TESE EMMANUEL DAMILANO DUTRA 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE ENERGIA NUCLEAR Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares - PROTEN
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Emmanuel Damilano Dutra
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL JULHO – 2014
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares – PROTEN do Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de doutor em Tecnologias Energéticas e Nucleares. Área de concentração: Fontes Renováveis de Energia.
Orientador: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio de Morais Júnior
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL JULHO – 2014
Catalogação na fonte Bibliotecária Margareth Malta, CRB-4 / 1198 D978a
Dutra, Emmanuel Damilano. Avaliação da produção de etanol de primeira e de segunda geração a partir da biomassa de sorgo sacarino / Emmanuel Damilano Dutra. - Recife: O Autor, 2014. 164 folhas, il., gráfs., tabs. Orientador: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes. Coorientador: Prof. Dr. Marcos Antonio de Morais Júnior. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares - PROTEN, 2014. Inclui Referências e Anexo. 1. Energia Nuclear. 2. Fontes renováveis de energia. 3. Bioenergia. 4. Culturas energéticas. 5. Biomassa. 6. Biocombustíveis. I. Menezes, Rômulo Simões Cezar. (Orientador). II. Morais Júnior, Marcos Antonio de. (Coorientador). III. Título.
UFPE
621.4837 CDD (22. ed.)
BCTG/2014-210
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Emmanuel Damilano Dutra
APROVADA EM: 18.07.2014
ORIENTADOR: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior
COMISSÃO EXAMINADORA:
Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes- DEN/UFPE
Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato Silva – Dep. Eng. Alimentos/UFPB
Prof. Dr. Cesar Augusto de Moraes Abreu – DEQ/UFPE
Profa. Dra. Katia Aparecida da Silva Aquino - IFPE
Prof. Dr. Alexandre Libânio Reis - CETENE
DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a minha mãe Claudia Helena Damilano Dutra e a meu pai Carlos Cesar Dornelles Dutra.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradecer ao Deus de todas as coisas, pois em sua sabedoria criou a dinâmica da vida, seus mistérios e desafios e sua infindável beleza. Meu forte agradecimento ao professor orientador Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes, pelos ensinamentos, pela confiança, pela oportunidade e principalmente pela amizade. Agradecimentos ao professor co-orientador Dr. Marcos Morais pela paciência e orientação durante as fases da tese. Meus agradecimentos ao CNPq pela bolsa concedida para execução deste projeto de pesquisa e ao Departamento de Energia Nuclear - UFPE. Agradecimentos ao Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene) pelo total apoio na pesquisa e pela disponibilidade de espaço para a realização dos experimentos de fermentação, pré-tratamento e hidrólise enzimática. Ao professor Dr. Everardo Sampaio Barreto de Sá pelas conversas e valorosas sugestões. Aos colegas do Grupo de Energia da Biomassa: Júlio Cesar, Kennedy Nascimento, Tiago Althoff, Dario Primo, Mona Nagai, Eric Xavier, Samuel, Karina Guedes, Taciana e Nilson pelo companheirismo e ensinamentos. Aos colegas do Laboratório de Bioprocessos do Cetene: Alexandre Libânio companheiro de discussão e experimentos, Rafael Barros, Raquel, Aldenise e ao sempre disposto Isaac. Meus agradecimentos aos técnicos do laboratório de biomassa do DEN, Gilberto, Pedro e Claudenice pelo apoio e companheirismo nas atividades laboratoriais. Agradecimentos especiais aos alunos de iniciação científica que me apoiaram nos trabalhos de laboratório, Diogo, Janis Joplim e Pedro Paulo. A minha esposa, Rosiene Medeiros do Nascimento, todo meu reconhecimento por estar comigo nos momentos de dúvidas e dificuldades, que não foram poucos. Obrigado. Por fim a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização desta tese que sem dúvida é parte de uma construção coletiva.
SUMÁRIO
Pg.
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... LISTA DE TABELAS......................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS......................................................... RESUMO.............................................................................................................. ABSTRACT.......................................................................................................... INTRODUÇÃO....................................................................................................
18
CAPÍTULO I........................................................................................................
21
1.
INTRODUÇÃO........................................................................................
24
2.
ASPECTOS GERAIS DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO....
26
3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO...........................................................................................................
29
4. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO SORGO SACARINO............................................................................................................
35
5. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DOS GRÃOS DO SORGO SACARINO..............................................................................................................
38
6. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO BAGAÇO E DAS FOLHAS DO SORGO SACARINO......................................................................
39
7. BIOMASSA DE SORGO SACARINO COMO MATÉRIA-PRIMA PARA BIORREFINÁRIAS.....................................................................................
41
8.
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................
43
9.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
44
CAPÍTULO II:..........................................................................................................
50
1.
INTRODUÇÃO.............................................................................................
53
2. COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA E SEUS PRODUTOS DE HIDRÓLISE................................................................................
56
3. ABORDAGEM SOBRE A QUÍMICA DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 EM MEIO ALCALINO.......................................................................
58
4. PRINCIPAIS VARIÁVEIS QUE AFETAM O PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2.................................................................................................................
62
5. ESTUDOS COMPARATIVOS DE PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 ALCALINO...............................................................................................................
67
6. PRINCIPAIS DESAFIOS DO USO EM LARGA ESCALA DO H2O2 ALCALINO PARA PRÉ-TRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA............................................................................................
69
7.
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................
71
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
72
CAPÍTULO III.........................................................................................................
75
1.
INTRODUÇÃO............................................................................................
78
2.
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
80
2.1 Obtenção da biomassa de sorgo sacarino e caracterização dos caldos.............................................................................................................
80
2.2 Ensaios de fermentação..........................................................................
80
2.3 Produção de etanol calculada..................................................................
81
2.4 Análises estatísticas.................................................................................
82
RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................
83
3.1 Caracterização química dos caldos..........................................................
83
3.2 Fermentação alcoólica dos caldos e produção de etanol por hectare............................................................................................................
85
4.
CONCLUSÕES.............................................................................................
89
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
90
CAPÍTULO IV.........................................................................................................
93
1.
INTRODUÇÃO............................................................................................
96
2.
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
98
2.1 Experimento de campo............................................................................
98
2.2 Caracterização dos caldos das cultivares................................................
98
2.3 Caracterização dos bagaços das cultivares.............................................
99
2.4 Fermentação dos caldos..........................................................................
99
2.5 Pré-tratamento e hidrólise enzimática dos bagaços................................
100
2.6 Fermentação dos hidrolisados...............................................................
101
2.7 Análises estatísticas..............................................................................
101
RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................
102
3.1 Experimento de campo.........................................................................
102
3.
3.
3.2 Caracterização inicial e fermentação dos caldos..................................
103
3.3 Pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados.................................................................................................
106
4.
CONCLUSÕES..........................................................................................
111
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................
112
CAPÍTULO V:......................................................................................................
116
1.
INTRODUÇÃO.........................................................................................
118
2.
MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................
121
2.1 Biomassa.............................................................................................
121
2.2 Pré-tratamento....................................................................................
121
2.3 Hidrólise Enzimática..........................................................................
121
2.4 Ensaios de fermentação em bancada..................................................
122
2.5 Hidrólise e fermentação em biorreator...............................................
123
2.6 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR).......................................................................................................
123
2.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)......................................
123
2.8 Difratometria de raios x (DRX)..........................................................
124
2.9 Métodos analíticos...............................................................................
124
2.10 Análises estatísticas...........................................................................
125
RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................
126
3.1 Caracterização da biomassa lignocelulósica pré-tratada.....................
126
3.2 Análise de deslignificação dos bagaços por FTIR, MEV/EDS e DRX...........................................................................................................
129
3.3 Fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis..............................
134
4.
CONCLUSÕES........................................................................................
139
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................
140
CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................
144
ANEXO I ……………………………………………………………………..
145
3.
LISTA DE FIGURAS Capítulo 1
Pg.
Figura 1
Composição da biomassa de sorgo sacarino de cultivares plantadas no Nordeste do Brasil............................................................................
Figura 2
Composição química da biomassa de sorgo sacarino IPA 467 em função do método de caracterização. Os bagaços são oriundos de experimentos diferentes e em épocas de colheitas diferentes...............................................................................................
Figura 3
Perfil de decomposição de açúcares redutores totais do caldo de sorgo sacarino em função da temperatura de estocagem. T1: 4 °C, T2: 25 °C e T3: 45 °C............................................................................
Capítulo 2 Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
29
34
36
Pg. Vista geral do crescimento de publicações com o uso do prétratamento H2O2 alcalino para diferentes tipos de biomassas lignocelulósica. Fonte: ISI web of knowledge termo de busca “Alkaline hydrogen peroxide pretreatment”.......................................
54
Mudanças na morfologia da palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino (1% H2O2, pH 11,5, temperatura ambiente por 24 h): a) palha de trigo moída sem pré-tratamento (100x); b) palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino após secagem à 100 °C por 24 h (100x); c) palha de trigo pré-tratada com H2O2 desidratada em etanol e seca no ponto crítico (200x); e d,e) aumento da amostra vista na imagem c em dois cortes, as setas mostram a separação das fibras de celulose. Adaptado de Gould (1985)....................................................
61
Influência da concentração de sólidos totais no pré-tratamento da palha de milho com peróxido de hidrogênio (24 h, 0,5 g H2O2/g biomassa) na eficiência de conversão de celulose em glicose. A biomassa pré-tratada foi neutralizada e diluída a 0,2 % glucana e digerida enzimaticamente com Accellerase 1000 (15 mg/g glucana) por 48h. Fonte: Adaptado: Banerjee et al. (2011)................................
62
Efeito do tempo de duração da reação de pré-tratamento com H2O2 alcalino (2,15% m/v H2O2, pH 11,5) na biomassa de palha de trigo (8,6 % m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 120 h). Fonte: Adaptado Saha e Cotta, 2006.....................................................
63
Efeito da concentração de H2O2 em solução para o pré-tratamento (pH 11,5, 35 °C, 24 h) da casca de arroz (15,0% m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 72 h, 0,4 mL de cada preparação enzimática. g de casca de arroz-1). Adaptado de Saha e Cotta, 2007............................................................................................
64
Figura 6
Efeito do valor inicial do pH na reação de pré-tratamento da biomassa de kenaf (1% H2O2, 2% sólidos totais (m/v), 25 °C por 24 h). Adaptado: Gould, 1985...................................................................
Capítulo 3
Pg.
Figura 1
Correlação entre o °Brix e os teores de açúcares redutores totais (ART) para os caldos das cultivares de sorgo sacarino.......................
Figura 2
Correlação entre os teores de açúcares redutores totais (ART) e as concentrações de etanol nos caldos fermentados das cultivares de sorgo sacarino.......................................................................................
Capítulo 4 Figura 1
Figura 2
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
84
87 Pg.
Teores de °Brix em função da época de colheita dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas no experimento de campo. Valores para n=4, MG: Média geral para a fase colheita dos colmos, Letras iguais nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, CV(%)= 17,20..................................... Perda de massa durante a etapa de pré-tratamento do bagaço de diferentes cultivares de sorgo sacarino com H2O2 (40 g.L-1 substrato, 7,5 % H2O2, pH 11,5, 1h, temperatura ambiente). Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade......................................
Capítulo 5 Figura 1
65
102
108
Pg. Espectros de FTIR para amostras de bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino pré-tratadas com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.......................................................
130
Espectros de FTIR para amostras de bagaço de sorgo sacarino prétratadas com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...........................................................................................
130
Difratogramas de raios X para amostras de bagaço de cana-de-açúcar “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólidolíquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...................................................................
132
Difratogramas de raios x para amostras de bagaço de sorgo sacarino “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólidolíquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...................................................................
132
Imagens de MEV para amostras de bagaço de cana-de-açúcar in natura (a) e após pré-tratamento (b) e sorgo sacarino in natura (c) e após pré-tratamento (d). Pré-tratamento com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm......................................
133
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Aspecto fermentativo de D. bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas........................................... Aspecto fermentativo de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de sorgo sacarino, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas.............................................................................................. Cinética de fermentação de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em reator de bancada. Os valores representam a média de duplicatas......................
135
136
138
LISTA DE TABELAS Capítulo 1
Pg.
Tabela 1
Potencial de produção de biomassa de sorgo sacarino no semiárido do NE do Brasil no ano de 2010.......................................................
27
Tabela 2
Composição de açúcares presentes em algumas cultivares de sorgo sacarino..............................................................................................
30
Tabela 3
Teores de macro e micronutrientes no caldo da cultivar de sorgo sacarino KKU 40...............................................................................
31
Tabela 4
Composição química do bagaço de sorgo para diferentes cultivares...........................................................................................
33
Capítulo 2
Pg.
Tabela 1
Conteúdos de celulose, hemicelulose e lignina comumente reportados para as principais biomassas lignocelulósicas................
57
Tabela 2
Eficiências de hidrólise enzimática reportados para diferentes tipos de biomassas pré-tratadas com H2O2 alcalino...................................
59
Tabela 3
Efeito da temperatura na solubilização de lignina e hemicelulose (% matéria seca) presentes na biomassa de palha de centeio prétratada com H2O2 (2%, pH 11,5 por 12 h). Adaptado: Sun et al. (2000)................................................................................................
Capítulo 3 Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
65
Pg Caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino obtidas de experimento de campo no município de Goiana – PE......................................................................................
83
Parâmetros cinéticos na fermentação estática de diferentes caldos de cultivares de sorgo sacarino utilizando fermento industrial (leite puro) obtida na destilaria Japungú, PB à 33 °C..............................
86
Produção teórica de etanol por hectare para as cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Goiana, PE.............................
Capítulo 4
88
Pg.
Tabela 1
Caracterização inicial dos caldos das cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Itambé-PE.............................................
Tabela 2
Parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das cultivares de
104
sorgo sacarino, condição estática, 6h, 33°C......................................
105
Tabela 3
Composição química do bagaço in natura e após pré-tratamento com H2O2 de diferentes cultivares de sorgo sacarino.......................
107
Tabela 4
Eficiências de hidrólise enzimática para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino, 10 FPU/g bagaço, 50°C, pH = 4,8, 48h.....................................................................................................
109
Tabela 5
Parâmetros cinéticos da fermentação dos hidrolisados de diferentes cultivares de sorgo sacarino com D. bruxellensis, 32°C, 7h, condição estática...............................................................................
110
Capítulo 5
Pg.
Tabela 1
Teores de celulose, hemicelulose e lignina em detergente ácido no bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de sorgo sacarino in natura e após o pré-tratamento (base seca).....................................................
127
Tabela 2
Perda de massa durante o pré-tratamento com H2O2 e teores de açúcares e perda de massa após a hidrólise enzimática (48h) da biomassa de BC e BS........................................................................
128
Tabela 3
Parâmetros cinéticos para a fermentação dos hidrolisados da biomassa de BC e BS por D. bruxellensis com tempo de 7h............
134
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BEN: Balanço energético nacional IPA: Instituto Agronômico de Pernambuco DNSA: Ácido dinitrosalicílico ANOVA: Análise de variância EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuária CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística NREL: National Renewable Laboratory LDA: Lignina detergente ácido CONAB: Companhia Nacional de Abastecimento N-FAN: Nitrogênio Free Amino Nitrogen CE: Condutividade elétrica TAPPI: Techinical Association of the Pulp and Paper Industry ART: Açúcares redutores totais SST: Sólido solúveis totais APPS: Associação paulista de produtores de sementes e mudas FTIR: Espectrometria de infravermelho com transformada de Fourrier MEV: Microscopia eletrônica de varredura DRX: Difratometria de raios-x °C: Graus Celsius g: Grama RPM: rotação por minuto ha: hectare h: hora L: Litro mL: mililitro pH: Potencial hidrogeniônico
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO Autor: Emmanuel Damilano Dutra Orientador: Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientado: Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior
RESUMO Com um cenário de aumento populacional, crescente demanda de energia e degradação ambiental, torna-se necessário a inserção de fontes energéticas renováveis para suprir a crescente demanda de energia. Dentre as fontes renováveis, a energia da biomassa é uma das mais promissoras, pois apresenta potencial para produção de diversos biocombustíveis, como etanol, biogás e biodiesel, além de uma gama variada de produtos químicos e energia. No entanto, a aptidão para a produção de energia a partir da biomassa pode ser afetada em zonas com reduzidas disponibilidades de água, uma vez que culturas energéticas tradicionais demandam grandes quantidades de água por unidade de biomassa produzida. Nesse contexto, o estudo de plantas com alta eficiência hídrica torna-se fundamental para produção de energia de forma sustentável. O sorgo sacarino é uma cultura energética com potencial para a produção de biocombustíveis com elevada eficiência hídrica e baixo consumo de insumos a partir de diferentes frações da biomassa. O caldo é rico em açúcares prontamente fermentescíveis como a sacarose, glicose e frutose, que são facilmente transformados em etanol pelas leveduras industriais. O bagaço, que é o subproduto da extração do caldo dos colmos do sorgo, é rico em carboidratos insolúveis como a celulose e a hemicelulose, que podem produzir etanol após etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática ou ácida. Nesse contexto, o objetivo deste projeto foi avaliar a utilização da biomassa de sorgo sacarino para a produção de etanol, na zona da mata norte de Pernambuco. Para isso foram executados experimentos de produção de etanol a partir do caldo e do bagaço após pré-tratamento e hidrólise enzimática de cultivares de sorgo sacarino, oriundas de experimento de produção de biomassa em campo experimental. Em relação ao etanol de primeira geração foram observadas altas variabilidades na produção de açúcares e etanol para as diferentes cultivares avaliadas, com destaque para as cultivares SF15 e BR 506 com potenciais de produção de etanol em 3142 e 2194 L.ha-1. Em relação ao etanol de segunda geração, não houve diferença na composição química entre as cultivares e o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino foi eficiente para remover lignina sob reduzido tempo e baixo consumo de energia e obter eficiências de hidrólise enzimática entre 60 a 88% e fermentação dos hidrolisados entre 70 a 85% em função da glicose. A levedura D. bruxellensis demonstrou ser um micro-organismo promissor para fermentação dos hidrolisados. Análises estruturais confirmaram o efeito do prétratamento nos bagaços de sorgo. Os resultados obtidos indicam o potencial de uso da biomassa de sorgo sacarino para aumentar a produção de etanol na região Nordeste do Brasil. Palavras-chave: Fontes Renováveis de Energia; Bioenergia, Culturas energéticas, Biomassa, Biocombustíveis.
EVALUATION OF THE PRODUCTION OF FIRST AND SECOND GENERATION ETHANOL FROM SWEET SORGHUM BIOMASS Autor: Emmanuel Damilano Dutra Orientador: Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientado: Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior ABSTRACT With a scenario of population growth, increasing energy demand and environmental degradation there is need to increase the generation of renewable energy sources to provide the energy needs of society. Among the renewable sources, the energy of biomass is one the most promising because it can produce several biofuels like biogas, biodiesel and ethanol, besides a series of chemical products and energy. However, the aptitude for the production of energy from the biomass can be drastically affected in zones with reduced water availability, since traditional energy crops demand great quantities of water per unity of biomass produced. In this context, the study of crops with high water use efficiency is important for the production of sustainable energy. Sweet sorghum is an energy crop with potential for the production of biofuels with high water efficiency and low consumption of inputs. The biofuels may be produced from different fractions of the biomass of sorghum. Juice is rich in readily fermentable sugar like sucrose, glucose and fructose which are easily transformed in ethanol by the industrial yeasts. The bagasse that is the by-product of the extraction of the juice of the stems of sweet sorghum is rich in insoluble carbohydrates like cellulose and the hemicellulose, which can produce ethanol after stages of pretreatment and enzymatic or acid hydrolysis. In this context, the aim of this work was to evaluate the use of sweet sorghum biomass for ethanol production in the Atlantic Forest Zone of Pernambuco. For this reason, experiments were conducted for the ethanol production from juice and bagasse after pretreatment and enzymatic hydrolysis of sweet sorghum cultivars originated from field experiments. In relation to ethanol from first generation we observed high variability in the production of sugar and ethanol for the different cultivars evaluated, with highlight to cultivars SF 15 and BR 506 with potential for ethanol production of 3142 and 2194 L.ha-1, respectively. In relation to second-ethanol generation, there were no differences in chemical composition among cultivars and the pretreatment with H2O2 in alkaline medium was efficient to remove lignin under reduced time and low energy consumption. This pretreatment presented efficiencies of enzymatic hydrolysis between 60 to 85% and hydrolyzed fermentation between 70 to 85% based in glucose conversion. The yeast D. bruxellensis proved to be a promising micro-organism for fermentation of hydrolysates. Ultra structural analysis has confirmed the effect of pretreatment in the sweet sorghum bagasse. The results indicated the potential of sweet sorghum biomass to increase the ethanol production in the Northeastern region of Brazil. Keywords: Renewable energy sources, Bioenergy, Energy crops, Biomass, Biofuels,
18 INTRODUÇÃO Com uma população estimada em aproximadamente 9 bilhões de pessoas no ano de 2050 (Lutz et al., 2001), aumentará a pressão na demanda de energia, atualmente suprida em cerca de 83% por materiais de origem fóssil (Goldemberg, 2009). O aumento no uso destes materiais poderá ocasionar forte diminuição nos recursos energéticos não renováveis e ainda magnificar o efeito estufa acarretando mudanças climáticas que podem afetar o ecossistema terrestre, em especial a disponibilidade de água. Neste cenário fica evidente a necessidade de inserção de novas alternativas para suprir, em parte, as necessidades energéticas da humanidade de uma forma mais sustentável, como as fontes renováveis de energia. Dentre as fontes renováveis de energia, destacam-se a hidrelétrica, solar, eólica, geotérmica, energia das ondas e a biomassa. Fortes investimentos em pesquisa e desenvolvimento tecnológico têm sido realizados em todo o mundo para viabilizar o uso destas fontes de energia, em especial a energia da biomassa. Como parte destes esforços, surgiu o conceito de biorrefinaria, que tem como objetivo central a aplicação de métodos e processos com o intuito da utilização integral das matérias-primas e dos resíduos do processo, com diminuição das emissões de gases de efeito estufa durante o ciclo de vida dos produtos gerados neste conceito (Bastos, 2007; Rodrigues, 2011). No Brasil, o uso intensivo da biomassa para geração de energia é uma realidade desde a década de 70, quando o programa governamental (Proálcool) estimulou a substituição de derivados fósseis por biocombustíveis. Atualmente, a biomassa responde por aproximadamente 29% da matriz energética nacional e o país é exemplo de matriz energética limpa e renovável com 42 % da oferta interna de energia renovável (BEN, 2013). Os principais biocombustíveis produzidos no país são o etanol e o biodiesel. O etanol é produzido quase que exclusivamente a partir da sacarose da cana-de-açúcar e o biodiesel a partir de óleos vegetais, principalmente óleo de soja, de algodão e gorduras animais. Em algumas regiões do Brasil a limitação hídrica afeta diretamente a viabilidade de culturas agrícolas energéticas tradicionais, como cana-de-açúcar e soja. Como por exemplo, a zona da mata norte no nordeste brasileiro, onde a produção da cana-deaçúcar depende de irrigação para alcançar elevadas produtividades. Com a limitação hídrica atual e com cenário de possíveis reduções das precipitações como consequência de mudanças climáticas, torna-se evidente a necessidade de pesquisas com culturas
19 agrícolas que tenham alta eficiência na produção de biomassa com menor exigência hídrica. O sorgo sacarino apresenta-se com potencial, uma vez que produz biomassa com alta eficiência fotossintética e menor exigência hídrica que a cana e adapta-se bem em diferentes condições de solo e clima (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). A utilização da biomassa de sorgo sacarino para produção de biocombustíveis está centrada em três tecnologias principais: 1) fermentação direta dos açúcares presentes no caldo dos colmos; 2) hidrólise enzimática do amido presente nas panículas e fermentação dos hidrolisados e 3) aproveitamento do material lignocelulósico presente no bagaço, após pré-tratamento, hidrólise e fermentação dos açúcares liberados para a produção de etanol. Em cada uma destas rotas tecnológicas, ainda são necessários esforços para aprimorar os processos para maiores produções de etanol a partir da biomassa do sorgo. Na fermentação direta dos açúcares do caldo, maiores eficiências ainda são buscadas, com investigações que vão desde novos micro-organismos até a influência da qualidade da matéria-prima como excesso ou falta de nutrientes. Na produção de etanol a partir dos grãos, melhoras nas eficiências de hidrólise enzimática e também na fermentação ainda são possíveis de acontecer com design de novos processos (Viikary et al., 2012). No aproveitamento do bagaço para produção de etanol estão os maiores gargalos do ponto de vista tecnológico e ambiental, uma vez que existe uma gama variada de prétratamentos que podem ser usados para aumentar as taxas de hidrólise enzimática. Prétratamentos que demandem baixo consumo de energia e não gerem inibidores para os processos biológicos são preferíveis para o processo. Melhorias na etapa de hidrólise enzimática e fermentação também ainda são desafios para esta tecnologia. Neste contexto o objetivo geral desta tese foi avaliar a utilização da biomassa de sorgo sacarino com cultivares tradicionalmente cultivadas na região Nordeste do Brasil para a produção de etanol. Para atingir tal objetivo a tese foi organizada em 5 capítulos que abrangem diferentes abordagens para o uso da biomassa de sorgo. No capítulo 1, intitulado “Potencial de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino no Nordeste do Brasil: Desafios e oportunidades” é apresentada uma discussão sobre o potencial de produção de etanol com a biomassa de sorgo sacarino a partir de diferentes frações da planta, como caldo, grãos, bagaço e folha. São apresentadas as principais tecnologias existentes dos processos de conversão e discutidos os principais gargalos para o cultivo do sorgo na região Nordeste do Brasil. No capítulo 2, “Aplicação do peróxido de hidrogênio no pré-tratamento de biomassa” é apresentada uma revisão sobre o uso do pré-tratamento com H2O2 para
20 diferentes tipos de biomassas e as principais características que fazem do seu uso um pré-tratamento eficiente e com baixo consumo de energia. Também são discutidos os efeitos das principais variáveis do processo de pré-tratamento e os desafios para tornar este pré-tratamento viável em nível industrial. O capítulo 3, “Produção de etanol a partir do caldo do colmo de diferentes cultivares de sorgo sacarino em Pernambuco, Nordeste do Brasil”, enfoca o potencial de produção de etanol de cultivares de sorgo sacarino cultivadas em área de reduzida precipitação na zona da mata de Pernambuco. Este trabalho aborda apenas a produção de etanol a partir do caldo das diferentes cultivares. No capítulo 4, “Produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de cinco cultivares de sorgo sacarino”, é abordada a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de cinco cultivares de sorgo sacarino em região de reduzida precipitação da zona da mata de Pernambuco. Neste capítulo foi possível determinar a melhor época de colheita dos colmos para as diferentes cultivares avaliadas. Para finalizar, no capítulo 5, “Produção de etanol de segunda geração a partir do bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino por Dekkera bruxellensis GDB 248”, foi comparada a produção de etanol dos bagaço de sorgo sacarino e cana-de-açúcar com micro-organismo com capacidade para fermentar celobiose e glicose.
