostra o resultado da calibração univariada convencional para a determinação da concentração de esteviosídeo. Este analito não possui linearidade nas concentrações de interesse, devido as diferentes concentrações de lactose, evidenciando sua influência na determinação do esteviosídeo.

0.80

Absorbância (u.a.)

0.75

0.70

0.65

0.60

0.55 0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

0.035

[Esteveosídeo] (%)

Figura 41- Calibração univariada realizada para a determinação de esteviosídeo em altas concentrações de lactose

118

5.2.2.1.2 PLSR1

A metodologia multivariada na forma operacional PLSR1 foi empregada de maneira similar à explicitada durante o desenvolvimento do modelo PLSR2.

A) Lactose O modelo de calibração PLSR1 para a lactose foi desenvolvido inicialmente utilizando a faixa espectral completa (200 nm a 800nm), dados centrados na média e procedimento de validação cruzada. Dentre os vários modelos desenvolvidos, aquele que apresentou maior capacidade de previsão utiliza os dados em sua forma original. Os gráficos de Coeficientes de Regressão vs Canais para a metodologia PLSR1 são muitos similares em comportamento com aquele obtido por PLSR2 (Figura 37), e, portanto não serão mostrados. Sendo assim, a faixa de comprimento de onda entre 200 e 280nm (canais 1 a 80) é aquela que apresenta informação analítica relevante. Otimizando este modelo com todas as amostras e seus dados originais, restringindo o comprimento de onda entre 200 e 280 nm e utilizando dados centrados na média, constatou-se através do procedimento de validação cruzada interna que após a 2a componente principal (Figura 42A), não há nenhum ganho significativo na diminuição do erro de previsão (PRESS), as quais são responsáveis por 93,36% da variância dos dados. A Figura 42B indica novamente que nenhum padrão de calibração apresenta resíduos e leverage fora dos limites estatísticos, não sendo detectadas a presença de amostras anômalas.

119

-4

11

x 10

1.5 18 19

10 1

Resíduos na forma de student

8 7 PRESS

2

6

9

6

0.5

14

9

17 1

15

0

5

-0.5

5 4

20

3

11

8

-1

16

10

3

4

12

13

-1.5 2 1 0

7

2

4

6 8 10 Número de Componentes Principais

12

-2 0

14

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Leverage

(A) (B) Figura 42- Modelo PLSR1 otimizado para análise de lactose em adoçantes. (A) PRESS em função do número de componentes principais; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage.

Como pode ser evidenciado na Figura 43, há uma visualização melhor do ajuste do modelo PLSR1 em comparação ao modelo PLSR2, isto se deve ao gráfico apresentar somente faixa de concentração para lactose (concentração majoritária) onde é possível perceber a presença de 5 agrupamentos que representam as cinco diferentes concentrações de lactose empregadas nas soluções utilizadas para construção do conjunto de calibração.

0.3 0.295 13

Valor Previsto

0.29

17 20 19 18

16 15 14

0.285

12 10

0.28 9 11

7 0.275

8 5

0.27

6

4 0.265

0.26 0.26

1 3 2 0.265

0.27

0.275

0.28 Valor Real

0.285

0.29

0.295

0.3

Figura 43- Valores previstos pelo modelo PLSR1 vs valores reais na análise de lactose.

120

Com essa melhor visualização percebe-se que não há grande concordância entre os valores reais e os valores previstos para concentração de lactose, o que já era esperado devido às considerações anteriores, isto é as concentrações de lactose não estão sendo previstas corretamente.

O modelo descrito anteriormente apresentou a melhor capacidade de previsão na determinação de lactose no conjunto de validação externa, conforme pode ser evidenciado na Tabela 24.

Tabela 24- Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos Metodologia PLSR1

RMSEP

Nº de

Lactose

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,022

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,021

2

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,016

4

2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

7,20 E-3

4

Os erros relativos obtidos para o conjunto de validação externa empregando-se o modelo de melhor desempenho são apresentados na Tabela 25.

Tabela 25- Resultados da validação externa obtidos para o modelo PLSR1 para Lactose Concentração real (g/100 mL) Lactose 0,264

MODELO PLSR1 Lactose (g/100 mL) 0,2986

Erro (%) 13,1

0,272

0,2961

8,9

0,280

0,2976

6,3

0,288

0,2982

3,5

0,296

0,2993

1,1

Concentração Prevista e Erro Relativo (%)

121

Seguindo a mesma tendência mostrada no modelo anterior, assim como naqueles envolvendo o sistema lactose/aspartame, a previsão da concentração da lactose não se mostrou eficiente. Embora a metodologia resulte em baixos erros relativos os resultados mascaram a real situação, ou seja, a técnica é pouco eficiente para prever estas concentrações de lactose. Vale a pena ressaltar que se um arredondamento fosse efetuado, todas as amostras do conjunto de validação teriam a mesma concentração, 0,30 g/ 100 mL.