21 CAPÍTULO I
POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO NO NORDESTE DO BRASIL: DESAFIOS E OPORTUNIDADES
22
POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO NO NORDESTE DO BRASIL: DESAFIOS E OPORTUNIDADES
RESUMO O sorgo sacarino é uma cultura energética com potencial para a produção de etanol a partir de diferentes frações da biomassa. O caldo é rico em açúcares diretamente fermentescíveis facilmente transformados em etanol pelas leveduras industriais. Os grãos são ricos em amido que podem ser fermentados a etanol após a hidrólise enzimática ou ácida. O bagaço é rico em açúcares insolúveis como a celulose e as hemiceluloses, que podem produzir etanol após hidrólise enzimática ou ácida. A fim de avaliar o potencial de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino na região nordeste, principalmente em área de reduzida precipitação pluviométrica, foram reunidas informações referentes à produção de etanol a partir do caldo, dos grãos e do bagaço de sorgo sacarino. A utilização integral da biomassa de sorgo sacarino pode gerar 6730 L.ha-1, sendo os principais desafios tecnológicos relacionados com o melhoramento das cultivares com características sacarinas no aumento das produtividade de biomassa e nos teores de açúcares, com otimizações de processos nos três eixos de produção (caldo, grãos e bagaço) para melhorar as eficiências de conversão de açúcares em etanol e desenvolvimento de processos de aproveitamento integral da biomassa de sorgo sacarino. Palavras-chave:
Bioenergia,
Culturas
enzimática, Etanol lignocelulósico
energéticas,
Biocombustíveis,
Hidrólise
23 ABSTRACT The sweet sorghum is a energy crop with potential for ethanol production from different fractions of the plant. The juice is rich in readily fermentable sugars, such as sucrose, glucose and fructose, which are easily processed into ethanol by industrial yeasts. The grains are rich in starch that can be fermented by ethanol after enzymatic or acid hydrolysis. The bagasse, the by-product of the extraction of juice from sorghum stalks, is rich in insoluble sugars like cellulose and hemicelluloses, which can produce ethanol after steps of pretreatment and enzymatic or acid hydrolysis. In order to evaluate the potential of ethanol production from sweet sorghum biomass in Northeastern Brazil, particulary in the areas of reduced rainfall, this review aimed at gathering information available in the literature regarding the production of ethanol from juice, grains and bagasse of sweet sorghum. The results indicate that the integral utilization of the sweet sorghum biomass can generate about 6730 L.ha-1 of ethanol. The main technological challenges are related to the improvement of cultivars with high sugar content, with optimizations in the three axes of processes (Juice, grains and bagasse) of ethanol production and integrative processes of full exploitation of sweet sorghum biomass. Key words: Bioenergy, Energy crops, Enzymatic Hydrolysis, Lignocellulosic ethanol.
24 1. INTRODUÇÃO A produção de biocombustíveis a partir de fontes renováveis está aumentando no mundo. Como uma medida para substituir os combustíveis de origem fóssil e diminuir as emissões de gases poluentes que podem causar mudanças climáticas. Os principais biocombustíveis produzidos são biodiesel, biogás e etanol. O etanol é produzido a partir de carboidratos como a sacarose e o amido, sendo a cana-de-açúcar e o milho as principais culturas energéticas para sua produção (Sánchez e Cardona, 2008). A escolha da matéria-prima para a produção do etanol depende das condições ambientais da região. No Brasil, predomina o cultivo da cana-de-açúcar, porém em algumas regiões do país a limitação hídrica afeta diretamente a viabilidade de culturas agrícolas energéticas tradicionais. Como exemplo, a zona da mata no nordeste brasileiro, onde a produção da cana-de-açúcar depende de irrigação para uma adequada produção e o semiárido nordestino onde não há cultivo de culturas energéticas. Com a limitação hídrica atual e com cenário de possíveis reduções das precipitações como consequência de mudanças climáticas, torna-se evidente a necessidade de pesquisas com culturas agrícolas desenvolvidas para elevada produção de biomassa com menor exigência hídrica, como sorgo sacarino (Rooney et al., 2007). O sorgo sacarino é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol, e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilakoglou et al., 2011). É uma gramínea com ciclo fotossintético C4, cultivada em vários países distribuídos nas diferentes regiões do globo (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). É originário da África, sendo domesticado na Etiópia, cerca de 5.000 anos atrás. O sorgo granífero é o quinto cereal mais cultivado no mundo (40 milhões de hectares em 2009, Kumar et al., 2011). Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005), ração e fibras (Murray et al., 2008). Como principais características destacam-se a eficiência no uso de água (1/3 da canade-açúcar e 1/2 do milho) e bom desenvolvimento em diferentes condições edafoclimáticas. Em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos rico em amido e 50 t ha-1 de colmos rico em açúcares solúveis como sacarose, glicose e frutose (Wu et al., 2010) no caldo e carboidratos insolúveis (celulose e hemicelulose) no bagaço gerado após extração do caldo. A produção de etanol a partir das diferentes frações da planta de sorgo sacarino varia em função das cultivares, das condições edafoclimáticas e dos tipos
25 de tecnologias utilizadas nos processos de conversão. De uma forma geral a produção de etanol a partir do caldo situa-se em aproximadamente 3450 L.ha-1 (Prasad et al., 2007), do amido em 800 L.ha-1 (Zhao et al., 2009) e da fração celulósica + hemicelulósica do bagaço em 5400 L.ha-1 (Zhao et al., 2009). Apesar da retomada com as pesquisas no desenvolvimento do sorgo sacarino como matéria-prima para geração de biocombustíveis no Brasil e no mundo, na região Nordeste do Brasil ainda são incipientes as informações acerca desta cultura para fins energéticos. Esforços do IPA no desenvolvimento e melhoramento de cultivares de sorgo forrageiro-sacarino na região datam da década de 70, obtendo principalmente informações referentes à produção de biomassa e eficiência de uso de água e nutrientes (Tabosa et al., 2009). No contexto da retomada dos estudos com biomassas avaliadas em décadas passadas, o objetivo desta revisão foi reunir informações referentes à utilização da biomassa do sorgo sacarino como matéria-prima para a produção de etanol a partir das diferentes frações da biomassa, com foco principal na região Nordeste do Brasil. Além disso, pretende-se discutir as principais dificuldades da implantação desta cultura e as novas perspectivas do ponto de vista das biorrefinarias.
26 2. ASPECTOS GERAIS DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO O sorgo é uma cultura agrícola de importância indiscutível para os seres humanos. Desde os primórdios da civilização, o homem tem domesticado e trabalhado esta cultura para produção de alimentos. Atualmente, o sorgo granífero é o quinto cereal em área cultivada no mundo e estima-se que 40 milhões de hectare sejam cultivados anualmente (Kumar et al., 2011). O sorgo é uma cultura de colmos longos que pode atingir altura entre 0,6 a 6 m, cada colmo produzindo folhas e panícula que da sustentação às sementes. Possui ciclo fotossintético do tipo C4, sendo inicialmente o que lhe confere maior eficiência fotossintética e uso da água que culturas de ciclo C3. É uma cultura de ciclo curto, quatro meses, e que se propaga através de sementes, além de ter bom desenvolvimento em uma gama variada de solos e clima. O sorgo pode ser divido em quatro grandes grupos, cada um com suas características de uso: 1) granífero, tipo de sorgo com porte baixo e alta produtividade de panículas ricas em amido, utilizado principalmente na alimentação humana e animal; 2) forrageiro, tipo de sorgo com elevada produção de biomassa e açúcares estruturais como celulose e hemicelulose, sendo principalmente utilizado como forragem e para a produção de silagem; 3) fibroso, tipo de sorgo de porte alto e alongado como colmos ricos em celulose e hemicelulose e pequena fração (20%) de açúcares não estruturais, tendo aplicação na área de produção de celulose e 4) sacarino, tipo de sorgo com porte alongado e rico em carboidratos não estruturais como sacarose, glicose, frutose e estruturais (celulose e hemicelulose) (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012), sendo o grupo de maior potencial para produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. No Brasil, os dados oficiais indicam o cultivo de 1.270.013 hectares (APPS, 2012), sendo 935.443 ha de sorgo granífero e 334.520 ha de sorgo forrageiro sem índices para sorgo sacarino. Cabe destacar, que estes valores correspondem a comercialização de sementes híbridas, sendo considerado que cada 10 kg de semente equivale a 1 ha plantado e que as áreas cultivadas com cultivares locais não estão contempladas. As regiões sudeste e centro-oeste são as maiores produtoras. Na região Nordeste do Brasil cultiva-se principalmente o sorgo forrageiro para produção de silagem para alimentação animal na região semiárida, mas recentemente tem-se buscado cultivares do tipo sacarino para a produção de etanol (Dutra et al., 2013). Grande parte dos dados relatados para a região Nordeste do Brasil indicam produtividades de
27 biomassa variadas dentro das mesorregiões específicas e sobre manejos diferentes. Na mesorregião semiárida, dados de cultivares sacarina apontam baixas produtividades influenciadas por fatores edafoclimáticos (Tabela 1). Na mesorregião de zona da mata, produtividades maiores são documentadas (Tabosa et al., 2002). Mas quando manejado adequadamente com adubação química e orgânica e sob regime de irrigação durante o ciclo de cultivo, a cultivar SF 15 pode atingir níveis máximos de produtividade de biomassa de 194 t.ha-1 (Tabosa et al., 2013). TABELA 1. Potencial de produção de biomassa de sorgo sacarino no semiárido do NE do Brasil no ano de 2010. Cultivares*
Mg.ha-1
IPA 467-4-2
8,59
SF 11
8,31
IPA 8602600
5,53
IPA 8602589
5,22
1011
5,16
T07
10,60
IPA SF 25
11,77
T 17
11,74
IPA 8602571
6,82
BR 506
6,04
SF 15
8,23
IPA 2502
5,56
*média para três regiões semiáridas do Nordeste em três tipos de solos diferentes. Fonte: IPA (2012).
Em um estudo na região semiárida, Lima et al. (2010), objetivando selecionar, incorporar e adaptar novas tecnologias/cultivares de sorgo sacarino, mais tolerantes às condições climáticas adversas, avaliaram 12 cultivares, oriundas do Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA de PE. Os resultados de produtividade de biomassa apresentaram amplitude de mais de 40 t ha-1 de biomassa, entre a variedade mais produtiva (SF-15 com 60,77 t ha-1) e a variedade menos produtiva (WILLEY com 19,70 t ha-1), mostrando assim, a variabilidade genética entre os materiais. Souza et al. (2005), avaliando a cultivar IPA 467 em condição de irrigação e adubação orgânica e mineral,
28 obtiveram produtividades de massa verde total de 64 t ha-1, e das frações colmo e folhas de 46 t ha-1 e 18 t ha-1, respectivamente. Concluíram que as características agronômicas apresentadas pela cultura do sorgo indicam a sua potencialidade como grande produtor de biomassa, sementes e folhas, elevada capacidade de rendimento de colmos, alta percentagem de extração de caldo e alto conteúdo de sólidos solúveis totais, similar ao da cana-de-açúcar. Além da região Nordeste, dados de desempenho de produção de biomassa em diferentes regiões do Brasil são reportados por Parrella (2010), que avaliou o desempenho de 25 cultivares de sorgo sacarino em diferentes regiões edafoclimáticas visando a produção de etanol e observou que as cultivares diferiam geneticamente quanto a altura de planta, produção de biomassa verde e sólidos totais no caldo extraído dos colmos, com cultivares variando de 2,57 a 3,09 m, 38,13 a 54,56 t ha-1 e 13,99 a 20 °Brix. Apesar da grande variabilidade para a produção de biomassa, o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol está centrada em três tecnologias principais: 1) fermentação direta dos açúcares presentes no caldo dos colmos; 2) hidrólise enzimática do amido presente nas panículas e fermentação dos hidrolisados e 3) aproveitamento do material lignocelulósico presente no bagaço, após pré-tratamento, hidrólise e fermentação dos açúcares liberados para a produção de etanol.
29 3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO A biomassa de sorgo sacarino com potencial para a produção de biocombustíveis é composta de colmos, folhas, caldo e grãos. A proporção de cada componente varia de acordo com a cultivar avaliada, mas a maior fração é composta de colmos, seguida de folhas e grãos (Figura 1). O caldo é composto de sacarídeos simples como glicose e frutose e dissacarídeos como a sacarose. Estes açúcares são prontamente fermentescíveis pela maioria das leveduras industriais como as da espécie S. cerevisiae. Em algumas cultivares de sorgo sacarino também são relatadas pequenas frações de amido (Barcelos, 2012). A composição dos açúcares pode variar fortemente com o tipo de cultivar avaliada (Tabela 2), bem como com o local de cultivo e a época de colheita dos colmos (Teetor et al., 2011).
Figura 1: Composição da biomassa de sorgo sacarino de cultivares plantadas no Nordeste do Brasil.
30
Tabela 2: Composição de açúcares presentes em algumas cultivares de sorgo sacarino. Cultivar
Sacarose (%)
Glicose (%)
Frutose (%)
Açúcares totais (g/L)
Referência
Berény
62,5
21
16,5
120
Sipos et al. (2009)
Wray
92
6,7
1,3
150
Teetor et al. (2011)
Rio
14,9
47,9
37,2
121
Davila-Gomez et al. (2011)
M81E
70
20
10
154
Wu te al. (2010)
KKU40
71,7
12,1
9,7
161,7
Laopaiboon et al. (2009)
Apesar da tradição no cultivo de sorgo no nordeste brasileiro ainda são escassas as informações quanto à composição de açúcares em termos de sacarose, glicose e frutose dos caldos das principais cultivares usadas na região. O conhecimento dos açúcares presentes no caldo é importante, pois caracteriza a cultivar de sorgo para a produção de açúcar ou exclusivamente para a produção de biocombustíveis e outros produtos. Uma cultivar largamente plantada em várias regiões do pais, inclusive no Nordeste, como a BRS 506, apresenta 62,9 % de sacarose, 25,8 % de glicose e 11,3% de frutose (EMBRAPA, 2012). Também é importante salientar a lacuna de informações agroindustriais em relação às cultivares, tais como grau de pureza, pol, pol% e fibra que são quantificações utilizadas na indústria sucroalcooleira para determinar a qualidade da matéria-prima (Silva Costa et al., 2011). Além dos teores de açúcares, o caldo possui macro e micronutrientes que são essenciais para a viabilidade do processo de bioconversão dos açúcares em biocombustíveis (Walker, 2004). Os principais nutrientes na composição do caldo do sorgo para cultivar KKU 40 cultivada na Tailândia estão expressos na Tabela 3. Assim como para os teores de açúcares, informações sobre as concentrações de nutrientes nos caldos das principais cultivares plantadas na região Nordeste do Brasil são escassos e geralmente são reportados juntamente com os nutrientes do colmo (Formiga et al., 2012).
31 Tabela 3: Teores de macro e micronutrientes no caldo da cultivar de sorgo sacarino KKU 40. Nutrientes
Caldo de sorgo sacarino*
N
657 mg.L-1
P
20 mg.L-1
K
1790 mg.L-1
Na
170 mg.L-1
S
120 mg.L-1
Ca
166 mg.L-1
Mg
194 mg.L-1
Fe
2 mg.L-1
Mn
3 mg.L-1
Cu
0,3 mg.L-1
Zn
1,4 mg.L-1
*Fonte: Laopaiboon et al. (2009) Além do caldo, o grão de sorgo é uma fração importante da planta sendo classificado como cariopse nua, composta por pericarpo, endosperma e embrião (SernaSaldivar et al., 2012). O grão do sorgo apresenta composição química semelhante à do grão de milho, com teores de amido entre 60 a 80%. Além do amido, o grão também possui lipídeos e proteínas. O percentual de cinzas é geralmente baixo, com valores entre 1-2%, assim como os teores de fibra bruta (1,4%) e auxiliam na digestibilidade dos grãos, principalmente para nutrição animal. Algumas cultivares de sorgo apresentam elevados teores de taninos o que dificulta a conversão enzimática e consequentemente a produção de etanol. A produção de biocombustíveis a partir do grão enfrenta, além de dificuldades técnicas, entraves do ponto de vista ético uma vez que o amido presente nos grãos pode ser utilizado para produzir uma gama variada de alimentos, o que acarreta no conflito alimentos x biocombustíveis. Pouca informação acerca da composição química dos grãos de sorgo são encontradas para variedades cultivadas na região Nordeste. Apenas para a cultivar IPA 467 tem-se relatado teor de amido nos grãos em média de 61% (Souza et al., 2005). Além do caldo e do grão de sorgo sacarino, o bagaço e as folhas são materiais lignocelulósicos ricos em celulose, hemicelulose e lignina, com grande variação em sua composição (Tabela 4). O percentual de celulose encontra-se predominantemente na
32 faixa de 32 a 45%, o de hemicelulose entre 16 a 27% e o de lignina varia de 14 a 20%. Esta grande diferença se dá devido ao uso de sorgo das mais diversas variedades, cultivado e processado em condições distintas e também devido ao emprego de técnicas analíticas diferentes em cada estudo, sendo mais comuns metodologias baseadas nas normas do National Renewable Energy Laboratoty (NREL) (Hames et al., 2008; Sluiter et al., 2008), da TAPPI (Techinical Association of the Pulp and Paper Industry) e de Van Soest (1963). Assim como o bagaço, as folhas do sorgo sacarino são compostas de celulose, hemicelulose e lignina, mas geralmente apresentam valores mais elevados de lignina que o bagaço (Kim et al., 2012).
33
Tabela 4: Composição química do bagaço de sorgo sacarino para diferentes cultivares. Cultivar
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Lignina (%)
Extrativos (%)
Cinzas (%)
Referência
NR
27,3
14,5
14,3
32,2
----
Li et al. (2010) (NREL)
AC791
32,5
19,8
11,7
17,5
-----
Xu et al. (2010) (NREL)
NR
35,6
20,2
18,2
18,7
------
Li et al. (2010) (NREL)
Sucrosorgo 405
38,5
21,4
17,6
13,3
3,7
Panagiotopoulos
et
al. (2010) (TAPPI) Chuntian No.2
45,3
26,3
15,2
-----
------
Zhang et al. (2011) (Van Soest, 1963)
M81-E
32,1
26,4
5,2
-----
-----
Han et al. (2013) (Van Soest)
Topper
45
28
22
----
5
Chen et al. (2012) (NREL)
Berény
36,25
27,68
18,6
NR
NR
Sipos et al. (2009) (NREL)
34 Para as principais cultivares de sorgo sacarino desenvolvidas e adaptadas para produção no Nordeste do Brasil, os dados de composição dos bagaços são escassos quando não inexistentes. As informações existentes são, na sua grande maioria, de análises bromatológicas usadas na área de alimentação animal (Aguiar et al., 2006). A caracterização da cultivar IPA 467 foi feita pelo grupo de energia da biomassa DENUFPE através de metodologias do NREL e de Van Soest (Figura 2). Diferenças significativas foram observadas nos teores de lignina para as duas metodologias uma vez que a determinação de LDA subestima o valor real de lignina, pois não quantifica a lignina solúvel (Frei, 2013). No entanto, ainda são necessários mais esforços para unir a etapa de produção de biomassa no campo e análise do material quanto à composição do bagaço das folhas para tomada de decisão quanto ao aproveitamento do material.
Figura 2: Composição química da biomassa de sorgo sacarino IPA 467 em função do método de caracterização. Os bagaços são oriundos de experimentos diferentes e em épocas de colheitas diferentes.
35 4. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO SORGO SACARINO A produção de etanol a partir do caldo de sorgo sacarino é realizada de forma semelhante à produção a partir do caldo sacarino da cana-de-açúcar. Após moagem dos colmos, o caldo é purificado e submetido à fermentação com leveduras industriais, principalmente as da espécie Saccharomyces cerevisiae, com eficiência entre 85 – 90 % de conversões dos açúcares em etanol para caldos com 120 g.L-1 de ART inicial (Laopaiboon et al., 2007). Importante parâmetro tecnológico de produção é a eficiência de extração de caldo dos colmos, com valores aceitáveis entre 50 a 70% de eficiência de extração, mas com necessidade de desenvolvimento de tecnologia para aumentos de eficiência
para
valores
próximos
aos
observados
para
a
cana-de-açúcar,
aproximadamente de 90%. (Eggleston et al., 2013). Estima-se que o sorgo sacarino possa produzir em média entre 2500 e 4000 litros de etanol por hectare a partir do caldo do colmo (Almodares e Hadi, 2009). Por se tratar de uma cultura de ciclo curto, pode ser cultivado mais de um ciclo por ano dependendo das condições ambientais, o que poderia aumentar a produção de etanol por unidade de área. O caldo é composto principalmente por açúcares, sacarose, glicose e frutose, prontamente fermentescíveis pelas leveduras industriais (Wu et al., 2010). Devido à grande variabilidade genética e as condições ambientais, a produção de caldo e a concentração de açúcares pelas cultivares de sorgo sacarino podem variar fortemente e por consequência a produção de etanol por unidade de área. Uma desvantagem em relação à cultura da cana-de-açúcar é a rápida decomposição dos açúcares presentes no caldo do sorgo sacarino. Esta observação é crítica quando se postula a introdução do sorgo sacarino como matéria-prima na região Nordeste do Brasil, uma vez que são observadas altas temperaturas ambientais que podem maximizar a decomposição dos açúcares presentes no caldo. Neste contexto, experimentos conduzidos com caldos de cultivares locais em três temperaturas de armazenamento (4 °C, 25 °C e 45 °C), mostraram variações nos teores de açúcares redutores totais, quantificados pelo método do ácido dinitrosalisílico (Miller, 1957), durante 20 dias nas temperaturas 25 °C e 45 °C, sem mudanças significativas a 4 °C (Figura 3).
36
Figura 3: Perfil de decomposição de açúcares redutores totais do caldo de sorgo sacarino em função da temperatura de estocagem. T1: 4°C, T2: 25°C e T3: 45°C. Grande parte dos estudos com a fração do caldo de sorgo sacarino buscam novas cultivares com potencial de produção de etanol. Em recente estudo conduzido na região Nordeste do Brasil, Dutra et al. (2013) avaliaram oito cultivares de sorgo sacarino quanto à concentração de açúcares redutores no caldo para a produção de etanol. Os resultados indicaram diferenças significativas entre as cultivares avaliadas (64 g.L-1 a 164,8 g.L-1), sendo as mais promissoras para a produção de etanol a BR 506 (59,07 ± 1,3 g.L-1), Willey (64,77 ± 4,4 g.L-1) , Wray (59,07 ± 1,3 g.L-1) e IPA 467-4-2 (52,10 ± 0,7 g.L-1). Para o conjunto dos dados experimentais a eficiência de conversão dos açúcares presentes nos caldos para etanol foi 88,4 % do valor teórico. Os maiores potenciais de produção de etanol por hectare foram observados nas cultivares BR 506 e SF 15. Em outro estudo com o caldo de cultivares de sorgo sacarino, em Colônia – Uruguai Guigou et al. (2011) investigaram a produção de etanol a partir do caldo de três cultivares (M81, Topper e Theis), com três condições de materiais: colmo + folhas + panícula; colmo + folhas e sem panícula; e colmo limpo. A eficiência de extração do caldo não foi diferente entre as cultivares, mas o efeito da combinação afetou significativamente a extração do caldo. A concentração de açúcares no caldo extraído das diferentes cultivares não foi influenciada pelas combinações, com valores altos de açúcares em todas: Topper 148 a 191 g.L-1; Theis 135 a 147 g.L-1;e M81 110 a 130 g.L-
37 1
. Após 24 h de fermentação com Saccharomyces cerevisiae – Fleischmann a 30 °C 100
rpm, as concentrações de etanol obtidas foram: Topper 69 a 82 g.L-1; Theis 70 a 75 g.L1
; e M81 43 a 50 g.L-1. Além da busca de novas cultivares e técnicas de pós-colheita, diferentes técnicas
de fermentações têm sido utilizadas para a produção de etanol a partir do caldo do colmo do sorgo sacarino. Laopaiboon et al. (2007) investigaram a produção de etanol a partir do caldo do sorgo sacarino, variedade keller, na Tailândia, em sistemas em batelada e batelada alimentada com a levedura S. cerevisiae. No sistema operado em batelada, com concentração inicial celular de 1x108 células mL-1 e sólidos solúveis totais (SST) de 24° Brix a concentração de etanol (P), rendimento (Yp/s) e produtividade (Qp) foram 100 g L-1, 0,42 g g-1 e 1,67 g L-1 h-1, respectivamente. No sistema em batelada alimentada, os autores sugeriram uma única alimentação como a melhor estratégia, com o teor de sólidos solúveis inicial de 24 °Brix, com resultados para os parâmetros cinéticos P, Yp/s e Qp de 120 g L-1, 0,48 g g-1 e 1,11 g L-1 h-1, respectivamente. Sistemas com células imobilizadas em suportes podem diminuir os custos de produção de etanol a partir do caldo do sorgo sacarino, pois tem como principais vantagens atuar com altas concentrações de inóculo, melhor mistura de fases, operar com altas taxas de fermentação, reutilizar as células no processo e menor inibição pelos produtos formados (Laopaiboon e Laopaiboon, 2012). Considerando que as recuperações de etanol devem ser aumentadas juntamente com a diminuição do gasto de energia, fermentações com altas concentrações de açúcares iniciais (>270 g.L-1) têm sido avaliadas (Loapaibon et al., 2009). Geralmente este tipo de processo permite obter vinhos com teor de etanol com 100-120 g.L-1, mas apresenta desvantagem de resultar em baixas produtividades volumétricas pelo elevado tempo de processo (40 -120h) e afetar a viabilidade das células de levedura. Na abordagem com altas concentrações iniciais de açúcares, esforços têm sido realizados para melhorar a eficiência de fermentação através do screening dos principais nutrientes que afetam a fermentabilidade dos caldos. Um estudo com fermentação de caldo de sorgo sacarino, avaliando as influências de Zn, Mg, Mn e de extrato de levedura como fonte de nitrogênio no processo, demonstrou que a importância segue a seguinte ordem: extrato de levedura > Mn+2 > Zn+2 > Mg+2 (Deesuth et al., 2012).
38 5. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DOS GRÃOS DO SORGO SACARINO O processo de produção de etanol a partir dos grãos de sorgo sacarino é semelhante ao modo de produção de etanol a partir dos grãos de milho, pois está baseado na transformação do amido em glicose, através de hidrólise enzimática com αamilase e glucoamilase e posterior fermentação dos hidrolisados com leveduras. No entanto ainda são escassas as publicações sobre o uso dos grãos de sorgo para produção de etanol, principalmente devido ao aproveitamento alimentício dos grãos. A produção de grãos de sorgo granífero e sacarino situa-se entre 2 a 3 t ha-1. A concentração média de amido nos grãos de sorgo é bastante variável e depende da cultivar e do local de produção. Em média, pode-se produzir aproximadamente 815 L de etanol por hectare (Zhao et al., 2009). Otimizações de processo têm sido relatadas, a exemplo do trabalho de Barcelos et al. (2011) que avaliaram a hidrólise enzimática do amido do grão de sorgo e a fermentabilidade do hidrolisado enzimático empregando uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae. A concentração de amido nos grãos foi de 79 % na matéria seca. As melhores condições de hidrólise enzimática foram: diâmetro de partícula de 0,5 mm; relação sólido:líquido de 1:3; carga de 20 µL de α-amilase e 40 µL de glucoamilase por g de grão. Nestas condições de hidrólise enzimática, o hidrolisado fermentado apresentou máxima concentração de etanol, 86,7 g.L-1, correspondendo a 20,8 g de etanol para cada 100 g de grãos de sorgo em 16 h de fermentação. Assim como para a produção de etanol a partir do caldo, maiores concentrações de etanol, que reduzem os gastos de energia no processo de destilação, também são buscadas a partir do amido do grão usando a abordagem da alta concentração de açúcares iniciais. Neste contexto Bovchora et al. (2000) avaliaram a co-fermentação de grãos de sorgo com caldo em altas concentrações de açúcares iniciais (34 g de sólidos dissolvidos em 100 mL) com levedura do gênero Saccharomyces cerevisiae, por 96 h. Quando comparada com condições normais de fermentação, a recuperação de etanol foi 3 vezes superior, no entanto nem todo açúcar foi consumido pelas leveduras. Dados para a região Nordeste do Brasil em relação à produção de amido por diferentes cultivares são incipientes. Apenas são relatados dados de composição de amido para a IPA 467 utilizada para produção de alimento com teores médio de 61% (Souza et al., 2005).
39 6. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO BAGAÇO E DAS FOLHAS DO SORGO SACARINO Estudos com a fração lignocelulósica do bagaço do sorgo sacarino são fundamentais para aumentar a produção de etanol por unidade de área plantada e tornar o balanço energético mais positivo. Com isso, várias pesquisas têm sido realizadas para tornar viável a produção de etanol a partir da celulose. Estima-se que a produção de etanol a partir do bagaço seja de aproximadamente 2423 litros de etanol por hectare (Prasad et al., 2007). Para transformar os polissacarídeos insolúveis constituintes do bagaço e das folhas, geralmente são necessárias etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática ou ácida. Existem vários tipos de pré-tratamentos disponíveis e a escolha de um método específico ou a combinação de métodos vai depender do uso dos hidrolisados. Para a biomassa de sorgo, vários métodos são reportados (Sipos et al., 2009; Shen et al., 2012; Wang et al., 2012) com vantagens e desvantagens bem como diferentes estratégias de hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados. Avaliações com quatro tipos de pré-tratamento do bagaço de sorgo sacarino, cultivar Chuntian No.2, foram realizadas para aumentar a suscetibilidade à hidrólise enzimática: uso de líquidos iônicos, explosão a vapor, lime (cal) e ácido diluído. Os melhores resultados de conversão de celulose e concentração de glicose foram obtidos com o pré-tratamento com explosão a vapor, 70 % e 25 g L-1, respectivamente. Comparando com o tratamento controle, a explosão a vapor teve conversão 2,5 vezes maior. Para todos os pré-tratamentos avaliados foi verificada a desorganização da estrutura cristalina da celulose e aumento da área superficial disponível, que tornou a celulose mais acessível à hidrólise enzimática. Infelizmente não foi realizada pelos autores a fermentação dos hidrolisados lignocelulósicos (Zhang et al., 2011). Em outro estudo foram avaliadas as produções de etanol a partir do bagaço de sorgo sacarino pré-tratado com ácido fosfórico e hidróxido de sódio, com ou sem ultrasonificação e posterior hidrólise enzimática com celulases e β-glicosidase comerciais. O fungo Mucor hiemalis foi utilizado como micro-organismo fermentador a 32 °C, 120 rpm e por 60 h. Após os pré-tratamentos foram alcançados eficiência de conversão de celulose entre 79 e 92%, sendo o melhor resultado obtido com o prétratamento com hidróxido de sódio (12 % m/v) combinado com ultrasonificação. A fermentação por 24 h do bagaço pré-tratado com NaOH-ultrasonificação e hidrolisado
40 com enzimas acarretou na produção de etanol com 81% de eficiência com relação ao valor teórico (Goshadrou et al., 2011). A produção de etanol a partir da palhada (colmos e folhas) de sorgo forrageiro também foi alvo de estudo por apresentar elevada produção de biomassa na região sudeste do Brasil. Foi avaliada a cultivar BRS 655, desenvolvida pela Embrapa, com três tipos de pré-tratamento (alcalino com NaOH, ácido com H2SO4 e H2SO4 seguido de NaOH) e dois tempos de reação (15 e 30 min), sendo observadas melhoras significativas na etapa de hidrólise enzimática com eficiências acima de 90% de conversão de celulose em glicose (Cardoso et al., 2013). Além do pré-tratamento, investigações na etapa de hidrólise enzimática são fundamentais para viabilizar a tecnologia de conversão pela rota bioquímica. Neste cenário, os trabalhos com hidrólise enzimática da biomassa de sorgo inicialmente foram desenvolvidos para baixas concentrações de biomassa (20 a 100 g.L-1, Sipos et al., 2009; Shen et al., 2011) que permitiam pequenas recuperações finais de etanol. Atualmente, os estudos estão focados em usar altas cargas de sólidos > 250 g.L-1 o que diminui a eficiência de hidrólise, mas aumenta a recuperação de etanol após a fermentação dos hidrolisados (Wang et al., 2012). Em relação a estudos com a fração lignocelulósica das cultivares desenvolvidas e adaptadas para a região Nordeste do Brasil, os resultados são escassos quando não inexistentes e não há respostas para: qual o teor de celulose, hemicelulose e lignina para cultivares locais? Qual o melhor tipo de pré-tratamento para a biomassa de sorgo disponível na região? Que tipo de abordagem de hidrólise deve-se utilizar enzimática ou ácida? Estas perguntas devem ser respondidas juntamente com as determinações dos potenciais de produção de etanol por unidade de área para estas frações.
41 7.
BIOMASSA
DE
SORGO
COMO
MATÉRIA-PRIMA
PARA
BIORREFINARIAS O conceito recente de biorrefinaria refere-se a um sistema integrado de instalações e equipamentos desenvolvidos para conversão da biomassa por rota termoquímica ou bioquímica com o objetivo de produzir combustíveis, energia e produtos químicos (FitzPatrick et al., 2010). Os métodos aplicados para conversão da biomassa são semelhantes ao de uma refinaria de petróleo. O conceito de produção através de sistemas integrados ganhou força com a grande disponibilidade de biomassa residual oriundas das atividades de produção e faz parte dos esforços de sustentabilidade almejados pelo setor acadêmico e industrial. Neste cenário, o sorgo sacarino tem sido avaliado como matéria-prima para o desenvolvimento de biorrefinarias em diversas rotas de aproveitamento integral da biomassa, pois apresenta características como elevada produção de biomassa com menor consumo de água e insumos (Xin e Wang, 2011). O sorgo sacarino foi avaliado para produção de etanol, butanol e um polímero de ácido lático com características biodegradáveis. A produção de etanol foi efetuada com a fração do caldo com elevadas concentrações iniciais de açúcares (300 g.L-1) sendo alcançadas eficiências de conversão de açúcares em etanol na ordem de 97% após 54 h de fermentação com Saccharomyces cerevisiae. O butanol foi produzido a partir do bagaço após hidrólise com ácido acético e fermentação com Clostridium acetobutylicum e o resíduos gerados após a hidrólise foram utilizados para produzir o polímero biodegradável (Yu et al., 2012). Em outra abordagem de utilização integral da biomassa de sorgo sacarino cultivar ME81, foram avaliadas as produções de etanol a partir dos grãos, folhas e bagaço. Os grãos, contendo 73,48% de amido, foram hidrolisados com α-amilase e amiloglucosidase durante 12 h e os hidrolisados fermentados com leveduras. O bagaço contendo 47,47% de celulose, 28% de hemicelulose e 19% de lignina e as folhas 42% celulose, 30% hemicelulose e 22% de lignina foram submetidas ao pré-tratamento com hidróxido de cálcio a 121 °C por 1h e hidrólise enzimática com celulases e β-glicosidase a 50°C e 200 rpm por 48h. Os hidrolisados foram submetidos à fermentação com leveduras durante 2dias. O caldo contendo 15 % m/v de açúcares simples (sacarose, glicose e frutose) também foi submetido à fermentação com leveduras nas mesmas condições descritas para os hidrolisados dos grãos e do bagaço. O balanço geral para a
42 produção de etanol a partir de 1 ton de biomassa de sorgo foi de 59 kg de etanol (Kim et al., 2012). Em recente revisão sobre o processamento da biomassa de sorgo sacarino para bioprodução de produtos de alto valor agregado, identificaram-se vários produtos que podem ser produzidos com as diferentes frações da biomassa, tais como forragem, silagem, energia na forma de vapor e papel a partir do bagaço e também produtos de fermentação como etanol, acetona, butanol, lipídeos, ácido láctico, hidrogênio e metano (Whitfield et al., 2012). Na região Nordeste do Brasil, ainda não foram implantados estudos que integrem as diferentes fases de produção de biomassa (agronômica) com processamento (engenharias, química) desta biomassa para a produção de biocombustíveis, energia e produtos de alta valor agregado, o que indica um alto nicho de aproveitamento desta biomassa. Usando dados de composição química da biomassa da cultivar IPA 467 com as equações propostas por Zhao et al. (2009) para caldo, grãos e bagaço juntamente com produtividade de biomassa por hectare, pode-se estimar um cenário de produção de etanol de 6730 L.ha-1.
43 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS A região litorânea do Nordeste do Brasil é uma área de tradição no cultivo de cana-de-açúcar para a produção de açúcar e etanol. Esta região abrange uma pequena fração da área total do Nordeste e em algumas partes o gradiente de precipitação se reduz e inviabiliza o cultivo desta cultura energética. É neste contexto que o cultivo do sorgo sacarino pode ser inserido como matéria-prima complementar com diversas oportunidades de produção de combustíveis, energia e produtos de alto valor agregado. Para o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino ainda são necessários vários esforços em diferentes áreas de pesquisa : 1) Melhoramento vegetal de cultivares de sorgo sacarino; 2) Melhora nas eficiências dos processos fermentativos a partir do caldo; 3) Viabilidade de produção de etanol a partir dos grãos de cultivares de sorgo sem interferir na oferta de alimentos; 4) Design de processos de pré-tratamentos, hidrólise enzimática ou ácida e fermentação de hidrolisados competitivos; 5) Integração das diferentes abordagens na produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino e aproveitamento dos seus resíduos para geração de energia e outros produtos; e 6) Levatamento dos custos de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino.
44 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, E. M., LIMA, G. F. C., SANTOS, M. V. F., CARVALHO, F. F. R., GUIM, A., MEDEIROS, H. R., BORGES, A. Q. Rendimento e composição químicobromatológica de fenos triturados de gramíneas tropicais. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, p.2226-2233, 2006. ALMODARES, A.; HADI, M.R. Production of bioethanol from sweet sorghum: A review. African Journal of Agricultural Research, v.4, p.772-780, 2009. BARCELOS, C.A. Aproveitamento das frações sacarínea, amilácea e lignocelulósica do sorgo sacarino [Sorghum bicolor (L.) Moench] para produção de bioetanol. Tese Doutorado Tecnologias de Processos Químicos e Bioquímicos, UFRJ, Rio de Janeiro, 334p, 2012. BARCELOS, C.A.; MAEDA, R.N.; BETANCUR, J.V.; PEREIRA JR, N. Ethanol production from sorghuns grains [Sorghum bicolor (L.) Moench]: evaluation of the enzymatic hydrolysis and the hydrolysate fermentability. Braziliam Journal of Chemical Engineering, v.28, p.597-604, 2011. BVOCHORA, J.M.; READ, J.S.; ZVAUYA, R. Application of very high gravity technology to the cofermentation of sweet stem sorghum juice and sorghum grain. Industrial Crops and Products, v.11, p.11-17, 2000. CARDOSO, W.S.; TARDIN, F.D.; TAVARES, G.P.; QUEIROZ, P.V.; MOTA, S.S.; KASUYA, M.C.M.; QUEIROZ, J.H. Use of sorghum straw (Sorghum bicolor) for second generation ethanol production: Pretreatment and enzymatic hydrolysis. Química Nova, v.36, p.623-627, 2013. CHEN, C.; BOLDOR, C.; AITA, G.; WALKER, M. Ethanol production from sorghum by a microwave-assited dilute ammonia pretreatment. Bioresource Technology, v.110, p.190-197, 2012. DAVILA-GOMEZ, F.J.; CHUCK-HERNANDEZ, C.; PEREZ-CARRILLO, E.; ROONEY, W.L.; SERNA-SALDIVAR, S.O. Evaluation of bioethanol production from five different varieties of sweet and forage sorghums (Sorghum bicolor (L) Moench). Industrial Crops and Products, v.33, p.611-616, 2011. DEESUTH, O.; LAOPAIBOON, P.; JAISIL, P.; LAOPAIBOON, L. Optimization of nitrogen and metal ions supplementation for very high gravity bioethanol fermentation from sweet sorghum juice using an ortogonal array design. Energies, v.5, p.3178-3197, 2012. DUTRA, E.D.; NETO, A.G.B.; SOUZA, R.B.; MORAIS JUNIOR, M.A.; TABOSA, J.N.; MENEZES, R.S.C. Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Brazil. Sugar Tech, v.15, p.316-321, 2013.
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50 CAPÍTULO II
APLICAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO NO PRÉTRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
51 APLICAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO NO PRÉTRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
RESUMO O pré-tratamento é uma etapa essencial para aumentar a eficiência da hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. Os métodos de pré-tratamento mais utilizados atualmente operam em elevadas temperaturas (180 – 240 °C) e pressões (0,69 – 4,9 MPa) e geram uma gama de inibidores de crescimento biológico, como furfural e hidroximetilfurfural (HMF). Com isso, intensificou-se a busca de novas abordagens de pré-tratamento efetivo que operem em temperatura e pressão ambiente e minimizem a geração de inibidores. Dentre estes métodos, o peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2 alcalino) vem ganhando espaço por ser efetivo para uma gama variada de biomassas lignocelulósicas, possibilitando valores elevados de eficiência de hidrólise enzimática. No entanto, é pouco discutido nas principais revisões publicadas na literatura. Logo, o objetivo deste trabalho foi investigar o uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) alcalino como agente de pré-tratamento com o propósito de melhorar a eficiência da hidrólise enzimática para diferentes tipos de biomassas e discutir sobre os pontos chave do prétratamento. Por fim, são discutidos os principais desafios deste método quanto à aplicação em larga escala. Palvras-chaves: Bioenergia, Biomassa Lignocelulósica, Pré-tratamento, Hidrólise Enzimática, Etanol Celulósico, Biorrefinarias.
52
ABSTRACT Pretreatment is an essential step to increase the efficiency of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The main pretreatment methods used currently operate at high temperatures (180 a 240 °C) and pressures (0.69 to 4.9 MPa) and generate a range of inhibitors of biological processes, such as furfural and hidroximethilfurfural. With this, there has been intensified the search for new effective pretreatment approaches that operate at ambient temperature and pressure and minimize the generation of inhibitors. Among these methods the alkaline hydrogen peroxide has been gaining space to be effective for a wide range of lignocellulosic biomasses, enabling high values of enzymatic hydrolysis efficiency. However, this methods is still poorly discussed in the main reviews found in the literature. Therefore, the aim of this work was to investigate the use of H2O2 alkaline for pretreatment with the purpose of improving the efficiency of enzymatic hydrolysis to different types of biomass and discuss about the key points of the pretreatment. Finally, we discuss the major challenges for the application of this method in large scale. Key words: Bioenergy, Lignocellulosic biomass, Pretreatment, Enzymatic Hydrolisys, Cellulosic Ethanol, Biorefinery.
53 1.
INTRODUÇÃO A diminuição da oferta de combustíveis fósseis em conjunto com os problemas
ambientais ocasionados pela queima destes materiais evidencia o desafio da sociedade moderna em desenvolver novas formas de geração de energia baseada em fontes renováveis. Dentre as fontes renováveis, a biomassa representa um elevado potencial, uma vez que é parte do ciclo do carbono na natureza e vem sendo utilizada pelo homem desde os primórdios da civilização, além de apresentar grande disponibilidade e baixo custo de aquisição (Cheng e Timilsina, 2011). O termo biomassa, do ponto de vista energético, compreende os materiais de origem orgânica como as florestas energéticas, resíduos orgânicos municipais, culturas agrícolas, resíduos das culturas agrícolas, etc. Até recentemente, a biomassa lignocelulósica era vista em muitos casos como uma matéria-prima sem valor e que deveria ser descartada, no entanto vários grupos de pesquisa no mundo estão aplicando esforços e recursos a fim de tornar economicamente viável o uso da biomassa para produção de biocombustíveis, energia e produtos químicos de alto valor agregado, através de rotas termoquímica e bioquímica (McKendry, 2002; Galbe e Zacchi, 2012). A rota bioquímica é uma das tecnologias mais utilizadas para a produção de biocombustíveis, com ênfase principal na produção de etanol e biogás. No entanto, devido à composição química da biomassa lignocelulósica torná-la altamente resistente a degradação biológica, sendo necessária uma etapa de pré-tratamento para facilitar a sua transformação em produtos energéticos. O objetivo principal de um pré-tratamento é desestruturar a matriz lignocelulósica e facilitar a separação dos polissacarídeos e da lignina, o que acarreta maior acessibilidade para etapa de hidrólise enzimática (Mosier et al., 2005). Existem vários tipos de pré-tratamento reportados na literatura, sendo classificados pelo método de ação em químicos, físicos, físico-químicos e biológicos (Sun e Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Alvira et al., 2010). Em geral, a escolha do pré-tratamento apresenta vantagens e desvantagens. Critérios para um pré-tratamento efetivo devem ser levados em consideração, uma vez que esta etapa é uma das mais onerosas para a produção de biocombustíveis a partir da biomassa. Produção de fibras de celulose reativas, baixa degradação da celulose e hemicelulose, não formação de possíveis inibidores do processo de hidrólise e fermentação, minimização da demanda de energia, redução dos custos de diminuição do tamanho das partículas, redução do custo de materiais para a construção de reatores de pré-tratamento, produção
54 minimizada de resíduos e baixo consumo de produtos químicos; são alguns dos requisitos desejados para a escolha de um pré-tratamento (Mohammad e Karimi, 2008). Dentre as várias opções de pré-tratamento disponíveis, a grande maioria necessita de grandes quantidades de energia e/ou altas pressões o que resulta em elevado custo de processo. Exemplos de pré-tratamentos efetivos que demandam elevado consumo de energia e/ou altas pressões: explosão a vapor (Ramos, 2003; 160 290°C, p = 0,69 - 4,85 MPa) e tratamento ácido (Sánchez e Cardona, 2008; 160 200°C). Pré-tratamentos efetivos que possam ser conduzidos em temperaturas e pressões ambientes tem sido foco de pesquisas nos últimos anos, o que pode ser mensurado pelo aumento do número de publicações de artigos com o uso de H2O2 alcalino (Figura 1).
Figura 1: Vista geral do crescimento de publicações com o uso do prétratamento H2O2 alcalino para diferentes tipos de biomassas lignocelulósica. Fonte: ISI web of knowledge termo de busca “Alkaline hydrogen peroxide pretreatment”.
No entanto, as principais revisões de métodos de pré-tratamento de biomassa lignocelulósica não reportam o uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) como prétratamento efetivo. Com isso, a presente revisão aborda a utilização do H2O2 alcalino como agente de pré-tratamento de biomassa visando melhorar a eficiência da hidrólise enzimática. Para o melhor entendimento, descreve-se brevemente a composição química da biomassa lignocelulósica e os aspectos relacionados à química do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. Também são descritas as principais variáveis que
55 influenciam o pré-tratamento com o H2O2 e consequentemente a sacarificação enzimática. É feita uma comparação entre o pré-tratamento com H2O2 alcalino e outros tipos de pré-tratamento. Adicionalmente, são discutidos os principais desafios para o uso em larga escala do H2O2 alcalino no pré-tratamento de biomassa lignocelulósica e apresentadas algumas considerações finais.
56 2. COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA E SEUS PRODUTOS DE HIDRÓLISE A
biomassa
lignocelulósica
é
composta
principalmente
de
celulose,
hemicelulose e lignina (Tabela 1), e pequenas frações de extrativos e cinzas. A celulose é um polissacarídeo homogêneo de cadeia longa mais abundante na natureza e representa aproximadamente 40% do peso seco da biomassa, formada por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1-4. Apresenta-se na forma cristalina com regiões amorfa, sendo a forma amorfa mais susceptível a hidrólise enzimática. A hidrólise da celulose acarreta a produção de glicose que é facilmente convertida pela maioria dos micro-organismos. A hemicelulose, o segundo polissacarídeo mais importante depois da celulose, é um polímero heterogêneo complexo, formado por unidades de açúcares de 5 e 6 carbonos. Em sua cadeia principal, é formada por xilose e suas ramificações podem conter L-arabinose, galactose e manose, além de ácidos urônicos e grupos acetilas. A hidrólise da hemicelulose produz principalmente xilose, um carboidrato de 5 carbonos que apenas alguns micro-organismos conseguem metabolizar. A lignina, depois da celulose, é o principal componente da parede celular de plantas e atua na estruturação da celulose e hemicelulose. É uma estrutura complexa e heterogênea formada principalmente por compostos fenólicos e seus derivados. Apresenta baixa biodegradabilidade e apenas alguns micro-organismos especializados são capazes de degradá-la, como os fungos da podridão branca e os fungos da podridão parda (Aguiar e Ferraz, 2011).
57
Tabela 1: Conteúdos de celulose, hemicelulose e lignina comumente reportados para as principais biomassas lignocelulósicas. Biomassa lignocelulósica
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Lignina (%)
46
27,8
10,7
Palha de milho
35-40
17-35
7-18
Palha de trigo
30
50
15
Palha de arroz
36-47
19-25
10-24
Casca de arroz
35,6
12
15,4
Bagaço de cana-de-açúcar
39,6
19,7
25,8
Bagaço de sorgo-sacarino
34
25
18
Palha de centeio
37,9
36,9
17,6
Palha de colza
44,6
20
20
Palha de cevada
34,4
23
13,3
Miscanthus
Fonte:Sun et al. (2000); Sun e Cheng, 2002; Saha e Cotta, 2007; Rabelo et al. (2008); Sipos et al.(2009); Saha e Cotta, 2010;Karagos et al. (2011); Wang et al. (2012).
58
3. ABORDAGEM SOBRE A QUÍMICA DO PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO O peróxido de hidrogênio é um metabólito natural, presente em muitos organismos, e participa de várias rotas biológicas, principalmente as envolvidas na decomposição de lignina por fungos possuidores de sistemas enzimáticos complexos (Aguiar e Ferraz, 2011).Também vem sendo utilizado há muitos anos na indústria de papel e celulose, como agente no processo de branqueamento e na área de tratamento de efluentes como reagente nos processos oxidativos avançados (POA) (Mattos et al., 2003). Por suas características altamente oxidantes, Gould (1985) investigou o uso do peróxido de hidrogênio para a melhora da disgestibilidade enzimática de resíduos agrícolas, bem como os mecanismos de atuação do H2O2. Pré-tratamento com H2O2 tem sido aplicado com sucesso para uma gama variada de biomassas lignocelulósicas com a intenção principal de melhorar o rendimento da hidrólise enzimática através da deslignificação. Rendimentos de hidrólise enzimática para diferentes biomassas podem ser observados na Tabela 2 e dependendo das condições avaliadas valores entre 67 a 95% são reportados.