B) Esteviosídeo O procedimento de otimização do modelo PLSR1 para esteviosídeo foi desenvolvido da mesma forma descrita anteriormente, sendo que a utilização de dados na sua forma original propicia o desenvolvimento de modelos com melhor capacidade de previsão. Os gráficos de Coeficientes de Regressão vs Canais para a metodologia PLSR1 não serão mostrados por serem muito similar aos apresentados no modelo PLSR2 (Figura 37). Também para este caso, a região entre 200 nm a 280 nm (canais 1 a 80) é a mais relevante para a construção do modelo em questão. Construindo um modelo PLSR1, constatou-se através do procedimento de validação cruzada que após a 3a CP, conforme Figura 44, não há nenhum ganho significativo na diminuição do erro de previsão (PRESS), as quais são responsáveis por 98,6% da variância dos dados.

122

1.2

x 10

-3

1

PRESS

0.8

0.6

0.4

0.2

0

0

2

4

6 8 10 Número de Componentes Principais

12

14

16

Figura 44- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PLSR1 na análise de esteviosídeo

Observando a Figura 45A, devido a melhor visualização do ajuste do modelo PLSR1, pode ser constatado que há concordância entre valores previstos vs valores reais para esteviosídeo. Analisando a Figura 45B Resíduos na forma de Student vs Leverage, não há a identificação de comportamentos anômalos quando se utilizam os critérios estatísticos usuais, pois para ser considerada uma amostra anômala a amostra deve possuir alto valor de resíduo (maior que2,5) e concomitantemente alto valor de leverage (0,3) 3p/n.

123

0.04

2 13

0.035

1.5

Valor Previsto

0.03 19 15 11 7 3

0.025 0.02 18 2 14 10 6

0.015

0.01 0.005 0 0

20 8

Resíduos na forma de student

4 12 16 8 20

1

3 17

0.5 0

0.005

10

14

1 7 4

-0.5

2

11 15

-1 9 1 5 17 13

5

16

6 12

-1.5

19 18 9

0.01

0.015

0.02 Valor Atual

0.025

0.03

0.035

0.04

-2 0.05

0.1

0.15 Leverage

0.2

0.25

(A)

(B)

Figura 45- Modelo PLSR1 otimizado para análise de esteviosídeo em adoçantes. (A) Valores previstos vs valores reais pelo modelo PLSR1; (B) Resíduos na forma de student em função da leverage.

A partir dos vários modelos desenvolvidos, a etapa de validação externa foi realizada e os resultados de RMSEP de alguns modelos estão apresentados na Tabela 26, sendo que o modelo de melhor capacidade de previsão está destacado em negrito.

Tabela 26- Comparação via RMSEP para modelos PLSR1 desenvolvidos Metodologia PLSR1

RMSEP

Nº de

Esteviosídeo

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

1,60 E-3

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

1,45 E-3

3

1 derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

1,68 E-3

3

2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

5,13 E-3

3

a

A Tabela 27 apresenta os erros relativos para o modelo com as seguintes características: dados originais na faixa espectral de 200 a 280 nm, com dados centrados na média e 3CPs.

124

Tabela 27- Resultados obtidos para o modelo PLSR1 na etapa de validação externa para a determinação de esteviosídeo Concentração Real MODELO PLSR1 Concentração Prevista e Erro Relativo (g/100 mL) Esteviosídeo Esteviosídeo (g/100 mL) Erro (%) 0,0092 0,0108 -17,4 0,0270

0,0266

1,5

0,0180

0,0206

14,4

0,0120

0,0127

5,8

0,0300

0,0292

-2,7

5.2.2.2. Modelo PCR para Amostras com Composição Lactose e Esteviosídeo O modelo PCR foi construído de maneira similar ao modelo PLSR2 previamente descrito para lactose e esteviosídeo. A fase de calibração foi construída utilizando o mesmo conjunto composto pelos espectros das 20 misturas sintéticas (Tabela 8, página 73), sendo testados o emprego dos dados na sua forma original, assim como, alguns tipos de transformações de dados (1a e 2a derivada) concomitantemente ao procedimento dados centrados na média. De acordo com os dados de coeficientes de regressão, os comprimentos de onda menos importantes foram retirados, permanecendo somente os comprimentos de onda entre 200 nm a 280 nm (canais 1 a 80). O número de componentes principais foi encontrado, utilizando o procedimento de validação cruzada, conforme Figura 46 sendo necessário 3 CP, pois a partir desse valor não se tem mais uma variância residual significativa, sendo responsável pela explicação de aproximadamente 96,17% da variância dos dados, o modelo PCR otimizado necessitou do mesmo número de componentes principais o modelo PLSR2 previamente construído.