59
Tabela 2: Eficiências de hidrólise enzimática reportados para diferentes tipos de biomassas pré-tratadas com H2O2 alcalino Referência
Biomassa lignocelulósica
Composição química (%)
Enzimas utilizadas
Carga de enzimas
Conversão de celulose (%)
Conversão da hemicelulose (%)
Sacarificação enzimática (%)
Gould (1985)
Palha de trigo
35,9 celulose
Celulase T.ressei
5 mg/mL
95
NR
NR
44,24 celulose
Celluclast
16 ml de cada enzima 100 g de biomassa
NR
NR
96,70
25,23 hemicelulose
Novozyme 188
4 mL/100 g de biomassa para cada enzima
67,38
81,10
74
Celulase T. ressei e βglicosidase de A. Níger
3,42 FPU/g biomassa pré-tratada e 1 UI βglicosidase/g de biomassa pré-tratada
69,4
NR
83,42
Celulases não especificada.
50 FPU/g de biomassa pré-tratada
NR
NR
95,70
Cellulases Micelase
20 FPU/ g biomassa pré-tratada
78,92
NR
74,84
44,8 hemicelulose Saha e Cotta (2006)
Palha de trigo
Viscostar 150L Saha e Cotta (2007)
Casca de arroz
35,62 celulose
Celluclast
11,96 hemicelulose
Novozyme 188 Viscostar 150L
Rabelo et al. (2008)
Bagaço de cana-deaçúcar
39,6 celulose 21,4 hemicelulose
Qi et al. (2009)
Palha de trigo
40,98 celulose 36,96 hemicelulose
Yamashita et al. (2010)
Bambu
45,5 celulose 22,8 hemicelulose
60 A utilização do H2O2 para pré-tratamento de biomassa lignocelulósica está fundamentada nas reações químicas que este agente oxidante sofre em meio líquido alcalino. A sua dissociação gera o ânion hidroperóxido (HOO-), através da Equação (1).
(1)
Em meio alcalino, o ânion hidroperóxido pode reagir com H2O2 que acarreta a formação do radical hidroxila e superóxido, conforme a Equação (2). +
(2)
Na ausência de outros reagentes os radicais hidroxila e superóxido podem combinar-se gerando oxigênio e água, Equação 3.
Logo, a equação geral de decomposição de H2O2 em meio alcalino pode ser resumida na Equação 4. (4) Para cada mol de H2O2 adicionado são gerados 0,5 mol de O2. No entanto, quando da presença de outros compostos que reagem com os radicais formados na equação 2, uma quantidade menor de O2 é produzida. Por outro lado, o peróxido de hidrogênio é instável em meio alcalino e rapidamente se decompõe, particularmente na presença de alguns metais de transição como manganês, ferro e o cobre, o que leva a geração de radicais hidroxilas (OH.) e superóxidos (
, através das reações 5, 6 e 7, que participam nas reações de
deslignificação (Sun et al., 2000).
61 Equação geral: M/M+
Apesar das duas rotas de decomposição possíveis para o peróxido de hidrogênio, dados experimentais evidenciaram a predominância da reação 2 na deslignificação de materiais lignocelulósicos (Gould, 1985). No trabalho de Karagoz et al. (2012), os autores utilizaram a adição de metais no pré-tratamento pode auxiliar para minimizar a degradação da celulose e maximizar a solubilização da lignina. Neste contexto, a biomassa de palha de colza foi submetida ao pré-tratamento com H2O2 em condições alcalina (2,5 % v/v H2O2, pH 11,5, 50 °C por 1h) com seis diferentes concentrações de MgSO4 (0; 0,25; 0,5; 1; 1,25 e 1,5 % m/v) sendo observado efeito na solubilização da lignina que variou de 22,83 para 65,66%, quando a concentração de MgSO4 aumentou de 0 para 0,25% m/v. Em contrapartida, concentrações acima de 0,25% de MgSO4 resultaram em decréscimos na solubilização da lignina. A lignina é provavelmente o maior sitio de ataque químico pelos radicais gerados na decomposição do H2O2 em meio alcalino. Apesar de micrografias eletrônicas indicarem mudanças nas características físicas e morfológicas nas fibras de celulose (Figura 2) com pequenas perdas de glicose < 5%, o restante da celulose na fração sólida é altamente susceptível a hidrólise enzimática com celulases.
Figura 2: Mudanças na morfologia da palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino (1% H2O2, pH 11,5, temperatura ambiente por 24 h): a) palha de trigo moída sem pré-tratamento (100x); b) palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino após secagem à 100 °C por 24 h (100x); c) palha de trigo pré-tratada com H2O2 desidratada em etanol e seca no ponto crítico (200x); e d,e) aumento da amostra vista na imagem c em dois cortes, as setas mostram a separação das fibras de celulose. Adaptado de Gould (1985).
62 4. PRINCIPAIS VARIÁVEIS QUE AFETAM O PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 Para que um pré-tratamento seja efetivo são necessárias investigações sobre a influência das principais variáveis que afetam o desempenho do pré-tratamento avaliado. Para o pré-tratamento com H2O2, as principais variáveis são: concentração de sólidos no reator, tempo de residência no reator, concentração de H2O2 do meio reacional, temperatura da reação de pré-tratamento e pH da reação. A seguir, são abordadas como cada uma destas variáveis afetam a reação de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica com H2O2. A concentração de sólidos no reator reflete a quantidade de massa a ser prétratada pelo volume ou massa da reação de pré-tratamento. Esta variável é largamente utilizada como fator determinante na melhora da eficiência de reações de prétratamento. Estudos iniciais com o uso do H2O2 alcalino foram conduzidos com baixas concentrações de sólidos totais, geralmente 2% obtendo elevadas eficiências de conversão de celulose em glicose (90%) (Gould, 1985 a,b). No entanto, em escala industrial maiores cargas de sólidos são desejáveis, uma vez que acarretam em menores custos de reatores e maiores recuperação do produto. O aumento na concentração de sólidos totais acarreta maiores liberações de açúcares, após digestão enzimática da biomassa pré-tratada, para as condições de estudo conduzidas por Banerjee et al. (2011) (Figura 3).
Figura 3: Influência da concentração de sólidos totais no pré-tratamento da palha de milho com peróxido de hidrogênio (24 h, 0,5 g H2O2/g biomassa) na eficiência de conversão de celulose em glicose. A biomassa pré-tratada foi neutralizada e diluída a 0,2 % glucana e digerida enzimaticamente com Accellerase 1000 (15 mg/g glucana) por 48h. Fonte: Adaptado: Banerjee et al. (2011). Ef: Eficiência de conversão e BL: carga de biomassa.
Concentrações entre 15% (Saha e Cota, 2007) e 40% (Gould et al., 1989) de sólidos totais no pré-tratamento com H2O2 alcalino de biomassas como palha de trigo e
63 cevada já foram reportadas na literatura com resultados satisfatórios na melhora da digestibilidade enzimática. O tempo de pré-tratamento, que é definido como o tempo de contato da biomassa lignocelulósica com o agente de pré-tratamento, vária bastante de acordo com o tipo de pré-tratamento utilizado, de alguns minutos (explosão a vapor) até horas (hidrólise alcalina) e dias (utilização de fungos). Para o pré-tratamento com H2O2 alcalino são reportados vários tempos de reações, em função das condições de operação e da biomassa pré-tratada. Para a biomassa de palha de trigo pré-tratada com 2,15% H2O2 (v/v) e teor de sólidos totais de 8,6% (m/v), 24°C e pH 11,5, o aumento de 3 h para 24 h na reação de pré-tratamento acarretou maiores liberações de açúcares totais (glicose+xilose+arabinose) após hidrólise enzimática (Saha e Cotta, 2006) (Figura 4).
Figura 4: Efeito do tempo de duração da reação de pré-tratamento com H2O2 alcalino (2,15% v/v H2O2, pH 11,5) na biomassa de palha de trigo (8,6 % m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 120 h). Fonte: Adaptado Saha e Cotta, 2006.
Para a biomassa de bagaço de cana-de-açúcar o tempo de reação de prétratamento não foi significativo na liberação de açúcares (glicose) em altas concentrações de H2O2, o que levou a condução de condições ótimas de pré-tratamento para o bagaço de cana em 7,35% v/v H2O2, 25 °C por 1h, com hidrólise enzimática realizada com celulases obtidas a partir de Tricoderma reesei (3,5 FPU. g biomassa seca pré-tratada-1) e β-glicosidase obtidas a partir de Aspergilus niger (1,0 CBU. g biomassa seca pré-tratada-1) nas condições de 50 °C e 100 rpm (Rabelo et al., 2011). A concentração de H2O2 em solução tem influência significativa na melhora da acessibilidade da biomassa a hidrólise enzimática. Pode variar fortemente de acordo com a biomassa avaliada, a depender principalmente da recalcitrância da matéria-prima.
64 Geralmente, os estudos apresentam variações da ordem de 1 - 10 % de H2O2 em solução. Em estudos com casca de arroz, um resíduo de grande disponibilidade em regiões produtoras deste cereal e de elevada complexidade devido principalmente ao elevado teor de cinzas, Saha e Cotta. (2007) investigaram a influência da concentração do H2O2 em solução para maximizar a liberação de açúcares após hidrólise enzimática com celulases, β-glicosidase e xilanases. O aumento da concentração de H2O2 (0 a 7,5% v/v) acarretou maiores liberações de açúcares da biomassa da casca de arroz. No entanto, com a concentração fixada em 10% houve redução na liberação de açúcares (Figura 5).
Figura 5: Efeito da concentração de H2O2 em solução para o pré-tratamento (pH 11,5, 35 °C, 24 h) da casca de arroz (15,0% m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 72 h, 0,4 mL de cada preparação enzimática. g de casca de arroz-1). Adaptado de Saha e Cotta, 2007.
A temperatura de pré-tratamento é uma variável que está diretamente relacionada com a demanda de energia do método de pré-tratamento, o que incide no custo do processo. Os métodos de pré-tratamentos utilizados em níveis de planta piloto e de demonstração consomem elevadas quantidades de energia, pois operam em temperaturas elevadas (180 - 250 °C). Estudos com H2O2 alcalino são realizados em condições amenas de temperatura (25 - 70 °C) e pressão. O efeito do aumento da temperatura no pré-tratamento com H2O2 varia de acordo com a biomassa lignocelulósica avaliada. Para a biomassa de palha de centeio, pré-tratada com 2% (m/v) H2O2, pH 11,5 e 12 h da reação, o aumento da temperatura acarretou maiores solubilizações de lignina e hemicelulose para a fração líquida (Tabela 3).
65 Tabela 3: Efeito da temperatura na solubilização de lignina e hemicelulose (% matéria seca) presentes na biomassa de palha de centeio pré-tratada com H2O2 (2%, pH 11,5 por 12 h). Adaptado: Sun et al. (2000). Fração da biomassa
Temperatura da reação de pré-tratamento (°C) 20
30
40
50
60
70
Lignina solubilizada (%)
52,7
75,7
81,8
83,1
85,8
87,8
Hemicelulose solubilizada (%)
44,2
52,5
70,0
70,0
71,3
71,9
Para a biomassa de bagaço de cana-de-açúcar, o aumento da temperatura não influenciou na maior liberação de açúcares redutores totais e glicose na hidrólise enzimática, sendo os melhores resultados na conversão de celulose em glicose (62,4%) obtidos com temperatura de 20 °C, 5% H2O2, 4% sólidos totais (m/v) por 6 h (Rabelo et al., 2008). A eficiência do pré-tratamento com H2O2 alcalino é fortemente dependente do pH do meio, pois está associado a geração do ânion hidroperóxido, conforme descrito na Equação 1. Estudos de Gould (1985) demonstraram que o valor ótimo de pH é de 11,5 (Figura 6).
Figura 6: Efeito do valor inicial do pH na reação de pré-tratamento da biomassa de kenaf (1% H2O2, 2% sólidos totais (m/v), 25 °C por 24 h). Adaptado: Gould, 1985. ED: Eficiência de deslignificação.
Estudos reportam o uso de H2O2 sem correção do pH do meio o que acarreta menores eficiências de liberação de açúcares durante a hidrólise enzimática. Em um estudo comparativo de pré-tratamentos químicos de biomassa de plantas aquáticas usadas na depuração de água, o pré-tratamento com H2O2 não foi efetivo para melhorar
66 a hidrólise enzimática (10 % m/v sólidos totais; 1% v/v H2O2; temperatura ambiente por 2 h). No entanto quando combinado com solução de NaOH foram obtidos os melhores resultados de hidrólise enzimática (1% m/v NaOH, temperatura ambiente por 12 h seguida da adição de 1% m/v H2O2, temperatura ambiente por 12 h) (Mishima et al., 2006). A análise conjunta das variáveis que afetam o pré-tratamento com H2O2 alcalino é de suma importância para descrever as condições ótimas para cada tipo de biomassa lignocelulósica avaliada e, dependendo do objetivo de aproveitamento dos açúcares liberados podem ser ajustadas e otimizadas.
67 5.
ESTUDOS
COMPARATIVOS
DE
PRÉ-TRATAMENTO
COM
H 2 O2
ALCALINO O tipo de pré-tratamento escolhido para melhorar a eficiência da hidrólise enzimática depende do tipo de biomassa disponível e do objetivo de utilização dos açucares liberados. Em estudo comparativo para produção de açúcares a partir da biomassa de palha de milho foram avaliados os pré-tratamentos com H2O2 (10% m/v sólidos totais, 0,5 g H2O2/g sólidos totais, temperatura ambiente por 24 h) e explosão com amônia (AFEX - 2:1 amônia/sólidos, conteúdo de umidade 200%, 150 °C e tempo de residência de 30 minutos). Os melhores resultados expressos pela liberação de glicose (95 ± 2,4% x 61,5 ± 1,5%) e xilose (75,1 ± 0,9% x 53,4 ± 2,1%) foram obtidos com o uso do H2O2 alcalino (Banerjee et al., 2011). Em outro estudo comparativo, caules de algodão foram submetidos a 4 tipos de pré-tratamentos; ácido sulfúrico (H2SO4), hidróxido de sódio (NaOH), peróxido de hidrogênio (H2O2) (10% m/v sólidos, 0,5; 1 e 2% m/v, 90 e 121 °C à 15 psi por 30, 60 e 90 minutos) e ozônio (4 °C por 30, 60 e 90 minutos com injeção continua de ozônio), para melhorar a hidrólise enzimática. Os sólidos pré-tratados foram submetidos à sacarificação enzimática com Celluclast 1.5L e Novozym 188 nas seguintes condições: 5% sólidos, pH 4,8, 50 °C, 150 rpm e 40 FPU/g celulose. Nestas condições o prétratamento com H2O2 não foi efetivo na conversão de glicose quando comparado ao prétratamento com NaOH (49,82 ± 1,40% x 60,79 ± 2,75%) mas apresentou melhor desempenho que o pré-tratamento com H2SO4 (49,82 ± 1,40% x 23,85 ± 1,21%). Cabe salientar que os autores não efetuaram a reação de pré-tratamento com H2O2 em pH ótimo (11,5), o que pode ter influenciado na baixa deslignificação observada (32,01% à 2%, 60 min., 121 °C à 15 psi) (Silvestein et al., 2007). A fim de investigar o uso do bagaço de sorgo sacarino para a produção de bioetanol, a biomassa foi submetida a 5 tipos de pré-tratamento, NaOH diluído com autoclavagem (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH autoclavado 121 °C por 60 min), NaOH concentrado (10% m/v sólidos totais, 20% m/v NaOH, temperatura ambiente por 2h), NaOH diluído com autoclavagem e imersão em H2O2 (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH, 121 °C por 60 min., após atingir temperatura ambiente adição de 5% w/v H2O2 por 24 h), H2O2 alcalino (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH por 2h, adição de 5% m/v H2O2, temperatura ambiente por 24 h); e autoclavagem (10% m/v sólidos totais, 121 °C por 60 min). Os resíduos sólidos dos diferentes pré-tratamentos, após lavagem com água, foram submetidos à hidrólise enzimática com Celluclast1.5 L e Novozymes
68 188, com carga enzimática de 20 FPU g sólidos-1 e 40 IU g sólidos-1 com carga de sólidos de 2%, pH 4,8, com agitação à 50 °C. Nas condições citadas, o melhor prétratamento foi a combinação de solução diluída de NaOH com imersão em H2O2 com resultado de 74,29 ± 0,81% de conversão de celulose (Cao et al., 2012). Além de palha de milho, caules de algodão e bagaço de sorgo sacarino, estudo com palha de cevada foi realizado com vistas a obter a melhor estratégia de sacarificação enzimática. A biomassa foi submetida a 3 tipos de pré-tratamentos, ácido diluído (10% m/v sólidos totais, 0,75% m/v H2SO4, 121 °C por 1h), lime (10% m/v sólidos totais, 1% m/v Ca(OH)2, 121 °C por 1h) e H2O2 alcalino (10% m/v sólidos totais, 2,5% m/v H2O2, pH 11,5, 250 rpm, 35 °C por 24h). A sacarificação enzimática do material pré-tratado foi realizada com enzimas comerciais, Celluclast 1.5L (celulase), Novozym 188 (β-glicosidase) e ViscoStar 150L (hemicelulase) com dose de 0,15 mL de cada enzima por g sólidos-1, pH 5,0, 45 °C por 120 h. Nas condições citadas no estudo, o melhor resultado de sacarificação enzimática foi obtido com o prétratamento com H2O2 alcalino (94% x 91% lime x 88% ácido diluído) (Saha e Cotta, 2010).
69 6. PRINCIPAIS DESAFIOS DO USO EM LARGA ESCALA DO H2O2 ALCALINO
PARA
PRÉ-TRATAMENTO
DE
BIOMASSA
LIGNOCELULÓSICA O uso do peróxido de hidrogênio em meio alcalino apresenta vantagens e desvantagens, assim como qualquer método de pré-tratamento. Dentre as principais vantagens estão o baixo consumo de energia, a não geração de inibidores (hidroximetilfurfural e furfural), a fácil disponibilidade de aquisição do H2O2 e do NaOH, a não necessidade de reatores especiais para a reação de pré-tratamento e compatibilidade com altas cargas de sólidos. Além disso, o uso do H2O2 alcalino acarreta condições de esterilidade para o processo de pré-tratamento e hidrólise enzimática, dispensando a necessidade do uso de antibióticos (Banerjeeet al., 2012). Como desvantagem, a salinidade gerada com correção do pH (uso de HCl) para a etapa de hidrólise enzimática, uma vez que as reações de pré-tratamento ocorrem no valor de pH ótimo de 11,5 e a hidrólise enzimática geralmente é conduzida em pH 4,8. Além disso, um dos principais entraves para o escalonamento do H2O2 está no preço deste reagente em conjunto com o NaOH. Estima-se que para processar 1 tonelada de biomassa de palha de milho, o custo envolvido seria de US$ 102-125 para reação de pré-tratamento com baixa concentração de H2O2 (0,125 g H2O2/g biomassa) somados à US$ 36 para NaOH ($ 300/t) (Banerjee et al., 2011). Uma das soluções para contornar o alto custo do H2O2 é usá-lo em concentrações reduzidas durante o prétratamento, o que geralmente acarreta em necessidade de controle do pH da reação. Outro desafio importante está na necessidade de moagem inicial da biomassa a ser pré-tratada com H2O2. É um fato que a diminuição do diâmetro da partícula aumenta a área superficial e melhora a eficiência de pré-tratamento e hidrólise enzimática. A maioria dos trabalhos citados nesta revisão usaram diâmetros de partículas reduzidos (0,5 - 3 mm) o que acarreta elevação dos custos do processo. No entanto, já foi reportado na literatura o uso do H2O2 alcalino para pré-tratamento biomassa de bagaço de cana-de-açúcar sem a necessidade do processo de moagem com resultados satisfatórios de hidrólise enzimática (Rabelo et al., 2008). Além disso, geralmente estudos experimentais são conduzidos com quantidades entre 1-10 g o que gera resultados elevados de eficiência de pré-tratamento e hidrólise enzimática. Quando se realiza o aumento de escala dos protocolos experimentais, nem sempre são atingidos os valores relatados na etapa de laboratório. Isto acontece principalmente pelas dificuldades de processo como transferência de massa e
70 dificuldade de agitação para o contato sólido-reagente. No entanto, em estudo recente realizado com biomassa de palha de milho, o aumento de escala foi realizado com sucesso. Em escala de laboratório, 1 g de palha de milho foi pré-tratada com 0,125 g H2O2 g sólidos-1 com controle de pH com eficiência de liberação de glicose de 73,8 ± 2,2%; e em escala de demonstração 1 kg de palha de milho foi pré-tratada em condições semelhantes com eficiência de liberação de glicose de 75% (Banerjee et al., 2011; Banerjee et al., 2012).
71 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino é comprovadamente eficiente para pré-tratar uma gama variada de biomassas, com resultados elevados de eficiência de hidrólise enzimática ao ser usado de forma isolada ou com combinação com outro método de pré-tratamento. Além disso, valores elevados de solubilizações de lignina e hemicelulose para a fração líquida credenciam fortemente este método de prétratamento em biorrefinarias.
72 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, A. e FERRAZ, A. Mecanismos envolvidos na biodegradação de materiais lignocelulósicos e aplicações tecnológicas correlatas. Química Nova, v.34, n.10, p.1729-1738, 2011. ALVIRA, P.; TOMÁS-PEJÓ, E.; BALLESTEROS, M.; NEGRO, M.J. Pretreatment Technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, v.101, n.13, p.4851-4861, 2010. BANERJEE, G.; CAR, S.; LIU, T.;WILLIAMS, D.L.; MEZA, S.L.; WALTON, J.D.; HODGE, D.B. Scale-up and integration of alkaline hydrogen peroxide pretreatment, enzymatic hydrolysis, and ethanolic fermentation. Biotechnology and Bioengineering, v.109, n.4, p.922-931, 2012. BANERJEE, G.; CAR, S.; SCOTT-CRAIG, J.; HODGE, D.B.; WALTON, J.D. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnology for Biofuels, v.4, n.16, p.1-15, 2011. CAO, W.; SUN, C.; LIU, R.; YIN, R.; WU, X. Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse. Bioresource Technology, v.111, s/n, p.215-221, 2012. CHENG, J.J.; e TIMILSINA, G.R. Status and barriers of advanced biofuel technologies: A review. Renewable Energy, v.36, n.12, p.3541-3549, 2011. GALBE, M.; e ZACCHI, G. Pretreatment: The key to efficient utilization of lignocellulosic materials. Biomass and Bioenergy, In press, 2012. GOULD, J.M. eFREER, S.N. High-efficiency ethanol production from lignocellulosic residues pretreated with alkaline H2O2. Biotechnology and Bioengineering, v. 26, n.6, p.628-631, 1984. GOULD, J.M. Enhanced polysaccharide recovery from agricultural residues and perennial grasses treated with alkaline hydrogen peroxide. Biotechnology and Bioengineering, v.27, n.6, p.893-896, 1985b. GOULD, J.M. Studies on the mechanism of alkaline peroxide delignification of agricultural residues.Biotechnology and Bioengineering, v.27, n.3, p.225-231, 1985a. GOULD, J.M.; JASBERG, B.K.; FAHEY, G.C.; BERGER, L.L. Treatment of wheat straw with alkaline hydrogen peroxide in modified extruder.Biotechnology and Bioengineering, v.33, n.2, p.233-236, 1989. KARAGOZ, P.; ROCHA, I.V.; OZKAN, M.; ANGELIDAKI, I. Alkaline peroxide pretreatment of rapeseed straw for enhancing bioethanol production by same vessel saccharification and co-fermentation. Bioresource Technology, v.104, s/n, p.349-357, 2012.
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75
CAPÍTULO III
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO COLMO DE DIFERENTES CULTIVARES DE SORGO SACARINO EM PERNAMBUCO, NORDESTE DO BRASIL
Artigo publicado. Sugar Tech, v.15, n.3, p.316-321, 2013. DOI 10.1007/s12355013-0240-y. Anexo 1
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PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO COLMO DE DIFERENTES CULTIVARES DE SORGO SACARINO EM PERNAMBUCO, NORDESTE DO BRASIL
RESUMO A disponibilidade das reservas e as questões ambientais evidenciam o declínio dos combustíveis fosseis no futuro. Os biocombustíveis apresentam-se como alternativa renovável para produção de combustíveis, com destaque para o etanol. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir da fermentação do caldo dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino, oriundos de experimento de avaliação de cultivares com potencial energético no município de Itambé, PE. Foram conduzidos experimentos de fermentações dos caldos, delineados inteiramente ao acaso com 8 tipos de caldos e 3 repetições, com levedura industrial Saccharomyces cerevisiae à 33 °C sob condição estática com tempo de 6h. Os resultados indicaram diferenças significativas entre as cultivares (p < 0,01) para todos os parâmetros avaliados, com destaque para a concentração de etanol e as altas produtividades volumétricas a partir da fermentação dos caldos das cultivares Willey (P = 64,77 ± 4,4 g.L-1 e Qp= 10,79 ± 0,74 g.L-1.h-1), Wray (P = 59,10 ± 1,7 g.L-1 e Qp = 9,85 ± 0,28 g.L-1.h-1) e BR 506 (P = 59,07 ± 1,3 g.L1 e Qp = 9,84 ± 0,21). No entanto, os maiores potenciais para produção de etanol por hectare foram observados para as cultivares SF 15 (3142,51 ± 428,47 L.EtooH.ha-1) e BR 506 (2193,95 ± 383,58 L.EtooH.ha-1). Palavras-chave: Fontes Renováveis, Biocombustíveis, Fermentação alcoólica, Culturas Energéticas.