125

3

x 10

-3

2.5

PRESS

2

1.5

1

0.5

0

0

2

4

6 8 10 Número de Componentes Principais

12

14

Figura 46- PRESS em função do número de componentes principais para o modelo PCR na análise de lactose e esteviosídeo.

A escolha por 3 CP deve-se ao baixo valor de PRESS e os baixos erros relativos para a previsão do conjunto de validação. Como anteriormente comentado o gráfico que apresenta as concentrações previstas pelo modelo vs as concentrações reais fornece poucas informações visto a ampla faixa de concentração, isto porque o PCR semelhantemente ao modelo PLSR2 por se tratar de um modelo que engloba uma otimização geral de todos os analitos (lactose e esteviosídeo) apresenta uma curva com uma ampla faixa de concentração. Este fato faz com que a visualização do ajuste do modelo para os analitos em estudo fique bastante prejudicada.

126

0.35

0.3

17 20 18 13 16 1419 12 9 15 10 11 5 7 8 6 4 1 3 2

Valor Previsto

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05 4 12 16 8 19 11 1520 7 3 18 2 6 10 14 9 1 5 17 13 0 0 0.05

0.1

0.15 0.2 Valor Atual

0.25

0.3

0.35

Figura 47- Valores previstos pelo modelo PCR vs valores reais na análise de lactose e esteviosídeo

Analisando o gráfico de Resíduos na forma de Student vs Leverage não há a identificação de comportamentos anômalos, conforme Figura 48, pois não há amostras com valor de resíduo superior a 2,5 e amostras com alto valor de leverage (3p/n=0,45).

2 13 1.5

Resíduos na forma de student

18 19

3 3

1 14 0.5

17

6 15 6

0

12

11

16 1 1 7

11

15 -1

19

8

20 5

17 10

14

-0.5

-1.5

20

2

8

4

2

9

16 10 4

12

5

7

18

13 9

-2 0.05

0.1

0.15 Leverage

0.2

0.25

Figura 48- Resíduos na forma de student em função da leverage para o modelo PCR na análise de lactose e esteviosídeo.

127

Os menores valores de RMSEP na determinação de lactose e esteviosídeo no conjunto de validação externa via PCR foram obtidos pelo modelo descrito anteriormente. Ou seja, àquele desenvolvido com dados originais, centrados na média e 3CPs, conforme evidencia a Tabela 28.

Tabela 28- Comparação via RMSEP entre os modelos PCR desenvolvidos RMSEP

RMSEP

Nº de

Lactose

Aspartame

CP

Sem derivar, todos os comprimentos de onda

0,022

1,66 E-3

3

Sem derivar, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,021

1,50 E-3

3

1a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

0,0180

1,75 E-3

6

2a derivada, comprimentos de onda entre 200 e 280nm

7,4 E-3

4,51 E-3

7

Metodologia PCR

Os resultados da previsão e seus respectivos erros relativos para o conjunto de validação são mostrados na Tabela 29 a seguir.

Tabela 29- Resultados obtidos para o modelo PCR na etapa de validação externa Concentração real

MODELO PCR

(g/100 mL)

Conc. prevista (g/100 mL) e erro relativo (%)

Lactose

Esteviosídeo

Lactose

Erro

Esteviosídeo

Erro

0,264

0,0092

0,2991

13,3

0,0109

-18,5

0,272

0,0268

0,2927

9,1

0,0267

0,4

0,280

0,0180

0,2978

6,3

0,0207

-15,0

0,288

0,0120

0,2992

3,9

0,0127

-5,8

0,296

0,0300

0,3008

1,6

0,0292

2,6

Considerando que não há técnicas disponíveis para a análise de esteviosídeo, esta técnica mostrou possuir todos os requisitos para ser amplamente utilizadas por laboratórios de pequeno e médio porte (baixo custo, pequeno tempo de análise) na sua determinação

128

quantitativa. As dificuldades de análise para lactose indicam que este método não é recomendável para sua análise nas condições estudadas, porém não impedem que este sistema seja utilizado para analisar produtos comerciais com alta concentração de lactose e baixa concentração de esteviosídeo. Na Tabela 30 apresentam-se os valores de RMSEP para cada uma das modalidades (PLSR2, PLSR1 e PCR) otimizadas. Em função destes resultados, o modelo PLSR1 foi escolhido para prever o sistema estudado uma vez que apresenta o menor valor de RMSEP para esteviosídeo.