77 ABSTRACT The decline in the use of fossil fuels in the future is evidenced by the availability of its reserves and related environmental issues. Biofuels are presented as a renewable alternative to fossil fuel production, including ethanol. However, ethanol production demands the use of agricultural land and other natural resources, with emphasis on water. The purpose of this study was to evaluate the potential of eight sweet sorghum cultivars in order to expand the ethanol production to areas with limited supply of water, not suitable for sugarcane without irrigation. The samples of cultivars produced by breeding programs in the state of Pernambuco, Brazil, were analyzed for fermentation by industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, at 33°C, under static conditions for a period of 6 hours. All assessed parameters showed some statistically significant differences among cultivars (p < 0.01), especially ethanol concentration (P) and the volumetric productivities (Qp) in the following order: Willey (P = 64.77 ± 4.4 g L-1 and Qp= 10.79 ± 0.74 g L-1h-1), Wray (P = 59.10 ± 1.7 g L-1 and Qp = 9.85 ± 0.28 g L-1h-1) and BR 506 (P = 59.07 ± 1.3 g L-1 and Qp = 9.84 ± 0.21 g L-1h-1). The highest potentials for ethanol yield per hectare were observed for the cultivars SF 15 (3142.51 ± 428.47 L ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 L ha-1). Therefore, the cultivar BR 506 seems to be very promising as an energy crop to be produced in areas with environmental conditions similar to Pernambuco.
Keywords: Renewable Sources; Biofuels; Alcoholic fermentation; Energy Crops.
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1. INTRODUÇÃO A magnitude do uso atual de combustíveis de origem fóssil tende a um declínio no futuro devido a diversos fatores, como a disponibilidade e facilidade de acesso as reservas existentes e, principalmente, devido aos efeitos da emissão de gases de efeito estufa sobre o meio ambiente. Neste contexto tem-se buscado cada vez mais o uso de fontes renováveis de energia, dentre elas as baseadas em bioenergia (energia proveniente de biomassas) incluindo-se o uso de culturas energéticas para a produção de biocombustíveis, como o biodiesel e etanol (Sánchez e Cardona, 2008). A produção de etanol vem crescendo, a cada ano, no mundo. O etanol pode ser produzido a partir de diferentes fontes de biomassa, como as culturas amiláceas (milho e grãos de cereais), sacarinas (cana-de-açúcar, beterraba sacarídea e o sorgo sacarino) e celulósicas (madeiras e resíduos das culturas) (Walker, 2011). No Brasil, a produção de etanol é proveniente principalmente da fermentação do caldo sacarino da cana-deaçúcar. Nos anos de 2009-2010, foram produzidos no Brasil aproximadamente 24 bilhões de litros de etanol, com estimativas de aumento para 37 bilhões entre 2012-2013 (Amorin et al., 2011). Porém a produção de etanol a partir da cana-de-açúcar tem limitações principalmente em áreas de precipitação reduzida, o que evidencia a necessidade de inserção de novas matérias-primas para produção de etanol a partir de culturas energéticas que possuam uma maior eficiência no uso de água, como o sorgo sacarino. O sorgo é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol, e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilokoglou et al., 2011). É uma gramínea C4, cultivada em vários países, e que apresenta um ciclo fotossintético eficiente. É originário da África sendo o quinto cereal mais cultivado no mundo. Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005) como complemento de ração animal e para obtenção de fibras (Murray et al., 2008). Suas principais características residem na eficiência no uso de água (1/3 da cana-de-açúcar e 1/2 do milho) e no bom desenvolvimento em diferentes tipos de clima e solos. Em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos e 50 t ha-1 de colmos, sendo o caldo presente no colmo, rico em sacarose, glicose e frutose, a parte de maior interesse para a produção de etanol de
79 primeira geração (Wu et al., 2010). A produção de etanol a partir da fermentação do caldo do sorgo situa-se em aproximadamente 3451 L.ha-1 (Prasad et al., 2007). No contexto da busca por novas matérias-primas para a produção de biocombustíveis, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir da fermentação do caldo extraído dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino, oriundos de experimento de avaliação de cultivares com potencial energético no município de Goiana, PE.
80 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Obtenção da biomassa de sorgo sacarino e caracterização dos caldos
Os colmos das diferentes cultivares de sorgo foram gentilmente cedidas pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) através de ensaio de campo para avaliação da produtividade de biomassa de cultivares de sorgo no município de Itambé, PE, localizado na Zona da Mata Norte de Pernambuco com precipitação média anual de aproximadamente 1600 mm e temperatura média ambiental de 25 °C. As cultivares avaliadas foram: IPA 467-4-2, Rio, Roma, Theys, Tale, Willey, Wray, BR 501, BR 506 e SF 15. A colheita foi realizada na fase de maturação dos grãos. A partir da biomassa colhida foram removidas as folhas e as panículas dos colmos a fim de proceder à extração do caldo à colmo limpo em sistema moenda simples de caldo de cana. Os diferentes caldos de sorgo foram caracterizados inicialmente quanto: (1) teor de °Brix usando refratômetro portátil modelo RT-30ATC da Instruterm com escala de 0 a 32 °Brix; (2) concentração de açúcares redutores totais (ART) pelo método do acido 3-5dinitrossalicílico (Miller, 1959); (3) teor
de nutrientes, após digestão sulfúrica
catalisada com peróxido de hidrogênio (Thomas et al., 1967): Nitrogênio total (Nt) pelo método Kiehldal, Fósforo total (Pt) por colorimetria e Potássio (K) por fotometria de chamas (Embrapa, 1999); e (4) pH em potenciômetro de bancada da marca Digimed. Posteriormente os caldos foram armazenados em freezer à -4 °C para posteriores ensaios de fermentações.
2.2 Ensaios de fermentação As fermentações foram conduzidas no sistema batelada simples em erlenmeyers de 500 mL de volume total sob temperatura controlada a 33 °C e em condição estática pelo período de 6 h. Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata dispostos em delineamento inteiramente casualizado. Nos erlenmeyers foram adicionados 100 mL de caldo de sorgo não esterilizado e inoculados com 10 % m/v (108 células.mL-1) de fermento industrial (leite puro) obtido junto a destilaria Japungú-PB com perfil predominante da linhagem de Saccharomyces cerevisiae - P1 (Silva-Filho et al., 2005)
81 Após as fermentações, os caldos fermentados foram centrifugado a 8000 rpm por 5 minutos e os sobrenadantes coletados e submetidos as análises analíticas. Nos caldos fermentados foram determinados açúcares redutores totais pelo método DNS (Miller, 1959) expresso em equivalente de glicose. O etanol produzido foi quantificado pelo método cromatográfico, utilizando-se um cromatógrafo gasoso modelo CG-90 com detector por ionização de chamas nas seguintes condições operacionais: 95 °C, 130 °C e 160 °C para as temperaturas da coluna, do injetor e do detector, respectivamente. O gás de arraste utilizado foi N2. A viabilidade celular foi determinada em câmara de Neubauer utilizando Azul de Metileno como discriminante de células. Os parâmetros cinéticos calculados nas fermentações foram: produtividade volumétrica de etanol (QP), rendimento de etanol (Yp,s) expresso em g de etanol.g-1 de açúcar consumido e eficiência de conversão de açúcares em etanol (ECA). Conforme as equações (1) e (2).
Onde P concentração de etanol (g.L-1), T tempo de fermentação (h) e 0,51 rendimento teórico máximo de etanol por consumo de 1g de glicose.
2.3 Produção de etanol calculada Com os resultados de açúcares redutores totais e eficiência de conversão dos açúcares em etanol foi determinada a produção teórica de etanol por hectare para cada cultivar de sorgo sacarino avaliada, de acordo com equação (3) proposta por (Zhao et al., 2009) com modificações no uso do valor da eficiência de conversão dos açúcares em etanol.
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Onde ART (açúcares redutores totais, %), biomassa fresca (produção de biomassa fresca para cultivar de sorgo sacarino, Mg.ha-1), 6,5 (conversão de açúcares em etanol), ECA (Eficiência de conversão dos açúcares em etanol); e 0,79 (densidade do etanol em g.mL-1).
2.4 Análises estatísticas O desenho experimental utilizado foi inteiramente casualizado e todas as determinações analíticas foram realizadas em triplicata. Os resultados obtidos para °Brix, teores de Nt, P e K, concentração de ART inicial, pH inicial e final, etanol, produtividade volumétrica, rendimento, eficiência de conversão de açúcares em etanol e produção teórica de etanol por hectare foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as medias foram comparadas pelo teste de Tukey a um nível de significância de p ≤ 0,05 usando o Software ASSISTAT (Silva e Azevedo, 2002).
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3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Caracterização química dos caldos
Os resultados para ART, °Brix, Nt, P, K e pH estão expressos na tabela 1. A ANOVA indicou diferenças significativas (p < 0,01) entra as cultivares avaliadas para todas as variáveis de caracterização química dos caldos. Os caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 apresentaram os caldos com maiores °Brix e ART (Tabela 1). A produção de etanol a partir da fermentação submersa de caldos sacarinos está diretamente relacionada com a concentração de ART, ou seja, ate certo limite caldos com maiores concentrações de ART e °Brix acarretam maiores concentrações de etanol pelas leveduras. Acima de 270 g.L-1 fermentação em alta grávida com grande possibilidade de inibição pelo substrato e elevado estresse oxidativo (Thomas et al., 1999).
Tabela 1: Caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino obtidas de experimento de campo no município de Goiana – PE. °Brix
ART (g.100mL-1)
Nt (ppm)
IPA 467
13,0 ± 0,2 e1
10,59 ± 0,6 c
591,3 ± 70,4 c
Rio
12,7 ± 0,12 e
12,10 ± 0,7 bc
Tale
10,8 ± 0,2 f
Willey
Cultivares
P (ppm)
K (ppm)
pH
54,4 ± 1,7 b
2808,7 ± 126,8 de
5,14 ± 0,01 c
641,1 ± 52 bc
32,4 ± 1,1 f
4356 ± 425,5 b
4,73 ± 0,02 e
10,47 ± 0,5 c
595,9 ± 36,5 c
48,5 ± 1,6 c
2390,7 ± 386 ef
5,26 ± 0,02 b
18,27 ± 0,12 a
17,28 ± 1,4 a
295,5 ± 62,2 d
37,2 ± 1,9 e
5729,2 ± 292,7 a
5,10 ± 0,02 c
Wray
16,3 ± 0,12 c
15,82 ± 0,4 a
737,9 ± 26,6 b
43,7 ± 0,9 d
3325,8 ± 111 cd
4,60 ± 0,02 f
BR 501
9,7 ± 0,12 g
6,39 ± 0,5 d
971,7 ± 50,5 a
24,5 ± 2,1 g
5879,6 ± 556,4 a
4,96 ± 0,02 d
BR 506
17,0 ± b
16,48 ± 0,4 a
727,1 ± 15,8 bc
54,2 ± 0,6 b
3726,3 ± 200,5 bc
5,11 ± 0,01 c
SF 15
13,6 ± d
13,34 ± 0,5 b
916,4 ± 54,4 a
84,2 ± 1,8 a
1726,6 ± 168,6 f
5,41 ± 0,02 a
Média geral
13,9
12,81
681,2
47,4
3742,9
5,1
CV (%)
1,2
5,5
7,2
3,3
8,6
0,3
n=3 ± desvio padrão 1: Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
O °Brix é uma análise rotineira nas empresas que produzem açúcar e etanol, e possibilita leitura direta no campo dos teores de açúcares nos caldos. Esta variável
84 expressa à concentração de sólidos solúveis no caldo em g.100 mL-1 que devem ser correlacionados com os teores de açúcares redutores totais. Para as condições experimentais estudadas o aumento do °Brix nos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino acarretou aumento linear (R2=0,895) nos teores de ART (Figura 1). Outros estudos de fermentação de caldos de sorgo sacarino demonstraram correlação linear entre a concentração de ART e °Brix (Guigou et al., 2011 - R2 = 0,960 e Tsuchihaschi e Goto, 2004 - R2 = 0,807).
Figura 1: Correlação entre o °Brix e os teores de açúcares redutores totais (ART) para os caldos das cultivares de sorgo sacarino.
Além da concentração de açúcares no caldo, a quantificação dos teores de nutrientes e do pH são essenciais para monitorar a qualidade da matéria-prima no processo de fermentação. Foram observados elevados teores de Nt, P e K no caldo de todas as cultivares (Tabela1). Os teores de nutrientes nos caldos são influenciados pelo tipo de solo, manejo das culturas e pela capacidade de cada cultivar em absorver os nutrientes do solo. O pH é uma variável de extrema relevância no processo fermentativo, uma vez que controla a dissolução dos nutrientes, atividade enzimática e impede a proliferação de micro-organismos contaminantes da fermentação alcoólica (Lima et al., 2002). Os resultados do pH inicial dos caldos das 8 cultivares avaliadas foi de 5,04 (4,60 – 5,41) o que determina um valor adequado para a fermentação com leveduras (pH 5,0 – 6,5). Resultados semelhantes para os valores de pH foram observados para cultivar Dale - 5,4 (Dimple et al., 2010) e para cultivares sacarinas e
85 forrageiras, 4,56 (Davila-Gomes et al., 2011). Para todas as fermentações houve reduções nos valores de pH (dados não apresentados), que podem estar relacionadas com a produção de ácidos orgânicos no metabolismo dos açúcares pelas leveduras (Bai et al., 2008). 3.2 Fermentação alcoólica dos caldos e produção de etanol por hectare Os resultados para os parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino estão apresentados na tabela 2. A ANOVA para as concentrações de etanol (P) evidenciaram diferenças significativas (p < 0,01) entre as cultivares, com destaque para as cultivares Willey, Wray e BR 506. As maiores concentrações de etanol obtidas durante a fermentação dos caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 podem ser explicadas pela elevada concentração de ART inicial, uma vez que os dados experimentais demonstraram correlação linear (R2=0,893) entre as concentrações de açúcares redutores totais iniciais e a concentração de etanol (Figura 2). Para o conjunto dos dados experimentais, a media geral da concentração de etanol para a fermentação dos diferentes caldos foi de 50,06 g.L-1 (30,6 – 69,8 g.L-1) resultado inferior ao observado no estudo realizado por Laopaiboon et al. (2007) na fermentação do caldo de sorgo sacarino variedade Keller, com valor médio de P = 89,47 g.L-1. Esta diferença pode ser explicada pela maior concentração de sólidos solúveis, pela suplementação de nutrientes e pelo maior tempo de fermentação (media de 48 h).
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Tabela 2: Parâmetros cinéticos na fermentação estática de diferentes caldos de cultivares de sorgo sacarino utilizando fermento industrial (leite puro) obtida na destilaria Japungú, PB à 33 °C. P (g.L-1)
Qp(g.L-1.h-1)
Yp/s
IPA 467
52,10 ± 0,7 cd
8,68 ± 0,12 cd1
0,49 ± 0,03 a
Rio
50,83 ± 3,6 cd
8,47 ± 0,59 cd
0,42 ± 0,04 bc
Tale
45,60 ± 2,3 d
7,60 ± 0,38 d
0,44 ± 0,02 abc
Willey
64,77 ± 4,4 a
10,79 ± 0,74 a
0,44 ± 0,01 abc
Wray
59,10 ± 1,7 ab
9,85 ± 0,28 ab
0,38 ± 0,02 c
BR 501
31,00 ± 0,4 e
5,16 ± 0,07 e
0,49 ± 0,04 ab
BR 506
59,07 ± 1,3 ab
9,84 ± 0,21 ab
0,40 ± 0,01 c
SF 15
54,40 ± 0,4 bc
9,07 ± 0,06 bc
0,42 ± 0,02 de
Media Geral
52,10
8,68
0,43
CV(%)
4,42
4,42
5,83
Cultivares
*valores para n=3 ± desvio padrão. ART: Açucares redutores totais; P: Concentração de etanol; Q p: Produtividade volumétrica de etanol; Yp/s: rendimento de etanol por grama de açúcar consumido: Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
87
Figura 2: Correlação entre os teores de açúcares redutores totais (ART) e as concentrações de etanol nos caldos fermentados das cultivares de sorgo sacarino.
De forma semelhante à concentração de etanol, os resultados da ANOVA para a produtividade volumétrica de etanol (Qp) apresentaram diferenças significativas (p < 0,01) entre as cultivares, sendo as maiores Qp observadas para as variedades Willey, Wray e BR 506. A Qp está diretamente relacionada com a concentração de etanol e o tempo de fermentação e representa um parâmetro cinético de suma importância para a viabilidade comercial da fermentação alcoólica. Neste sentido, a produtividade volumétrica média para o conjunto dos dados experimentais obtidos nas fermentações, de 8,34 g.L-1.h-1 está acima dos principais valores para a fermentação de caldo de sorgo sacarino encontrados na literatura (Khongsay et al., 2010 - 1,92 g.L-1.h-1 e Ratnavathi et al., 2010 - 1,16 g.L-1.h-1]. Esta diferença pode ser explicada pelos elevados tempos de fermentação conduzidos nos estudos citados, entre 36 e 60 h. Os resultados ANOVA para o rendimento (Yp/s) e para a eficiência de conversão de açúcares em etanol (ECA) foram semelhantes, com destaque para as cultivares IPA 467 e BR 501. Os melhores resultados para estas cultivares podem estar relacionados com os reduzidos teores de etanol observados na fermentação dos caldos, pois o etanol pode agir como inibidor do processo fermentativo (Walker, 2004). Para o conjunto de dados experimentais os valores médios de Yp/s e ECA, 0,46 g.g-1 e 89,0 %, estão de acordo com os principais resultados encontrados na literatura para a fermentação de caldo de sorgo sacarino (0,35 – 0,48 g.g-1 e 68 – 94 %) (Guigou et al., 2011); e (92,45
88 %) (Wu et al., 2010), o que demonstra a fermentabilidade dos caldos das cultivares avaliadas. Os resultados para a produção teórica de etanol por hectare estão expressos na tabela 3. A ANOVA indicou diferenças significativas entre as cultivares de sorgo sacarino avaliadas (p < 0,01). Os maiores valores foram obtidos para as cultivares SF 15 (3142,51 ± 428,47 L.ha-1) e BR 506 (2193,95 ± 383,58 L.ha-1), influenciados pela elevada produção de biomassa verificados para as duas cultivares. De uma forma geral foram observados baixos valores de produção teórica de etanol por hectare (média geral = 1741,92), o que denota a necessidade de melhoramento das práticas de cultivo do sorgo sacarino sob as condições ambientais avaliadas (Khongsay et al., 2010) e aumento da eficiência de conversão dos açúcares em etanol. Em estudo conduzido por Zhao et al. (2009) em condições ambientais diferentes e com cultivares diferentes foram estimados valores de 4729 L.ha-1 média para dois anos de cultivo. Tabela 3: Produção teórica de etanol por hectare para as cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Goiana, PE. Mg.ha-1
ECA (%)
L.EtooH.ha-1
IPA 467
26,77 ± 9,88
97,17 ± 5,40 a
1917,29 ± 825,43 bc
Rio
11,97 ± 2,20
82,95 ± 7,53 bc
948,56 ± 121,84 cd
Tale
17,57 ± 2,39
86,57 ± 1,71 abc
1305,39 ± 174,76 bcd
Willey
13,72 ± 1,71
86,60 ± 2,03 abc
1681,21 ± 154,44 bcd
Wray
22,17 ± 2,67
74,05 ± 4,02 c
2065,54 ± 224 b
BR 501
13,56 ± 0,20
96,34 7,78 a
680,95 ± 16,30 d
BR 506
20,01 ± 2,88
79,38 ± 0,72 c
2193,95 ± 383,58 ab
SF 15
35,44 ± 4,98
81,67 ± 3,35 c
3142,51 ± 428,47 a
Média geral
20,15
85,59
1741,92
CV (%)
-----
5,64
21,59
Cultivares
*valores para n=3 ± desvio padrão. ECA: Eficiência de conversão de açúcares em etanol, L.EtooH.ha -1: Calculado de acordo com a equação = ART(%) x Biomassa fresca (Mg.ha-1) x 6,5 x ECA x (1/0,79). Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
89
4. CONCLUSÕES Os caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 apresentaram as maiores concentrações de açúcares redutores totais iniciais e as maiores concentrações de etanol nos caldos fermentados. No entanto, os maiores potenciais para produção de etanol por unidade de área foram observados para as cultivares SF 15 e BR 506.
90 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMODARES, A.; E HADI, M.R. Production of bioethanol from sweet sorghum: A review, African Journal of Agricultural Research, V.4, p.772-780, 2009. AMORIM, H. V.; BASSO, L. V.; LOPES, M. L.; Sugar cana juice and molasses, beet molasses and sweet sorghum: composition and usage. In: The alcohol textbook, 5th edition, Org: INGLEDEW, W.M.; AUSTIN, G.D.; KLUHSPIES, C.; KELSALL, D.R. Nottingham University press: Nottingham, 2009, pp.39-46. BAI, F. W.; ANDERSON, W. A.; MOO-YONG, M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks, Biotechnology Advances, V.26, p. 89-105, 2008. DAVILA-GOMES, F. J.; CHUCK-HERNANDEZ, C.; PEREZ-CARRILLO, E.; ROONEY, W. L.; SERNA-SALDIVAR, S. O. Evaluation of bioethanol production from five different varieties of sweet and forage sorghums (Sorghum bicolor (L) Moench), Industrail Crops and Products, V.33, p.611-616, 2011. DIMPLE, K. K.; BELLMER, D. D.; HUNKE, R. L.; WILKINS, M. R.; CLAYPOOL, P. L. Influence of temperature, pH and yeast on in-field production of ethanol from unsterilized sweet sorghum juice, Biomass and Bioenergy, V.34, p.1481-1486, 2010. EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Informática Agropecuária. “Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes”, 1°Ed, Brasília, 1999, pp.370. GUIGOU, M.; PÉREZ, L. V.; LAREO, C.; LLUBERAS, M. E.; VÁZQUEZ, D.; FERRARI, M. D. Bioethanol production from three sweet sorghum varieties: evaluation of post-harvest treatment on sugar extraction and fermentation, Biomass and Bioenergy, V.35, p. 3058-3062, 2011. KHONGSAY, N.; LAOPAIBOON, L.; LAOPAIBOON, P. Growth and batch ethanol fermentation of Saccharomyces cerevisiae on sweet sorghum stem juice under normal and very high gravity conditions, Biotechnology, V.9, p. 9-16, 2010. LAOPAIBOON, L.; THANONKEO, P.; JAISIL, P.; LAOPAIBOON, P. Ethanol production from sweet sorghum juice in batch and fed-batch fermentations by Saccharomyces cerevisiae, World Journal Microbiology Biotechnology, V.23, p. 1497-1501, 2007.
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93
CAPÍTULO IV
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO E DO BAGAÇO PARA CINCO CULTIVARES DE SORGO SACARINO
94
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO E DO BAGAÇO PARA CINCO CULTIVARES DE SORGO SACARINO
RESUMO O uso da biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol está aumentando no mundo. No Nordeste do Brasil, o Instituto de Pesquisas Agronômicas (IPA) desenvolveu cultivares com aptidão para produção de forragem e energia. No entanto, ainda são escassas as informações sobre a performance destas cultivares para a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. Com isso, o objetivo deste trabalho foi inicialmente identificar a influência da fase de colheita dos colmos de 5 cultivares de sorgo sacarino na produção de açúcares sob condiçoes de sequeiro em Itambé, PE. Posteriormente foi avaliada a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço para as diferentes cultivares. O experimento em campo foi conduzido em arranjo fatorial com dois fatores, 5 cultivares x 3 épocas de colheita, com quatro repetições. Os experimentos de fermentação, pré-tratamento e hidrólise enzimática foram delineados inteiramente ao acaso, em quadruplicata. Os dados de todas as variáveis avaliadas foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5% probabilidade). Os resultados indicaram influência da fase de colheita sobre o teor de sólidos solúveis totais, sendo a fase de colheita de grão leitoso/pastoso escolhida para as avaliações de produção de etanol de primeira e segunda geração. A produção de etanol a partir do caldo foi influenciada pela cultivar avaliada com maior produção pela cultivar SF 15. Diferenças significativas foram observadas para a composição química dos bagaços da cultivares, mas sem diferença nas eficiências de hidrólise enzimática que em média apresentou 64,87% de conversão de celulose em glicose. A biomassa de cultivares de sorgo sacarino desenvolvidas e adaptadas para a região Nordeste do Brasil apresentam potencial para produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. Palavras Chave: Bioenergia, Culturas energéticas, Biocombustíveis, Zona da Mata de Pernambuco.
95 ABSTRACT The use of sweet sorghum biomass as feedstock for ethanol production has been increasing in the world. In Northeastern Brazil, the Agricultural Research Institute of Pernambuco (IPA) developed cultivars that are suitable to be used as forage for animal feeding or as energy source. However, information on the performance of sugar and ethanol production from the juice and bagasse of these cultivars is still scarce. Hence, in this study we aimed to identify how the harvest period of the stems from 5 sweet sorghum cultivars influences the production of sugar and ethanol under rainfed conditions in the municipality of Itambé, state of Pernambuco. Subsequently we evaluated the ethanol production from juice and bagasse of the different cultivars. The field experiment was evaluated in a factorial arrangement with two factors (5 cultivars and 3 harvest periods) and fours replications. The fermentation experiments, pretreatment and enzymatic hydrolysis were delineated in a completely randomized design in quadruplicate. Data obtained for all variables evaluated were submitted to an Analysis of Variance and the means compared by the Tukey test at 5% of probability. Results showed that the harvest period influenced the total soluble solids, and the harvest period of milk grain was chosen for assessments of ethanol production of first and second generation. Ethanol production from juice differed among cultivars with the best performance by cultivar SF 15. Significant differences were observed for the chemical composition of bagasses between cultivars, but there where no difference in efficiencies of enzymatic hydrolysis. The average conversion of cellulose in glucose was 64.87%. The cultivars of sweet sorghum biomass developed and adapted for the Northeastern region of Brazil showed potential for ethanol production from the juice and bagasse. Keywords: Bioenergy, Energy crops, Biofuels, Forest zone of Pernambuco.
96
1.