Tabela 30- Comparação entre as Metodologias PLSR1, PLSR2 e PCR. Metodologia

RMSEP Lactose

PLSR1

0,021

RMSEP esteviosídeo

Nº de CP 2

PLSR1

1,4 E -3

3

PLSR2

0,021

1,5 E-3

3

PCR

0,021

1,5 E-3

3

A Tabela 31 apresenta o resultado obtido para a previsão de um adoçante comercial (composição lactose e esteviosídeo) utilizando o modelo PLSR1 otimizado. Embora todas as etapas do desenvolvimento demonstrassem que os resultados de lactose não são confiáveis, dados de previsão para este analito também são apresentados.

Tabela 31- Resultado de previsão para a amostra comercial obtido para o modelo PLSR1 para lactose e PLSR1 para esteviosídeo Concentração Declarada

MODELOS PLSR1

(g/100 mL)

Concentração Prevista (g/100 mL)

Lactose

Esteviosídeo

Lactose

Esteviosídeo

0,279

0,0215

0,2978

0,0170

129

A quantificação do esteviosídeo via sistema espectrofotométrico associado à metodologia de calibração multivariada apresentou uma diferença de 20,9% entre o valor previsto e o declarado pelo fabricante na embalagem. Esta diferença pode ser decorrente da falta de homogeneidade da amostra de adoçante utilizada para preparo das soluções. Como se trata de uma pequena quantidade de esteviosídeo em relação ao veículo lactose, e sendo ambos edulcorantes encontrados na forma sólida, a dificuldade de homogeneização do lote é considerável.

130

6 CONCLUSÃO

Foi possível demonstrar pelo trabalho realizado que a utilização de métodos espectroscópicos, como FTIR-médio e UV-Vis, em conjunto com métodos quimiométricos pode resultar em aplicações analíticas de grande potencial, para determinações qualitativas e quantitativas. Na primeira parte deste trabalho foi empregada a PCA em dados de espectroscopia de infravermelho médio para classificação de adoçantes de mesa. Este método mostrou ser perfeitamente capaz de classificar os adoçantes de mesa de acordo com a sua composição, principalmente no que diz respeito à diferenciação dos veículos, mostrando ser uma técnica rápida e eficiente para a análise qualitativa de açúcares possibilitando um controle de qualidade mais ágil. Considerando o conjunto de amostras analisado (em termos de quantidade e qualidade) e a dificuldade na obtenção de pastilhas perfeitamente homogêneas para análise via FTIR-médio, a metodologia mostrou-se adequada para distinguir os adoçantes compostos de lactose/aspartame daqueles que contém lactose/mistura de edulcorantes. Vale a pena ressaltar que em alguns processos industriais não é necessária a quantificação das amostras, mas apenas uma indicação qualitativa, para verificar se o produto está ou não dentro dos padrões normalmente aceitos, o que viabilizaria a aplicação deste tipo de metodologia. No caso da quantificação espectrofotométrica de uma mistura de lactose/aspartame e lactose/esteviosídeo, a intensa sobreposição das bandas espectrais impossibilita que as técnicas convencionais de análise sejam realizadas. A utilização de técnicas multivariadas permitiu contornar parte dos problemas de interferência espectral ou das baixas absorbâncias apresentadas, propiciando bons resultados principalmente na análise quantitativa dos edulcorantes intensos em adoçantes de mesa comerciais.

131

A proposta metodológica de determinar as concentrações de aspartame e esteviosídeo, neste tipo de amostra, apresenta algumas vantagens, dentre as quais é possível destacar: baixo custo, alta sensibilidade e pequeno tempo de análise. A análise de lactose apresenta algumas dificuldades. Embora os modelos desenvolvidos não tenham a capacidade de diferenciar concentrações de lactose tão similares, os dados de absorção deste composto influem na análise de aspartame e esteviosídeo. Ou seja, a metodologia proposta é adequada para sistemas como os aqui estudados, mesmo nas situações onde é alta a concentração do veículo e baixa a concentração do edulcorante intenso. O processo de calibração multivariada fundamentado em regressão por mínimos quadrados parciais (PLSR) permite obter a melhor modelagem dos estudos em questão. Uma pequena melhora é obtida no sistema lactose/esteviosídeo quando o processo de otimização é realizado de maneira particular (sistema PLSR1), ou seja, um modelo para cada composto de interesse, gerando modelos mais robustos com melhor capacidade de previsão.

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