INTRODUÇÃO A fim de mitigar os efeitos ambientais do uso de combustíveis fósseis no setor
de transporte, crescem no mundo as iniciativas para inclusão dos biocombustíveis na matriz energética, principalmente o etanol. Atualmente são produzidos no mundo cerca de 100 bilhões de litros de etanol, sendo os principais produtores os EUA e o Brasil (Walker, 2011). O etanol pode ser produzido a partir de diferentes tipos de biomassa, com destaque principal para culturas sacarinas (cana-de-açúcar e beterraba sacarina) e amiláceas (milho e trigo). Além disso, esforços de pesquisa estão concentrados para viabilizar a produção a partir da biomassa lignocelulósica (Sánchez e Cardona, 2008). Com o objetivo de aumentar a produção de etanol, culturas energéticas avaliadas em décadas passadas voltaram a despertar interesse de pesquisadores em diversos países como EUA (Han et al., 2012), India (Vinutha et al., 2014), China (Gnansounou et al., 2005) e no Brasil (EMBRAPA, 2011). Dentre as culturas energéticas, o sorgo sacarino vem ganhando destaque para produção de etanol, pois apresenta possibilidade de aproveitamento integral da biomassa que geralmente contém 37% de caldo, 8% de grãos, 36% de bagaço e 19% de folhas (Kim et al., 2012). O sorgo é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilakoglou et al., 2011). É uma gramínea com ciclo fotossintético C4, cultivada em vários países, e que apresenta alta eficiência na transformação do CO2 em açúcares via fotossintese. É originário da África, sendo o quinto cereal mais cultivado no mundo. Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005), como complemento de ração animal e para obtenção de fibras (Murray et al., 2008). Suas principais características residem na eficiência no uso de água e no bom desenvolvimento em diferentes tipos de clima e solos (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). Sua produtividade é bastante variável e depende das condições de cultivo e das condições ambientais, mas em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos e 50 t ha-1 de colmos, sendo o caldo presente no colmo, rico em sacarose, glicose e frutose, a parte de maior interesse para a produção de etanol de primeira geração (Wu et al., 2010). A produção de etanol a partir da fermentação do caldo do sorgo situa-se em aproximadamente 3451 L ha-1(Prasad et al., 2007), mas pode variar fortemente em função da região de cultivo e da cultivar avaliada (Teetor et al., 2010).
97 Grande parte das informações sobre o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino para a produção de etanol diz respeito às cultivares desenvolvidas em países como EUA, China e Índia. No Brasil, apesar dos esforços da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), ainda são poucas as cultivares desenvolvidas para as diferentes condições edafoclimáticas e faltam informações sobre a real produção de etanol para cada cultivar. Em trabalho anterior (Dutra et al., 2013), foi demonstrado o potencial de algumas cultivares de sorgo sacarino, colhidas na fase de maturação, em Pernambuco com valores teóricos de etanol por hactare entre 681 e 3142 L a partir da fração caldo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi inicialmente avaliar a melhor fase de colheita dos colmos e posteriormente a
produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de
diferentes cultivares com histórico de produção na região Nordeste do Brasil.
98
2.
MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Experimento de campo Um experimento de campo foi conduzido, em 2011, na estação experimental do
Instituto Agronômico de Pernambuco (07º24' S e 35º06' W Gr), em Itambé, Zona da Mata Norte de Pernambuco, para avaliar o desempenho agronômico das cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502. A área apresenta precipitação média anual de 1200 mm e temperatura média anual de 25°C. O solo na área experimental foi caracterizado como franco argilo-arenoso, contendo 577, 102, 321 g.kg-1 de areia, silte e argila, respectivamente. Aproximadamente 30 dias do plantio foram aplicados 1,5 Mg.ha-1 de calcário. Também foi realizada uma adubação de fundação aplicando 777 kg.ha-1 da formulação N (Uréia), P (Superfosfato simples) e K (Cloreto de potássio) 9090-60. Um mês após o plantio foi realizada uma adubação de cobertura aplicando 60 kgN.ha-1 na forma de uréia. A colheita dos colmos foi realizada em três fases de desenvolvimento da planta, emborrachamento (FC1), grão leitoso/pastoso (FC2) e grão duro ou maturidade (FC3). A partir da colheita de 10 plantas, cortadas rente ao chão, foram removidas as folhas e panículas a fim de realizar a extração do caldo, a colmo limpo, em sistema de moenda de caldo de cana, sendo cada amostra de colmo passada três vezes pelos rolos. A identificação da melhor época de colheita permitiu efetuar determinações de produção de etanol no ponto ótimo. 2.2 Caracterização dos caldos das cultivares Após a extração e filtração, os caldos foram caracterizados quanto aos teores de sólidos solúveis totais (SST) °Brix, usando refratômetro portátil Instruterm modelo RT30ATC, com escala de 0 a 32 °Brix, e as concentrações de açúcares totais (AT), determinados pela soma dos teores de sacarose, glicose e frutose por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando coluna cromatográfica AminexHPX 87H (300 x 7,8mm, Bio-Rad) a 50° C; fase móvel H2SO4 5mM numa vazão de 0,6mL/min; empregando o detector índice de refração (RI). Nos caldos das cultivares também foram quantificados os teores de nitrogênio (FAN- free amino nitrogen) pelo método da ninidrina e de nutrientes após digestão com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio
99 (Thomas
et
al.,
1967).
Nos
extratos
gerados
foram
determinados
Ptotal
(espectrofotometria) e K (fotometria de chamas). 2.3
Caracterização dos bagaços das cultivares
A caracterização das amostras de bagaço oriunda da etapa de extração dos caldos foi realizada de acordo com a metodologia de Van Soest (1963), para quantificação dos teores de FDN, FDA, carboidratos (celulose e hemicelulose) e lignina detergente ácido. A umidade foi determinada com o uso de balança analítica de infravermelho e cinzas pelo método gravimétrico, após calcinação em mufla a 600°C por 2h. 2.4 Fermentações dos caldos As fermentações foram conduzidas no sistema batelada simples em erlenmeyers de 250 mL de volume total sob temperatura controlada a 33 °C e em condição estática pelo período de 6 h. Todos os ensaios foram conduzidos em quadruplicata dispostos em delineamento inteiramente casualizado. Nos erlenmeyers foram adicionados 100 mL do caldo de sorgo esterilizado e inoculados com 10 % (m/v) de inóculo de leveduras Saccharomyces cerevisiae JP-1, previamente crescidas em meio YPD (20 g.L-1 glicose, 10 g.L-1 peptona e 10 g.L-1 extrato de levedura). No inóculo foi determinada a viabilidade celular e a concentração inicial de células pelo método de contagem, após coloração com azul de metileno, em câmara de Neubauer. Nos ensaios de fermentação dos caldos foram removidas alíquotas no tempo 0 h e após 6 h, para determinação dos açúcares consumidos e dos produtos da fermentação, como etanol e glicerol. Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: açúcares consumidos (Ac), produtividade volumétrica de etanol (Qp) e rendimento de conversão de açúcares (sacarose, glicose e frutose) em etanol (Yp/s), conforme as equações 1 e 2. -
-
(1) (2)
Onde: Qp: produtividade volumétrica; P: etanol produzido; T: tempo de fermentação; Yp/s: rendimento de etanol por açúcar consumido; e Ac: açúcar consumido.
100 2.5 Pré-tratamento e hidrólise enzimática dos bagaços O pré-tratamento foi conduzido em erlenmeyers de 250 mL de volume total, onde foram adicionados os bagaços de sorgo na razão de 4% de sólidos totais sólidolíquido com a solução de peróxido de hidrogênio em concentração de 7,5 % m/v em 100 mL de água. O ajuste do pH foi realizado com solução de NaOH 5M até o valor de 11,5. Os erlenmeyers foram incubados em mesa agitadora orbital com agitação de 150 rpm a 25 °C por 1 h. Após o termino da reação, as duas frações oriundas do pré-tratamento foram separadas em fração líquida e sólida através de filtração, nesta etapa foi possível quantificar a perda de massa na reação (Equação 3). A fração sólida foi lavada com 1,5 L de água destilada com o intuito de remover sólidos solúveis em água. A fração sólida previamente lavada e seca em estufa de circulação de ar a 45 °C foi submetida à hidrólise enzimática usando enzima comercial FibreZymeTM LDI na dose de 10 FPU.g1
de biomassa seca, sem complementação com β-glicosidades. As condições de hidrólise
foram: carga de sólidos totais de 20 g.L-1, pH 4,8 com uso de tampão citrato de sódio 0,05 M, agitação 100 rpm, temperatura de 50 °C com tempo de 48 h. Após 48 h foram removidas alíquotas para determinação da glicose liberada através de KIT enzimático glicose oxidase e açúcares redutores totais (Miller, 1965). A atividade da celulase foi quantificada em unidades de papel filtro, conforme metodologia proposta por Ghose (1987). A atividade de β-glicosidase foi determinada em base de solução de celobiose e expressa em unidades por mL, de acordo com Wood e Bhat (1988). Também foram quantificadas as atividades de xilanase, CMCase e avicelase. A eficiência da hidrólise enzimática foi expressa de acordo com a Equação 4 (Cao et al., 2012). (3) Onde PM: perda de massa; Mi: massa inicial de bagaço; Mf: massa final de bagaço. (4) Onde EH: eficiência de hidrólise enzimática; C1: concentração de glicose no hidrolisado; M: massa de bagaço seco; W: teor de celulose no bagaço pré-tratado; e 1,11 fator de conversão de celulose em glicose.
101 2.6 Fermentação dos hidrolisados Após a hidrólise enzimática dos diferentes tipos de bagaço, os hidrolisados foram submetidos à fermentação com Dekkera bruxellensis GDB 248. Os ensaios de fermentação foram conduzidos em batelada em erlenmeyers de 125 mL onde foram adicionados 100 mL de hidrolisado com 2% m/v de células de D. bruxellensis previamente crescidas em YPD por 24 h. Os frascos foram incubados a 32ºC em condição estática e amostras de 1 mL foram coletadas no início e após 7 h. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado com filtros com poros de 0,22µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por CLAE sob as condições descritas acima. Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: produtividade volumétrica de etanol (Qp) e rendimento de conversão de açúcares (glicose e celobiose) em etanol, conforme as Equações 1 e 2. 2.7 Análises estatísticas O experimento de campo foi avaliado no arranjo experimental fatorial com três fases de colheita e cinco cultivares. O experimento de fermentação dos caldos extraídos na fase de colheita de grão leitoso/pastoso foi realizado em delineamento experimental inteiramente casualizado. O experimento de pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados também foram conduzidos em delieneamento inteiramente casualizado. Todas as determinações foram realizadas em quadruplicata e os resultados para °Brix, teores de N-FAN, P, K, pH, CE, açúcares iniciais, perda de massa, teor de glicose, açúcares redutores totais, eficiência de conversão de celulose em glicose e dos parâmetros cinéticos de fermentação concentração de etanol, produtividade volumétrica e eficiência de conversão de açúcares em etanol foram submetidos
à análise de
variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a nível de significância de p ≤ 0,05 usando o Software ASSISTAT (Silva e Azevedo, 2009).
102
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Experimento de campo Inicialmente foi conduzido um experimento de campo para avaliar a melhor
fase de colheita para as diferentes cultivares de sorgo sacarino estudadas. Para isso, foi realizada a determinação da variável ºBrix durante três fases de colheita dos colmos, emborrachamento, grão leitoso/pastoso e maturidade ou grão duro. Não houve ineteração significativa de fases de colheita e cultivares. Os teores de ºBrix nas fases de colheita de grão leitoso/pastoso e de grão duro foram semelhantes e significativamente maiores que na fase de emborrachamento (Figura 1). Portanto a colheita mais cedo, na fase de grão pastoso/leitoso, foi escolhida como a melhor para avaliar as produções de etanol de primeira e segunda geração. A escolha da variável ºBrix está relacionada com a correlação direta entre os teores de sólidos solúveis totais (ºBrix) e os teores de açúcares totais nos caldos do sorgo sacarino (Guiogou et al., 2011; Dutra et al., 2013). As cultivares atingiram a fase de grão/leitoso pastoso em dias diferentes: IPA 467 em 140 dias, SF 11 em 130 dias, BR 506 em 92 dias, SF 15 em 140 dias e IPA 2502 em 92 dias.
Figura 1: Teores de °Brix em função da época de colheita dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas no experimento de campo. Valores para n=4, MG: Média geral para a fase colheita dos colmos, Letras iguais nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, CV(%)= 17,20. FC1: Fase de colheita de emborrachamento, FC2: Fase de colheita de grão leitoso/pastoso, e FC3: Fase de colheita de maturação.
103 3.2 Caracterização inicial e fermentação dos caldos Os resultados da caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino são apresentados na Tabela 1. Todas as variáveis de caracterização dos caldos apresentaram diferenças significativas entre as cultivares de sorgo avaliadas. Os teores de °Brix variaram entre 8,95 e 16,10 e os teores de açúcares totais (sacarose, glicose e frutose) variaram entre 67,6 e 128,8 g.L-1. Geralmente os teores de °Brix e açúcares totais se correlacionam o que permite o uso da determinação de sólidos solúveis nos caldos como ferramenta importante para as indústrias sucroalcooleiras (Tsuchihashi e Goto, 2004; Guiogou et al., 2011; Dutra et al., 2013). É reportado na literatura o teor adequado de °Brix no caldo para a colheita dos colmos fica entre 15,5 e 16,5 (Prasad, 2007). Além dos teores de °Brix e açúcares totais, são importantes na caracterização do caldo os teores dos nutrientes, pH e a condutividade elétrica (CE). A análise destas variáveis permite inferir sobre a necessidade de adição ou diluição ou até mesmo correção dos caldos a serem fermentados, pois os micro-organismos necessitam de nutrientes para converter os açúcares solúveis em etanol (Bai et al., 2008). Os teores de nitrogênio N-FAN (Free amino nitrogen) variaram entre 193,4 e 670,05 mg.L-1. Os teores de P variaram entre 72,93 e 161 mg.L-1 e os teores de K entre 2768,98 e 6205,21 mg.L-1. O valores de pH para todos as cultivares foram semelhantes e com média geral de 5,24 que situa-se na fase ótima para fermentação com leveduras do gênero Saccharomyces (Dimple et al., 2010). Diferenças significativas foram observadas para a condutividade elétrica (CE), que está correlacionada com a salinidade dos caldos e pode interferir no metabolismo das leveduras e afetar o rendimento fermentativo. No entanto ainda são escassos os estudos que relacionam a CE com interferências na fermentação.
104 Tabela 1: Caracterização inicial dos caldos das cultivares de sorgo sacarino. Cultivares
°Brix
AT (g/L)
(g/100 mL)
N-FAN
P (mg/L)
K (mg/L)
pH
(mg/L)
CE (mS/cm)
IPA 467
14,65* ab
107,40 ab
193,40 b
74,90 b
5403,29 a
5,23 bc
6,03 cd
SF 11
13,95 ab
99,17 ab
294,58 ab
78,34 b
4893,17 a
5,10 c
7,24 bc
BR 506
10,35 bc
82,20 ab
670,05 a
161 a
6205,21 a
5,20 bc
9,33 a
SF 15
16,10 a
128,80 a
233,25 ab
72,93 b
2768,98 b
5,26 b
5,19 d
IPA 2502
8,95 c
67,65 b
655,24 ab
127,05 ab
5996,81 a
5,42 a
8,72 ab
*valores para n=4. AT: Açúcares totais; N-FAN: Nitrogênio free amino nitrogen; P: fósforo; K: Potássio; CE: Condutividade elétrica. Médias com a mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A variabilidade no teor de °Brix, açúcares totais, nutrientes e variáveis como pH e condutividade elétrica nos caldos das diferentes cultivares de sorgo estão associadas com a capacidade genética de cada cultivar e também com as condições ambientais como tipo de solo, precipitação, incidência de radiação solar (Zhao et al., 2009). A análise e caracterização destas variáveis em cultivares com potencial para produção de etanol é fundamental para a viabilidade do cultivo do sorgo sacarino. Os resultados dos parâmetros cinéticos após 6 h de fermentação estática com levedura Saccharomyces cerevisiae dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino estão ilustrados na Tabela 2. Como parâmetros para avaliar as cultivares foram analisados a capacidade das leveduras em consumir os açúcares dos caldos, a produção de etanol, a produtividade volumétrica de etanol produzida, o rendimento da fermentação, viabilidade celular e concentração celular. Diferenças significativas foram observadas na capacidade das leveduras em consumir os açúcares presentes no caldo das diferentes cultivares, entre 92,71 a 99,42 % de consumo (Tabela 2). Estas diferenças são produtos da qualidade dos caldos e estão relacionados com a concentração de nutrientes e outros elementos como vitaminas. Também é função do teor inicial de açúcares, pois elevadas concentrações de açúcares iniciais causam inibição pelo substrato e também pelo produto formado (Laopaiboon et al., 2009). A concentração de etanol nos caldos fermentados variou entre 28,31 a 56,38 g.L-1. Maiores teores foram observados nos caldos das cultivares com maiores teores de açúcares iniciais como SF 15. Davila-Gomez et al. (2012) observaram resultados
105 semelhantes aos avaliarem a produção de etanol a partir de cultivares de sorgo sacarino e forrageiro em região de baixa precipitação no México com teores de etanol entre 35,78 a 56,36 g.L-1. Tabela 2: Parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das cultivares de sorgo sacarino, condição estática, 6h, 33°C. Cultivares
Ac (%)
P (g/L)
Qp(g.L.h)
Yp/s
Vi (%)
Vf (%)
Ci (108)
Cf (108)
IPA 467
92,71b
42,37 abc
7,06 abc
0,45 a
97,03
95,54
4,46
4,63
SF 11
96,71ab
47,27 ab
7,88 ab
0,49 a
96,76
91,73
4,38
4,3
BR 506
98,11 ab
35,27 bc
5,88 bc
0,44 a
96,95
96,00
4,52
4,64
SF 15
95,64 ab
56,38 a
9,40 a
0,46 a
98,36
92,80
4,66
4,66
IPA 2502
99,42 a
28,31 c
4,71 c
0,42 a
95,86
98,64
4,9
4,82
Valores para n=4. Ac: Açúcar consumido; P: etanol; Qp: Produtividade volumétrica;Yp/s: Rendimento; Vi: viabilidade inicial; Vf: viabilidade final; Ci: Concentração inicial de células; Cf: concentração final de células. Médias com a mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
De forma semelhante à concentração de etanol, a produtividade volumétrica apresentou diferenças entre as cultivares avaliadas (Tabela 2). Destaque para a cultivar SF 15 com maior valor de Qp. Altas Qp são importantes para tornar o processo de produção de etanol a partir do sorgo sacarino viável, pois esta variável representa a produção de etanol por unidade de tempo de fermentação, o que no setor sucroalcooleiro situa-se entre 6 a 12 h para teores iniciais de açúcares de 120 g.L-1. Não foram observadas diferenças para a variável de rendimento fermentativo, que expressa à eficiência de transformação de açúcares consumidos em produto de interesse como o etanol (Tabela 2). O Yp/s variou entre 0,42 a 0,49 o que representa 82,35 % a 96,07 % de conversão dos açúcares em etanol a partir do coeficiente máximo de conversão 0,51. Não foram observados crescimentos de leveduras durante o processo de fermentação (Tabela 2). Isto é explicado pelo alto valor inicial de inóculo utilizado 10% m/v que representou média de 4,58 x 108 células.mL-1. Com relação à viabilidade celular, em geral, observou-se diminuição da viabilidade celular o que é produto da concentração de produtos que inibem a atividade das leveduras.
106 3.3 Pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados A composição química para os teores de celulose, hemicelulose e lignina detergente ácido dos diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino in natura e após a etapa de pré-tratamento estão ilustradas na Tabela 3. A composição inicial apresentou diferenças significativas entre as cultivares avaliadas. Os maiores teores de celulose foram observadas para as cultivares IPA 467 e IPA 2502. Os teores de celulose variaram entre 38,64 a 42,50%. Após o pré-tratamento houve aumento para os teores de celulose para todos os bagaços entre 58,11 % a 91,42%. Os teores de hemicelulose variaram entre 27,99 a 33,34 % e após o pré-tratamento com H2O2 os valores decresceram 43,13%, 46,41%, 42,15%, 44,64% e 48,13% para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente em relação aos bagaços in natura, indicando a solubilização da hemicelulose para a fração líquida da reação. Os teores de lignina detergente ácido (LDA) variaram entre 2,63 a 4,02% e após a reação com H2O2 os valores diminuiram indicando deslignificação dos bagaços. Reduções na ordem de 78,55%, 62,68%, 86,09%, 64,16% e 71,11% foram observadas para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente em relação aos bagaços in natura. Deslignificações usando o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino são bastantes variáveis em relação ao tipo de biomassa que está sendo avaliada e com as condições de processo de pré-tratamento. Para o bagaço de cana-de-açúcar, uma biomassa lignocelulósica semelhante ao sorgo sacarino são reportados valores de remoção de lignina da ordem de 70% (Rabelo et al., 2011) em condições semelhantes de processo ao usado neste estudo. Para a biomassa de algodão reduções entre 6,22% a 32% foram observadas usando H2O2 em diferentes temperaturas e pressão (Silverstein et al., 2007). Valores ótimos de 65,66% de remoção de lignina foram observados para a biomassa de palha de colza com 5% de H2O2 em meio alcalino em 1 h reação a temperatura de 50°C (Karagoz et al., 2012). Para a biomassa de sorgo sacarino Cao et el. (2012) reportaram valor de deslignificação de 78,84% usando 5% de H2O2 por 24 h.
107
Tabela 3: Composição química do bagaço in natura e após pré-tratamento com H2O2 de diferentes cultivares de sorgo sacarino. Cultivares
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
LDA (%)
IPA 467
42,46 ± 0,42 a
27,99 ± 0,46 b
4,01 ± 0,19 a
SF 11
38,64 ± 1,03 c
33,34 ± 1,13 a
4,02 ± 0,4 a
BR 506
40,7 ± 0,69 b
29,52 ± 0,71 b
2,66 ± 0,65 b
SF 15
38,73 ± 0,40 c
33,09 ± 0,96 a
3,07 ± 0,58 ab
IPA 2502
42,50 ± 1,03 a
33,33 ± 1,80 a
2,63 ± 0,4 b °
Após pré-tratamento H2O2 (40 g.L-1, 7,5% v/v H2O2, pH=11,5, 150 rpm, 1h, 25 C) IPA 467
67,13 ± 0,48
15,92 ± 0,12
0,86 ± 0,15
SF 11
72,81 ± 2,23
17,87 ± 0,90
1,5 ± 0,3
BR 506
73,12 ± 3,02
17,08 ± 1,56
0,37 ± 0,1
SF 15
74,12 ± 1,83
18,36 ± 0,79
1,1 ± 0,2
IPA 2502
75,15 ± 1,54
17,29 ± 1,62
0,76 ± 0,4
n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O objetivo do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é desorganizar a matriz orgânica para possibilitar a etapa de hidrólise dos carboidratos. Para todos tipos de bagaços avaliados neste trabalho o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino resultou na perda média de massa média em 34,55%, 38,15%, 32,03%, 41,5% e 36,22% para as cultivares IPA 467, SF 15, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente (Figura 2). A perda de massa está relacionada com a solubilização de parte da lignina, extrativos, cinzas e pequenas frações de carboidratos para a fase líquida da reação. O pré-tratamento com H2O2 é um processo de deslignificação da biomassa lignocelulósica que permite alcançar uma maior eficiência na recuperação de açúcares na etapa de hidrólise enzimática (Karagoz et al., 2012) uma vez que a presença de lignina dificulta o acesso das enzimas ao substrato. Este tipo de pré-tratamento tem eficiência dependente da biomassa avaliada e os resultados indicam não haver diferença
108 significativa para a produção de glicose e com diferença significativa para os açúcares redutores (Tabela 4) para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino avaliados.
Figura 2: Perda de massa durante a etapa de pré-tratamento do bagaço de diferentes cultivares de sorgo sacarino com H2O2 (40 g.L-1 substrato, 7,5 % H2O2, pH 11,5, 1h, temperatura ambiente). Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A enzima FibreZymeTM LDI é um complexo enzimático utilizado na indústria de papel no tratamento dos efluentes. Para o seu uso na hidrólise do bagaço do sorgo sacarino foi necessário determinar as atividades enzimáticas apresentadas por este complexo. As reações de atividades para as enzimas celulase, xilanase, avicelase, CMCase e β-glicosidase foram realizadas em tampão citrato de sódio 50 mM, pH 4,8 e temperatura de 50 °C. Suas medidas resultaram nos seguintes índices de atividades: 11,563 FPU (atividade filtro de papel); 788,94 ± 63,04 U/mL xilanase; 10 CBU/mL βglicosidase; 5,9 ± 0,34 U/mL avicelase e 174,97 ± 6,72 U/mL CMCase. A eficiência de conversão de celulose em glicose (EH) após 48 h não foi afetada pelo tipo de bagaço de sorgo sacarino avaliada (Tabela 4). Valores de 61,44%, 66,11%, 59,80%, 64,69% e 72,30% foram observados para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente. A EH depende da composição química do substrato lignocelulósico, do tipo de pré-tratamento utilizado, da carga de sólidos usados na hidrólise, da dose e do tipo de enzima, do tempo de hidrólise, bem como da metodologia de cálculo da eficiência (Modenbach e Nokes, 2013). Para condições
109 semelhantes a este trabalho CAO et al. (2010) avaliando a hidrólise enzimática do bagaço de sorgo sacarino pré-tratado com H2O2 observaram EH média de 62,46 %. Tabela 4: Eficiências de hidrólise enzimática para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino, 2% substrato, 10 FPU/g bagaço, 50°C, pH = 4,8, 48h, após prétratamento com H2O2. Biomassa
AT (g/L)
Glicose (g/L)
EH (%)
IPA 467
14,99 ± 0,83 ab
8,79 ± 0,66 a
61,44 ± 4,52 a
SF 11
13,60 ± 1,08 b
10,06 ± 2,09 a
66,11 ± 13,41 a
BR 506
15,17 ± 0,82 ab
9,31 ± 0,31 a
59,80 ± 2,60 a
SF 15
15,21 ± 1,22 ab
10,03 ± 0,63 a
64,69 ± 4,26 a
IPA 2502
16,04 ± 0,50 a
11,27 ± 2,41 a
72,30 ± 16,01 a
Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. AT: Açúcares totais, EH: Eficiência de hidrólise conversão de celulose em glicose.
A comparação com outros tipos de pré-tratamento que são utilizados para prétratar biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol observa-se eficiências de conversão de celulose em glicose semelhantes ao apresentadas neste trabalho. Sipos et al. (2009) ao usar a explosão a vapor para pré-tratar biomassa de sorgo observaram eficiências entre 50% a 90% em diferentes tempo (5 a 10min.) e temperatura (180 a 200°C) de processo e usando enzimas Celuloclast 1.5 na dose de 20 FPU.gsubstrato -1 e Novozyme 188 na dose de 20 IU.gsubstrato-1. Em outro estudo, Zhang et al. (2011) avaliaram 4 tipos de pré-tratamento para a biomassa de sorgo sacarino, líquidos iônicos, explosão a vapor, ácido diluído e lime. As condições de hidrólise enzimática foram 10% de substrato e dose de enzima de 20 FPU.gsubstrato e tempo de 72 h. A máxima eficiência de conversão de celulose em glicose foi obtida para o pré-tratamento com explosão a vapor de 72%, seguida de ácido diluído com 50%, líquidos ionicos e lime com 40%. Uma vez que não foi observada diferenças significativas para as eficiências de hidrólise enzimatica para as diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas, optou-se por fermentar o hidrólisado da cultivar SF15, pois esta cultivar se destacou na ánalise de fermentação dos caldos. Após 7 h de fermentação com D. bruxellensis a produção de etanol foi de 3,9 g.L-1 com produtividade volumétrica de 0,56 g.L-1.h-1 e rendimento de
110 tranformação de glicose em etanol de 0,40. Não foram observadas variações significativas na viabilidade celular e no crescimento da biomassa de D. bruxellensis. A fermentação de hidrolisados de biomassa geralmente leva a baixas concentrações de etanol no meio, uma vez que os teores iniciais de biomassa pré-tratada submetida à hidrólise são baixos, entre 2% a 10%, mesmo maximizando a eficiência da hidrólise enzimática, podendo chegar até 90%. Rabelo et al. (2011) ao fermentarem hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratada com H2O2 alcalino em condições semelhantes ao nosso trabalho, utilizando Saccharomyces cerevisiae, obtiveram 2,5 g.L1 1
de etanol partindo de um hidrolisado com 6,5 g.L-1 de glicose, rendimento de 0,38 g.g.
Tabela 5: Parâmetros cinéticos da fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis, 32°C, 7 h, condição estática. Bagaço
P (g/L)
Qp(g/L.h)
Yp/s
Vi (%)
Vf (%)
C.I (108)
C.F (108)
SF 15
3,9 ±0,3
0,56 ±0,03
0,40 ±0,02
95 ± 4
93 ±5
5,2 ±0,6
5,4 ±0,8
Valores para n=4 ± desvio padrão. P: concentração de etanol; Qp: produtividade volumétrica; Yp/s: rendimento de conversão de açúcares em etanol; Vi: viabilidade celular inicial; Vf: viabilidade celular final; C.I: concentração celular inicial; C.F: concentração celular final.
111
4.
CONCLUSÕES Com os resultados obtidos demonstrou-se que a melhor fase de colheita dos
colmos da biomassa de sorgo sacarino para antecipar a colheita é na fase de grão leitoso/pasto podendo-se estender até a maturação fisiológica dos grãos. A produção de etanol a partir do caldo foi influenciada pela cultivar avaliada, sendo a cultivar SF 15 a mais promissora, o que corrobora estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa. O peróxido de hidrogênio foi um pré-tratamento efetivo para o tratamento de todos os tipos de bagaços das cultivares de sorgo sacarino avaliadas e permitiu eficiências razoáveis na etapa de hidrólise enzimática da biomassa. Além disso, a levedura Dekkera bruxellensis apresentou potencial para fermentar hidrolisados de biomassa.
112
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116
CAPÍTULO V
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR E SORGO SACARINO POR UMA LINHAGEM INDUSTRIAL DE Dekkera bruxellensis
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PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR E SORGO SACARINO POR UMA LINHAGEM INDUSTRIAL DE Dekkera bruxellensis RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana-deaçúcar e sorgo sacarino por Dekkera bruxellensis após pré-tratamento brando com H2O2 em meio alcalino e hidrólise enzimática com celulases. Os ensaios foram conduzidos em duplicata delineados inteiramente ao acaso e os resultados indicaram que o uso do H2O2 em meio alcalino combinado com hidrólise enzimática dos bagaços produziu hidrolisados com teores de açúcares redutores 19,71 ± 0,6 e 14,87 ± 0,1 g.L-1 e glicose 11,5 ± 0,3 e 9,57 ± 0,2 g.L-1. Análises de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier combinadas com microscopia eletrônica de varredura e difração de raios x confirmaram modificações na estrutura dos bagaços após o prétratamento. Os ensaios de fermentação foram conduzidos em duplicata utilizando uma linhagem GDB 248 de D. bruxellensis. Foi observado o consumo de celobiose presente nesses hidrolisados, além da glicose também presente. O rendimento de etanol no final da fermentação foi de 0,42 ± 0,04 g.g-1 para cana e 0,44 ± 0,03 g.g-1para sorgo. Dekkera bruxellensis tem sido reportada como uma levedura capaz de hidrolisar a celobiose para a produção de etanol, portanto se apresenta como um microrganismo promissor em meio industrial para produção de etanol de segunda geração. Palavras-chave: Biomassa Lignocelulósica, Caracterização de Biomassa, Hidrólise Enzimática, Fermentação de Hidrolisados
118 ABSTRACT The aim of this work was to evaluate the ethanol production from sweet sorghum (SSB) and sugar cane (SCB) bagasses for Dekkera bruxellensis after H2O2 alkaline pretreatment and enzymatic hydrolysis with cellulases. The experiments were conducted in duplicate delineated in completed randomized design and the results indicated that the use of H2O2 alkaline combined with enzymatic hydrolysis of bagasses produced hydrolisates with levels of glucose 9,59 ± 0,3 e 11,5 ± 0,3 g.L-1, for SCB and SSB, respectively. Moreover, analyses of FTIR combined with SEM indicated changes in structure of bagasses after pretreatment. The experiments of fermentation were carried out in duplicate delineated completely randomized design using a strain GDB 248 D. bruxellensis. It was observed the consumption of cellobiose and glucose and the ethanol production reached 4.2 g.L-1 for SCB hydrolysate and 5.3 g.L-1 for SSB hydrolysate from assimilation of cellobiose and glucose. Ethanol yeld was 0,42 ± 0,04 g.g-1 for SCB and 0,44 ± 0,03 g.g-1 for SSB. The yeast Dekkera bruxellensis has been reported as yeast capable of hydrolyzing the cellobiose for ethanol production, therefore prove to be a promising microorganism industrial environment for the production second-ethanol generation. Key words: Lignocellulosic biomass; biomass characterization; Enzymatic Hydrolysis; Fermentation of Hydrolysates.
119 1.
INTRODUÇÃO Com o aumento na demanda de biocombustíveis ao nível mundial indicada por
um aumento de consumo interno devido ao aumento na produção de veículos “bicombustíveis”, expansão das exportações, no interesse mundial pela mistura do álcool à gasolina e pelos altos preços do petróleo; e pela opção brasileira de utilização da rota etanólica na produção de biodiesel, também cresce a busca de novas fontes de matérias-primas para utilização na área da bioenergia. Dentre elas destacam-se as biomassas lignocelulósicas, compostos de celulose, hemicelulose e lignina que quando hidrolisadas liberam monômeros fermentescíveis e grande parte é considerada como resíduos dos processos agroindustriais. Na Região Nordeste do Brasil, uma importante produtora de etanol no cenário nacional, estima-se que sejam gerados 14 milhões de toneladas de bagaço de cana-de-açúcar (CONAB, 2014) e 4 milhões toneladas de bagaço de sorgo granífero que é utilizado na alimentação animal (IBGE, 2011). Desenvolver uma tecnologia para a produção de etanol a partir da biomassa, o bagaço e a palha, é um desafio maior do que produzir etanol a partir do caldo de canade-açúcar, isso por que a evolução das plantas no ambiente possibilitou uma composição química da biomassa resistente à ação das enzimas celulolíticas, devido à presença da lignina e hemicelulose associada à fibra celulósica, fonte dos principais açúcares fermentescíveis, que termina por conferir sua cristalinidade e recalcitrância (Ramos, 2003). Muitas técnicas de pré-tratamento dessa biomassa, que terminaria por disponibilizar melhor as fibras celulósicas, têm sido estudadas por muitos anos (Lin e Tanaka, 2006) e geralmente estão agrupados em quatro categorias: físicas, químicas, biológicas ou suas combinações. Os vários métodos diferentes solubilizam componentes da biomassa, gerando vários produtos diferentes, que requerem diferentes estratégias para a hidrólise e fermentação subseqüente (Maeda et al., 2011). A escolha do prétratamento adequado depende do tipo de biomassa a ser utilizada e também está relacionado com o baixo consumo de energia (temperatura e pressão ambiente) e baixa geração de inibidores de hidrólise e fermentação como hidroximetilfurfural (HMF) e furfural, neste cenário o uso do H2O2 em meio alcalino vem ganhando destaque (Saha e Cotta, 2010; Banerjee et al., 2011; Rabelo et al., 2011), pois se caracteriza por apresentar um excelente rendimento de deslignificação. A hidrólise enzimática da biomassa se configura como o método mais eficaz para os processos fermentativos, pois não gera produtos que inibem o metabolismo das
120 leveduras e produz eficientemente uma mistura de açúcares do tipo hexoses e pentoses e também dissacarídeos, tais como celobiose, quando a preparação enzimática não é suplementada com celobiase (β-glicosidases, EC 3.2.1.21) (Wang et al., 2012). Com isso, a fim de obter um processo viável, sob o ponto de vista de produção de etanol de segunda geração, estudos com microrganismos capazes de fermentar hexoses, além das frações dissacarídicas em condições limítrofes de oxigênio e glicose como Dekkera bruuxellensis,vêm sendo apontados como promissores ao cenário industrial (Blomqvist et al., 2011; Tiukova et al., 2013; Reis et al., 2014), devido à notória capacidade de assimilação para estes dissacarídeo e fermentação a etanol trazendo boas perspectivas sob o ponto de vista de produtividade (Galafassi et al., 2011). Embora muitos microorganismos sejam mencionados na literatura como capazes de assimilar xilose e celobiose como Pichia stipitis, Candida shehatae, Kluyveromyces marxianus, Debaromyces
nepalensis.
Schizosaccharomyces
pombe,
Dekkera/Brettanomyces
naardenensis e Kluyveromyces cellobivorus, estas espécies são mais suscetíveis aos estresses alcoólicos e presença de produtos tóxicos a partir dos processos de prétratamento da biomassa lignocelulósica (Lewis Liu et al., 2012; Long et al., 2012). Neste contexto, D. bruxellensis GDB 248 se apresenta como mais adaptada para os processos industriais, até mesmo por que a mesma foi isolada desses ambientes (De Souza Liberal et al., 2005), inclusive sob condições de altas concentrações de etanol (Basso et al., 2008). Diante desse aspecto tecnológico, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino após pré-tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) em meio alcalino e hidrólise enzimática com celulases e fermentação dos hidrolisados utilizando D. bruxellensis, fazendo um acompanhamento analítico das ultraestruturas dos respectivos bagaços em cada etapa de pré-tratamento e também analisando o perfil fermentativo dessa levedura em condições de anaerobiose restrita frente a dois tipos de resíduos lignocelulósicos provenientes da indústria sucroalcooleira da região Nordeste do Brasil.
121 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Biomassa
O bagaço de cana-de-açúcar (BC) utilizado neste trabalho foi gentilmente cedido pela usina Japungú Agroindustrial S/A, localizada no estado da Paraíba, Brasil e o bagaço de sorgo sacarino foi oriundo de experimento de avaliação de cultivares para produção de etanol cedido pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). Após a moagem, os dois tipos de bagaços foram lavados para extração de açúcares residuais e secos em estufa a 45 °C por 48h. Após a secagem os bagaços passaram por moagem, individualmente, em moinho de facas tipo Willey e recolhidas as frações que passaram pela malha de 2 mm para os experimentos de pré-tratamento. 2.2. Pré-tratamento Os dois tipos de bagaço foram submetidos ao pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2) nas seguintes condições: 10 % (m/v) substrato, 7,5 % H2O2 (m/v) e incubação por 1h a 150 rpm à temperatura ambiente. Os ensaios foram conduzidos em frascos de Erlenmeyer com um volume total de 1000 mL. O pH do meio foi ajustado para 11,5 com solução de NaOH a 5M. Após o término da reação a fração sólida foi recuperada por filtração e lavada com 1,5 L de água destilada aquecida (c. 70°C) até eliminação da coloração com o objetivo de remoção de compostos residuais, especialmente a lignina. Após a lavagem os bagaços pré-tratados foram secos em estufa a 45 °C por 48 h. Nesta etapa foi possível determinar a perda de massa após o prétratamento (Equação 1). ( 1)
Onde PM: Perda de massa(%); Mi: massa inicial de bagaço (g); e Mf: massa final de bagaço (g). 2.3. Hidrólise enzimática
A hidrólise enzimática foi conduzida utilizando enzima comercial Celluclast® 1.5L (atividade 45 FPU.mL-1), sem complemento com β-glicosidase, cedida gentilmente pela Novozymes A/S. A estratégia de utilização de uma enzima comercial que não fosse
122 suplementada com β-glicosidase esta pautada no aproveitamento da própria celobiase detectada e metabolizada pela linhagem em estudo (Blomqvistet et al., 2011; Reis et al., 2014). Os bagaços foram suspensos em tampão citrato de sódio a 0,05 M pH 4,8 para concentração de 20 g.L-1 e tratado sob agitação 150 rpm à 50 °C por 48 h com a enzima comercial na proporção de 20 FPU.g-1 biomassa seca-1 (Cao et al., 2012). As hidrólises foram conduzidas em frascos de Erlenmeyers com volume de trabalho de 100 mL e após o término do tempo da ação enzimática, os hidrolisados foram submetidos a um aquecimento de 76 °C para desnaturação das enzimas e analisados quanto aos teores de açúcares. Com a determinação dos açúcares foi possível calcular a eficiência de hidrólise enzimática em relação à conversão de celulose em glicose + celobiose (Equação 2). ( 2)
Onde EH: Eficiência de hidrólise enzimática; C1: Concentração de glicose no hidrolisado (g); C2: Concentração de celobiose no hidrolisado(g); W: Concentração de substrato (g); f: Teor de celulose no bagaço (%); e 1,11 como fator de conversão de celulose em glicose. 2.4 Ensaios de Fermentação em Bancada
Os ensaios de fermentação foram conduzidos em batelada em frascos de Erlenmeyer onde foram adicionados 100 mL de hidrolisado lignocelulósico acrescidos com 2% m/v de células de GDB 248 previamente crescidas em YPD por 7 h. Os frascos foram incubados a 32ºC em condição estática e amostras foram coletadas periodicamente a cada hora. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado a 0,22 µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: produtividade volumétrica de etanol (Qp) e eficiência de conversão de açúcares (glicose e celobiose) em etanol (ECA), conforme as Equações 3 e 4. -
-
(3) (4)
123 Onde: P concentração de etanol (g.L-1), T tempo de fermentação (h), Yp/s rendimento de etanol por açúcar consumido e 0,51 rendimento teórico máximo de etanol por cada 1g de glicose. 2.5 Hidrólise e fermentação em biorreator Um experimento de hidrólise enzimática seguida de fermentação utilizando bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H2O2 alcalino, nas condições descritas acima, foi realizado em um reator New Brunswick Bioflo 110 de vaso com capacidade nominal de 1L utilizando um volume de trabalho de 0,5 L. Todos os estudos foram realizados a uma temperatura de 32°C, controlada por um banho termostático. Não houve injeção de ar, entretanto foi promovida uma pequena agitação a fim de evitar a deposição de células e biomassa celulósica (150 rpm), assegurando a esterilidade do sistema com a instalação de um filtro 0,44μm na saída de gases. As amostras foram coletadas a cada quatro horas, durante 24 (vinte e quatro) horas. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado a 0,22µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por CLAE. A produtividade volumétrica de etanol e eficiência de conversão (glicose e celobiose) em etanol (ECA) foram calculadas como nas Equações 3 e 4. 2.6 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
Com objetivo de estudar as mudanças estruturais dos grupos funcionais presentes, principalmente nos polissacarídeos presentes nas amostras de biomassa lignocelulósica de bagaço de cana-de-açúcar (BC) e bagaço de sorgo Sacarino (BS) “in natura”, estas foram pré-tratadas, lavadas e secas a 65 °C até peso constante e posteriormente foram submetidas à análise de espectroscopia FTIR. Os espectros foram coletados em espectrômetro Vertex® 70 (Bruker optics, Alemanha) com resolução de 4 cm-1 sendo efetuadas 64 scans por amostra numa faixa de número de ondas de 500 a 4500 cm-1 no modo de atenuação total de refletância. 2.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Amostras de BC e BS in natura e pré-tratadas foram lavadas e secas a 65 °C até peso constante e foram submetidas à análise de MEV. As amostras foram aderidas em fitas de carbono suportadas em “stubs” de alumínio e metalizadas com ouro e analisadas
124 em microscópio eletrônico de varredura modelo FEI Quanta™ 200F com voltagem aplicada de 20KV, utilizando um espectômetro EDS (espectroscopia por energia dispersiva), a fim de identificar a presença de possíveis elementos que compõem as biomassas “in natura” e seus respectivos decaimentos na biomassa pré-tratada. 2.8 Difratometria de raios X (DRX) Além de análises de modificações de grupos funcionais na estrutura dos bagaços, também foram realizadas determinações de índice de cristalinidade com o objetivo de verificar alterações na cristalinidade da biomassa lignocelulósica. Amostras secas de BC e BS foram submetidas a análises de difração de raios X, utilizando um difratômetro de raios X da marca Bruker modelo D8 Advance, com intervalo angular entre 10° a 50° (ângulo de Bragg - 2θ) passo angular 0,02° e tempo de contagem de 1s. O índice de cristalinidade dos materiais foi calculado segundo a equação 5 proposta por Segal et al. (1962). x 100
(5)
Onde: CrI: índice de cristalinidade, Icristalino: intensidade no pico do plano cristalino 21°, Iamorfo: intensidade no pico amorfo 18,8°. 2.9 Métodos analíticos A caracterização dos bagaços quanto aos teores de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas foram realizadas segundo a metodologia de Van Soest (1963). A atividade de celulase no preparado enzimático comercial foi determinada em papel filtro pelo método padrão recomendado pela IUPAC (Ghose, 1987). Os açúcares e os metabólitos da fermentação foram determinados por CLAE composto por um sistema Agilent® 120039, um injetor automático, um detector nas faixas de comprimento de onda no infravermelho e ultravioleta e uma coluna de troca catiônica AMINEX HPX-87H (Bio-Rad, USA), precedida de uma pré-coluna microGuard (Bio-Rad). A fase móvel usada foi de ácido sulfúrico 5 mM a um fluxo de 0,6 mL/min. A temperatura do forno foi de 70°C. O volume de amostra injetado foi de 20 µL. Os compostos foram identificados a partir dos seus tempos de retenção relativos e quantificados diretamente a partir de uma curva padrão com diluição seriada. Os valores representam, pelo menos, a média de duas réplicas biológicas.
125 2.10
Análises estatísticas
Os dados de hidrólise enzimática e fermentação foram analisados utilizando o Software ASSISTAT® (7.6 beta Version) (Silva e Azevedo, 2006) e conduzidos em duplicatas. Os resultados analíticos foram apresentados como média das duplicatas com seus respectivos desvios padrão.
126 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Caracterização da biomassa lignocelulósica pré-tratada Os teores de celulose, hemicelulose e lignina na biomassa in natura e após o prétratamento do BC e BS estão apresentados na Tabela 1. O BC e o BS in natura apresentaram 39,21 % e 42,46 % de celulose, 37,86 % e 38 % de hemicelulose e 11,82 % e 4,01 % de lignina detergente ácido, respectivamente. A composição química da biomassa lignocelulósica da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino varia de acordo com o local de cultivo, cultivar avaliada, idade de colheita da biomassa e com o método de quantificação empregado, mas em média sua composição varia entre 35 a 45 % celulose, 20 a 35% hemicelulose e 3 a 15 % lignina detergente ácido (Martin et al., 2007; Zhao et al., 2009; Han et al., 2012). Após o pré-tratamento com H2O2, os teores de celulose aumentaram para os dois tipos de bagaços enquanto que os teores de hemicelulose e lignina decresceram indicando a solubilização destes componentes. A ordem de grandeza dos constituintes após o pré-tratamento foi celulose maior que a hemicelulose que por sua vez, maior que lignina detergente ácido.
127 Tabela 1 – Teores de celulose, hemicelulose e lignina em detergente ácido no bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de sorgo sacarino in natura e após o pré-tratamento (base seca).
Biomassa
Hemicelulose (%)
LDA (%)
Celulose (%)
Cinzas (%)
Extrativos (%)
BC1
39,21 ± 1,1
37,86 ± 0,1
11,82 ± 1,5
4,92 ± 0,3
5,37 ± 0,2
BS
42,46 ± 0,5
38 ± 0,6
4,01 ± 0,2
1,09 ± 0,07
11,72 ± 1,2
40,84
37,93
7,91
3,01
8,54
Média
Após pré-tratamento H2O2 (7,5 % m/v, 100 g.L-1 biomassa, 1h, temperatura ambiente) Celulose (%)
Hemicelulose (%)
LDA (%)
Cinzas (%)
Extrativos (%)
BC
56,13 ± 0,3
30,20 ± 2,4
6,58 ± 0,7
ND
ND
BS
67,13 ± 0,5
25,92 ± 0,1
0,86 ± 0,1
ND
ND
61,63
28,06
3,72
ND
ND
Média 1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino; LDA: lignina detergente ácido; ND: não determinado.
O objetivo do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é desorganizar a matriz orgânica para possibilitar a etapa de hidrólise dos carboidratos. Para os dois tipos de bagaços avaliados neste trabalho o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino resultou na perda média de massa em torno de 36%, sem diferença significativa entre os bagaços (Tabela 2). A perda de massa está relacionada com a solubilização de parte da lignina, extrativos, cinzas e frações de carboidratos principalmente proveniente da hemicelulose para a fase líquida da reação. Resultados semelhantes foram observados por Cao et al. (2012) ao comparar 5 tipos de pré-tratamentos para pré-tratar bagaço de sorgo sacarino, dentre eles o H2O2 alcalino com perda de massa média de 32,25 %.
128 Tabela 2 – Perda de massa durante o pré-tratamento com H2O2 e teores de açúcares e perda de massa após a hidrólise enzimática (48h) da biomassa de BC e BS. Biomassa
AT (g/L)
Glicose (g/L)
PM** (%)
PM*(%)
EH (%)
BC1
35,85 ± 0,8
14,49 ± 0,1
9,57 ± 0,2
68,05 ± 0,4
84,28 ± 1,14
BS
36,45 ± 1,5
18,07 ± 0,4
11,5 ± 0,3
79,06 ± 0,9
88,07 ± 1,6
Média geral
36,15
17,32
9,45
73,55
86,18
CV (%)
3,28
2,39
3,65
0,97
6,5
1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino;*PM: perda de massa pré-tratamento; AT: Açúcares totais (Celobiose + xilose + glicose).**PM: perda de massa hidrólise enzimática.
O pré-tratamento com H2O2 alcalino é um processo de deslignificação da biomassa lignocelulósica que permite alcançar uma maior eficiência na recuperação de açúcares na etapa de hidrolise enzimática (Karagöz et al., 2012) uma vez que a presença de lignina dificulta o acesso das enzimas ao substrato. Foram observadas eficiências de remoção de lignina detergente ácido dos bagaços in natura entre 44,33 % para BC e 78,55 % para BS. Rabelo et al. (2011) ao avaliar o pré-tratamento H2O2 em meio alcalino para o bagaço de cana-de-açúcar observou redução de 70% de lignina com uma carga de sólidos no processo menor (4%) do que reportado neste trabalho (10%). Cao et al. (2012) observou 78,84 % de redução de lignina detergente ácido ao pré-tratar biomassa de sorgo sacarino com H2O2 (5 % m/v, 24h) em meio alcalino. Este tipo de pré-tratamento tem eficiência dependente da biomassa avaliada e os resultados apresentaram diferenças significativas para a produção de glicose, açúcares totais e perda de massa após hidrólise enzimática para o BC e BS (Tabela 2). A diferença entre os teores de glicose e açúcares totais para os dois tipos de bagaços podem ser explicadas pela diferença nos teores de celulose após o pré-tratamento com H2O2 (Tabela 1) e também na liberação de xilose e celobiose formada, uma vez que a hidrólise enzimática foi conduzida com celulases comerciais, sem complementação com β-glicosidases, que apresentam baixa atividade de β-glicosidases (Saha e Cotta, 2010). Também pode ser explicado pela maior remoção de lignina observada para o BS, uma vez que a remoção da lignina aumenta a eficiência de hidrólise enzimática pela eliminação de sítios de ligação não produtivos entre lignina e celulases (Kumar et al., 2009).
129 A eficiência de hidrólise enzimática, relação entre a celobiose e a glicose liberada no hidrolisado em função da carga de biomassa aplicada na hidrólise, foi de 84,28 % para o BC e 88,07% para o BS (Tabela 2). Resultados de eficiência de hidrólise enzimática para biomassa lignocelulósica de cana-de-açúcar e sorgo sacarino são bastante variáveis na literatura, em função das diferenças de composições químicas, do método de cálculo de eficiência e principalmente pelos diferentes métodos de prétratamentos utilizados. Sipos et al. (2009) avaliaram o pré-tratamento com explosão a vapor do bagaço de sorgo sacarino para melhorar a etapa de hidrólise enzimática, com celulases complementada com β-glicosidase (1,5 L Celluclast adicionada de Novozymes 188) e carga inicial de sólidos 2% m/v e observaram valores de conversão glicose entre 85 a 90%. Chandel et al. (2013) estudaram o pré-tratamento com ácido oxálico do bagaço de cana-de-açúcar em condições de hidrólise enzimática com Celluclast 1,5 L e Novozymes 188 com carga de 20 FPU. g de biomassa-1 e 30 UI. g biomassa-1 e observaram eficiência 66,51 % expresso em termos de açúcares redutores pelo total de carboidratos. 3.2 Análise de deslignificação dos bagaços por FTIR, MEV/EDS e DRX Além das avaliações de perda de massa e composição química após o prétratamento, ferramentas de análise estrutural da biomassa são importantes para corroborar mudanças na fração lignocelulósica (Chandel et al., 2013). Os resultados de FTIR, apesar de serem usados mais como uma ferramenta de comparação qualitativa, determinaram as mudanças nas estruturas químicas dos polissacarídeos presentes na superfície das biomassas lignocelulósicas pré-tratadas H2O2 em meio alcalino para as amostras de BS e BC como estão ilustradas na Figura 1 e 2.
130
Figura 1: Espectros de FTIR para amostra de bagaço de sorgo sacarino pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
Figura 2: Espectros de FTIR para amostra de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm. Nas faixas de bandas entre 2.850 e 2.920 cm-1 caracterizam presença de grupos CH2- bastante presentes em cerídeos, no qual pode ser observada presença em ambos as biomassas e o tratamento com peróxido alcalino conferiu uma pequena remoção apenas no bagaço de sorgo sacarino, significando uma redução na quantidade de frações
131 alifáticas presentes nessas estruturas. Foram observados decréscimos nas intensidades dos espectros relacionados à hemicelulose 1730 cm-1, relacionados aos grupos carbonil (C=O) e lignina 1514 (BS) e 1510 (BC), relacionados aos grupos aromáticos o que confirma os dados apresentados na tabela 1 que apontaram solubilização parcial da hemicelulose e da lignina dos bagaços após o pré-tratamento. Resultados semelhantes foram observados por Rezende et al. (2011) com bagaço de cana-de-açúcar. Uma explicação para isso deve estar relacionada à remoção de lignina associada à hemicelulose por esse método de pré-tratamento. Outra razão estaria associada à redeposição da lignina liberada sobre a superfície (espectroscopia FTIR é uma técnica de superfície, a profundidade de penetração é de aproximadamente 0,5-3 µm para materiais lignocelulósicos com a intensidade do sinal exponencialmente decrescente com profundidade de penetração) (Stewart et al., 1995). Observa-se um aumento muito significativo da quantidade lignina, seria muito precipitado afirmar que este fenômeno está conexo apenas à remoção da hemicelulose. A principal estratégia para alcançar aumentos significativos na conversão enzimática é a diminuição da cristalinidade da celulose dos resíduos lignocelulósicos. Neste sentido analises de DRX para o BC (Figura 3) e BC (Figura 4) apresentaram valores de 34% e 33,8 % para os bagaços in natura, respectivamente. Após a etapa de pré-tratamento foram verificados aumentos significativos no IC para os dois bagaços para valores de 47,6% e 47,5%. Aumentos nos IC estão relacionados com a remoção de frações amorfas de hemicelulose e outros constituintes. Resultados semelhantes foram observados por Chandel et al. (2013) que verificaram aumento no IC de de 45,61 % para 52,56 % para o bagaço de cana-de-açúcar quando submetido ao pré-tratamento com expansão de fibras com ácido oxálico. No entanto, é importante mencionar que o índice de cristalinidade deve ser corrigido pela eficiência da etapa de pré-tratamento, pois representa de forma mais real o índice de cristalinidade do material. Assim quando corrigidos os valores de IC para os dois tipos de bagaços (17,1% para BC e 17,3% para BS) é observado uma diminuição do IC para os dois bagaços o que corrobora a melhora na eficiência de conversão enzimática dos bagaços pré-tratados.
132
Figura 3: Difratogramas de raios X para amostras de bagaço de cana-de-açúcar “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
Figura 4: Difratogramas de raios x para amostras de bagaço de sorgo sacarino “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm. Ainda sobre o estudo das mudanças na ultraestrutura dos bagaços de cana e sorgo sacarino, os resultados de microscopia eletrônica de varredura reforçaram a ação do pré-tratamento por oxidação via radicais de decomposição do H2O2 em meio alcalino demonstrando alterações na extensão das fibras celulósicas e consequentemente em sua exposição, devido à remoção das frações de lignina e diminuição da sua recalcitrância.
133 Isto pode ser percebido nas diferenças entre os bagaços “in natura” (Figura 5 A e C) e os pré-tratados (Figura 5 B e D). É importante notar a presença de microespaços no bagaço de cana pré-tratado (Figura 5B) em maior quantidade que o bagaço de sorgo. Sugere-se que esses “microvazios” aparecem devido à ação deslignificante do peróxido de hidrogênio, que varia de acordo com o teor de lignina de cada material lignocelulósico e que como mostrado acima, o bagaço de cana apresenta um maior teor de lignina (Tabela 1). Para a modalidade EDS (espectroscopia de energia dispersiva), tanto o bagaço de cana quanto o bagaço de sorgo apresentaram em sua estrutura “in natura” um espectro muito intenso de silício (dados não mostrados), confirmando a presença de cinzas. Já nos bagaços pré-tratados esses espectros não aparecem mais, colaborando para a eficiência da metodologia como adequada aos processos fermentativos.
A
C
B
D
Figura 5: Imagens de MEV para amostras de bagaço de cana-de-açúcar in natura (a) e após pré-tratamento (b) e sorgo sacarino in natura (c) e após pré-tratamento (d). Prétratamento com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
134 3.3 Fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis A fermentação de hidrolisados de biomassa geralmente acarreta em baixas concentrações de etanol no meio, uma vez que os teores iniciais de biomassa pré-tratada submetida à hidrólise são baixos, mesmo maximizando a eficiência da hidrólise enzimática. De uma forma geral não foram observadas diferenças significativas para os parâmetros cinéticos durante a fermentação dos hidrolisados de BC e BS, com exceção dos açúcares consumidos (glicose e celobiose) (Tabela 1). Em média 94,08 % dos açúcares fermentescíveis foram consumidos por D. bruxellensis em um tempo de 7h com eficiência média de conversão dos açúcares em etanol de 84,41% o que indica boa fermentabilidade dos hidrolisados (Tabela 3). Apesar de apresentar rendimentos ainda inferiores às linhagens de S. cerevisiae, GDB 248 exibiu uma melhor desempenho fermentativo, frente à conversão dos hidrolisados de bagaços de cana-de-açúcar e sorgo sacarino e em termos de produtividade etanólica, em comparação com experimentos realizados por Blomqvist (2010) empregando as linhagens CBS 11269, CBS 11270 e CBS 74, utilizando meios sintéticos contendo glicose e celobiose em concentrações equivalentes às encontradas nos hidrolisados desta pesquisa. South et al. (2010) utilizando hidrolisados de serragem de faia (Fagussp) pré-tratado hidrotermicamente com explosão à vapor, também obteve valores de rendimento (0,45 em média para seus hidrolisados) inferiores ao obtido nesse estudo utilizando CBS 11269. Sugere-se que esses baixos rendimentos estejam relacionados à baixa produção de açúcares metabolizáveis por D. bruxellensis nos estudos citados.
Tabela 3 – Parâmetros cinéticos para a fermentação dos hidrolisados da biomassa de BC e BS por D. bruxellensis com tempo de 7h. Hidrolisados
P* (g/L)
Qp (g/L.h)
ECA (%)
AC (%)
BC1
4,20 ± 0,2
0,60 ± 0,1
82,94 ± 2,9
95,65 ± 0,1
BS
5,32 ± 0,8
0,76 ± 0,1
85,88 ± 13
92,50 ± 0,7
Média geral
4,76
0,68
84,41
94,08
CV (%)
11,84
11,84
11,17
0,53
1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino;*P: concentração de etanol; Q p: Produtividade volumétrica de etanol; ECA: eficiência de conversão de açúcares em etanol; AC: açúcares consumido.
Além dos parâmetros cinéticos finais, também foram comparados os perfis cinéticos de fermentação dos hidrolisados de BC e BS, partido de concentrações iniciais
135 diferentes de glicose (9,57 g.L-1 para o hidrolisado de BC e 11,5 g.L-1 para o hidrolisado de BS) e celobiose (0,81 g.L-1para o hidrolisado de BC e 1,62 g.L-1 para o hidrolisado de BS), principais sacarídeos a serem metabolizados por Dekkera bruxellensis. Os dois meios não foram suplementados com nitrogênio, a fim de avaliar sua capacidade fermentativa e simulando ao máximo uma condição industrial. Na primeira hora foi detectada a produção de etanol (1,09 g.L-1) para o meio com BC e 1,46 g.L-1 para o meio de BS) durante o consumo lento da celobiose e assimilação rápida da glicose, como mostra as Figuras 6 e 7.
Figura 6. Aspecto fermentativo de D. bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, sem suplementação com nitrogênio.Os valores representam a média de duplicatas.
136
Figura 7. Aspecto fermentativo de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de sorgo sacarino, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas. Não foi observada a produção significativa de ácido acético, uma característica muito comum em fermentações de açúcares por D. bruxellensis em condições de aerobiose restrita. Além disso, a não suplementação do meio com uma fonte metabolizável de nitrogênio não afetou a capacidade de conversão de açúcares em etanol pela D. bruxellensis, uma vez que esta levedura possui como característica a habilidade do uso de formas de nitrogênio (nitrato) que não são utilizadas Saccharomyces cerevisiae, o que lhe confere vantagem adaptativa em meios industriais (Barros Pitta et al., 2011). Os rendimentos de fermentação por D. bruxellensis GDB 248 em função do consumo de glicose acumulado com celobiose para o BC e BS foram respectivamente de aproximadamente 65% e 74,4%, baseados na produção de etanol e CO2. A partir dos dados obtidos em frascos de Erlenmeyer e tendo como objetivo confirmar a capacidade fermentativa da celobiose por D. bruxellensis em seu rendimento em função da produtividade volumétrica de etanol e eficiência de conversão
137 de açúcares (glicose e celobiose) em etanol, foi realizado um “scale-up” em reator de bancada utilizando o BioFlo®110 (volume de 1000 mL), New Brunswick ScientificCo., empregando condições semelhantes às aplicadas aos ensaios em frascos, alterando apenas a carga de biomassa lignocelulósica de bagaço de cana-de-açúcar para 5% (m/v), no objetivo de aumentar a quantidade de açúcar fermentescível ao final da hidrólise enzimática. A fermentação foi conduzida por 24h, e os pontos coletados nos tempos 0, 1, 4, 8, 13 e 24h a fim de estabelecer uma cinética de fermentação no reator. Após 24 h de fermentação, a concentração de etanol atingiu 9,5 g.L-1, com produtividade volumétrica de 0,40 g.L-1.h-1 e rendimento em função da glicose e celobiose de 0,37 g.g1
. Resultados semelhantes foram observados ao fermentar bagaço de cana-de-açúcar,
deslignificado com NaOH e hidrolisado com celulases (30 FPU.gbagaço-1 e 20 CBU.gbagaço-1), utilizando Saccharomyces cerevisiae com rendimentos de conversão de glicose em etanol de 0,35 g.g-1 (Santos et al., 2010). Além do rendimento de conversão de glicose e celobiose em etanol, também foi quantificado o rendimento de fermentação em função do consumo de glicose, da celobiose e também do consumo de xilose para o BC, que foi de 0,32 g.g-1, baseado na produção de etanol (Figura 8). Comparado com outras leveduras reportadas na literatura como Spathaspora passalidarum (0,32 g.g-1 – Souza, 2014), Candida shehatae HM 52.2 (0,28 g.g-1 – Chandel et al., 2013), e Escherichia coli FBR5 (0,46 g.g-1- Saha e Cota, 2006), a levedura Dekkera bruxellensis apresentou elevado potencial para aplicação em fermentações industriais para produção de etanol de segunda geração.
138
Figura 8. Cinética de fermentação de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em reator de bancada. Os valores representam a média de duplicatas.
139 4. CONCLUSÕES Os resultados apresentados sustentam a viabilidade técnica da utilização do H2O2 em meio alcalino em temperatura ambiente e reduzido tempo de reação para pré-tratar biomassas de alta disponibilidade na Região Nordeste do Brasil. Foi possível obter altas eficiências de hidrólise enzimática utilizando apenas preparações comerciais de celulases, sem complementação com β-glicosidades, o que pode diminuir os custos de processo de hidrólise. Análises de ultraestrutura com técnicas de FT-IR, DRX e MEVEDS corroboraram as análises químicas de caracterização da biomassa que indicaram alterações significativas nas frações de lignina e hemicelulose dos bagaços de cana-deaçúcar e sorgo sacarino. Além disso, os resultados confirmaram a capacidade de utilização da levedura D. bruxellensis para fermentar hidrolisados lignocelulósicos.
140 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BANERJEE, G.; CAR, S.; SCOTT-CRAIG, J.; HODGE, D.B.; WALTON, J.D. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnology for Biofuels, v.4, p.1-15, 2011. BARROS PITA, W.; LEITE, F. C.;SOUZA LIBERAL, A. T.; SIMÕES, D. A.; MORAIS JR, M. A. The ability to use nitrate confers advantage to Dekkera bruxellensis over S. cerevisiae and can explain its adaptation to industrial fermentation processes, Antonie van Leeuwenhoek, v. 100, p. 99-107, 2011. BASSO, L. C.; AMORIN, H.V.; OLIVEIRA, A.J.; LOPES, M.L.Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS yeast research, v. 8, p. 1155-1163, 2008. BLOMQVIST, J.; EBERHARD, T.; SCHUNER, J.; PASSOTH, V. Fermentation characteristics of Dekkera bruxellensis strains, Applied microbiology and biotechnology, v. 87, p. 1487-1497, 2010. BLOMQVIST, J.; SOUTH, E.; TIUKOVA, I.; MOMENI, M. H.; HANSSON, H.; STAHILBERG, J.; HORN, S. J.; SCHURER, J.; PASSOTH, V. Fermentation of lignocellulosic hydrolysate by the alternative industrial ethanol yeast Dekkera bruxellensis. Letters in applied microbiology, v. 53, p. 73-78, 2011. CAO, W.; SUN, C.; LIU, R.; YIN, R.; WU, X. Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse. Bioresource Technology, v.111, p.215-221, 2012. CHANDEL, A. K.; ANTUNES, F. F. A.; ANJOS, V.; BEL, M. J. V.; RODRIGUES, L. M.; SING, O. V.; ROSA, C. A.; PAGNOCCA, F. C.; SILVA, S. S. Ultra-structural mapping of sugarcane bagasse after oxalic acid fiber expansion (OAFEX) and ethanol production by Candida shehatae and Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuels, v. 6, p. 4, 2013. CONAB, C. N. D. A.-. Acompanhamento da safra brasileira: cana-de-açúcar, terceiro levantamento, dezembro/2012-Companhia Nacional de Abastecimento. Brasília, p. Safra 2012/2013, 2014. DE SOUZA LIBERAL, A. T. et al. The yeast Dekkera bruxellensis genome contains two orthologs of the ARO10 gene encoding for phenylpyruvate decarboxylase. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 28, p. 2473-2478, 2012. DE SOUZA LIBERAL, A.; SILVA-FILHO, E.A.; MORAIS, J.O.; SIMÕES, D.A.; MORAES, M.A. Contaminant yeast detection in industrial ethanol fermentation must by rDNA PCR. Letters in applied microbiology, v. 40, p. 19-23, 2005.
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144 CONSIDERAÇÕES FINAIS A região Nordeste do Brasil é uma área com histórico na produção de açúcar e etanol, principalmente na região litorânea conhecida como zona da mata. Neste ambiente, os estados do Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco e Alagoas produzem cana-de-açúcar com tecnologia madura e bem estabelecida. No entanto, com o aumento da demanda em nível mundial e nacional na produção de etanol, novas expansões na produção deste biocombustível são inevitáveis. Uma estratégia para tal expansão é o uso de culturas energéticas semelhantes à cana-de-açúcar que possam integrar o sistema de cultivo ou expandir para novas áreas onde a cana não apresenta bom rendimento. Uma cultura capaz de satisfazer tais requisitos é o sorgo sacarino. A biomassa de sorgo sacarino tem potencial para aumentar a produção de etanol na região Nordeste do Brasil, tanto como matéria-prima complementar a cana-de-açúcar como em área de reduzida disponibilidade de água. Estimativas para a cultivar mais estudada, IPA 467, indicaram potencial de produção de aproximadamente 6730 L.ha-1 a partir das frações caldo, grãos e bagaço. Para um espectro amplo de cultivares a produção de etanol a partir do caldo teve influência do tipo de cultivar e do local de cultivo com médias de produção entre 680 a 3120 L.ha-1. Além do caldo, a fração lignocelulósica do bagaço deve ser vista como uma fonte promissora de açúcares fermentescíveis, mas que requer uma etapa de prétratamento e hidrólise enzimática. Neste contexto, o pré-tratamento com H2O2 demonstrou potencial de aplicabilidade como processo de baixo gasto energético com eficiências de hidrólise enzimática satisfatória para bagaço de sorgo sacarino e cana-deaçúcar. Além da etapa de pré-tratamento e hidrólise enzimática, parte fundamental da viabilidade do processo é a fermentação dos hidrolisados enzimáticos, que neste estudo apresentou o potencial de uso de uma levedura que geralmente está associada com a contaminação das dornas de fermentação de caldo de cana em destilarias, Dekkera bruxellensis, mas que apresentou boa fermentabilidade de hidrolisados com mistura de celobiose e glicose.
145
Anexo I: Artigo Publicado, “Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil”
146 Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil
Emmanuel D. Dutra1*, Adauto Gomes Barbosa Neto5, Rafael Barros de Souza3,4, Marcos Antonio de Morais Junior2,3,4, Jose Nildo Tabosa6 and Rômulo Simões Cezar Menezes1
1
Biomass
2
Interdepartmental Research Group in Metabolic Engineering, Department of Genetics,
Energy
Research
Group,
Department
of
Nuclear
Energy
and
Federal University of Pernambuco. Av. Moraes Rego, 1235, 50670-901, Recife, PE, Brazil. 3
Laboratory of Bioprocessing, CETENE. Av. Prof. Luiz Freire, 01. 50740-540, Recife,
PE, Brazil. 4
Genetech – Research, Development and Consulting in Biotechnology, Av. Moraes
Rego,1235, 50670-901, Recife, PE, Brazil 5
Agronomic Institute of Pernambuco. Av.General San Martin,1371, 50761-000, Recife,
PE, Brazil
*Corresponding author
Tel: 55 – 83 – 21267983 Fax: 55- 83 – 21267983
[email protected]
147 Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil
Abstract
The decline in the use of fossil fuels in the future is evidenced by the availability of its reserves and related environmental issues. Biofuels are presented as a renewable alternative to fossil fuel production, including ethanol. However, ethanol production demands the use of agricultural land and other natural resources, with emphasis on water. The purpose of this study was to evaluate the potential of eight sweet sorghum cultivars in order to expand the ethanol production to areas with limited supply of water, not suitable for sugarcane without irrigation. The samples of cultivars produced by breeding programs in the state of Pernambuco, Brazil, were analyzed for fermentation by industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, at 33°C, under static conditions for a period of 6 hours. All assessed parameters showed some statistically significant differences among cultivars (p < 0.01), especially ethanol concentration (P) and the volumetric productivities (Qp) in the following order: Willey (P = 64.77 ± 4.4 g l-1 and Qp= 10.79 ± 0.74 g l-1h-1), Wray (P = 59.10 ± 1.7 g l-1 and Qp = 9.85 ± 0.28 g l-1h-1) and BR 506 (P = 59.07 ± 1.3 g l-1 and Qp = 9.84 ± 0.21). The highest potentials for ethanol yield per hectare were observed for the cultivars SF 15 (3142.51 ± 428.47 l ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 l ha-1). Therefore, the cultivar BR 506 seems to be very promising as an energy crop to be produced in areas with environmental conditions similar to Pernambuco.
Keywords: Renewable Sources; Biofuels; Alcoholic fermentation; Energy Crops.
148 Introduction Many factors, like the emission of greenhouse gases and availability and easiness to access the current reserves, point out to a decline in the current consumption of fossil fuels. In this context, there has been an increase in the use of renewable energy sources, and among them, the sources based in bioenergy (energy in form of biomass), including the use of energy crops in order to produce biofuels like biodiesel and ethanol (Sanchés and Cardona 2008). The production of ethanol in the world is increasing every year. Ethanol can be produced from different biomass sources, such as starchy (corn and cereal grains), sucrose (sugarcane, sugar beet and sweet sorghum) and cellulosic crops (crop residues and wood) (Walker 2011). In Brazil, ethanol production derives mainly from the fermentation of the sucrose from sugarcane juice and/or molasses. Brazil produced nearly 24 billion liters of ethanol during the 2009-2010 crop season, a figure that is projected to reach 37 billion liters by 2012-2013 (Amorim et al. 2009). Nevertheless, ethanol production from sugarcane has limitations, mainly in areas with low rainfall precipitation. In the northeastern region of Brazil, only a narrow region along the coast of the Atlantic Ocean receives enough rainfall precipitation for the cultivation of sugarcane without irrigation. In the remaining areas, the adoption of new energy crops with better water use efficiency, like sweet sorghum, maybe a more sustainable solution to the expansion of ethanol production. Sorghum's potential for ethanol production has been widely reported, and its C4type photosynthetic metabolism makes appropriated for biomass production in conditions of high solar incidence and low water availability (Almodares and Hadi 2009; Vasilakoglou et al. 2011). Originally from Africa, it is now the fifth most cultivated cereal in the world for the use as forage, and most recently for energy
149 generation (Reddy et al. 2005), as complement in animal feeding and to produce fibers (Murray et al. 2008). Among other characteristics, efficient water usage (1/3 of water required for sugarcane and 1/2 of water required for corn) and the versatility of growing in different types of soil and climate. In general, sweet sorghum produces 2 ton ha-1 of grains and 50 ton ha-1 of stems, with a stem juice rich in sucrose, glucose and fructose (Wu et al. 2010). Ethanol production from fermentation of sorghum stem juice is about 3451 l ha-1 (Prasad et al. 2007). In the context of pursuing new feedstock for biofuel production, the purpose of this study was to evaluate ethanol production by fermentation of stem juice derived from different sweet sorghum cultivars in the municipality of Goiana, state of Pernambuco, Northeast region, Brazil.
Material and methods Sweet soghum biomass and juices The stems from eight sorghum cultivars were obtained from the Agronomic Institute of Pernambuco (IPA) after a field experiment to evaluate biomass production in the municipality of Goiana, state of Pernambuco, Northeast, Brazil. The region has a yearly precipitation mean around 1600 mm and average temperature of 25ºC. The evaluated cultivars were: IPA 467-4-2, Rio, Tale, Willey, Wray, BR 501, BR 506 and SF 15. The field experiment was carried out in a randomized complete block design. Plants were harvested during the grain maturation phase. Leaves and panicles were removed from the stems in order to have the juice extracted from fully clean stems in a simple sugarcane crusher system. First, the sorghum juices were evaluated for: (1) total
150 suspended solids as °BRIX values using a handheld refractometer (RT-30ATC, Instruterm); and (2) the concentration of total reducing sugars (TRS) by the 3,5dinitrosalicylic acid method (Miller 1959). After digestion with sulfuric acid and hydrogen peroxide, the following nutrient contents were determined (Thomas et al. 1967): total nitrogen (TN) by the Kjeldahl method; total phosphorus (TP) by the colorimetric method; and potassium (K) by flame photometry (Embrapa 1999). pH was determined using a Digimed potentiometer. Extracted juices were stored at -20 ºC in a freezer for subsequent fermentation assays. Fermentation experiment Fermentations were carried out in a single batch system in 500 ml Erlenmeyer flasks at 33 ºC and static conditions for 6 hours. All assays were conducted in triplicate, in a completely randomized design. A 100 ml volume of non-sterilized sorghum juice was added to the Erlenmeyer flasks and inoculated at 10 % w/v (108 cells ml-1) with pure industrial yeast Saccharomyces cerevisiae P1 strain (Silva-Filho et al. 2005) obtained directly from industrial process from Japungú distillery, Santa Rita, State of Paraíba, Brazil. The fermented juices were then centrifuged at 4200 x g for 10 minutes and the supernatant was collected and submitted to analytical analysis. Total reducing sugars were measured in the fermented juices using the DNS method (Miller 1959) and expressed in glucose equivalents. The amount of ethanol produced was quantified using gas chromatography coupled with a flame ionization detector under the following operational temperatures: 95 ºC for the column, 130º C for the injector and 160 ºC for the detector. Nitrogen (N2) was used as carrier gas. Cellular viability was determined in a Neubauer chamber using methylene blue staining. Physiological parameters
151 The following parameters were calculated during fermentation: volumetric ethanol productivity (QP); ethanol yield (YP/S), expressed as g of ethanol g-1 of consumed sugar; and sugar-to-ethanol conversion efficiency (SCE), using equations (1) and (2):
Where P is the ethanol concentration (g l-1), T is the fermentation time (h) and 0.51 is the maximum theoretical ethanol yield per gram of glucose consumed. The theoretical ethanol yield per hectare for each sweet sorghum cultivar using the results from total reducing sugars and sugar-to-ethanol conversion efficiency in accordance to the equation (3) proposed by Zhao et al. (2009) with modification on sugar-to-ethanol conversion efficiency that in the original equation is 85 %.
Where TRS is the percentage of total reducing sugar, fresh biomass is the fresh biomass production for sweet sorghum in Mg ha-1, 6.5 is the sugar-to-ethanol conversion, SCE is the sugar-to-ethanol conversion efficiency and 0.79 is the ethanol density in g ml-1. Statistical analysis The study used a completely randomized experimental design and all analytical assays were performed in triplicate. The results from °BRIX, TN, P and K content, starting TRS concentration, starting pH, volumetric ethanol productivity, ethanol yield, sugar-to-ethanol conversion efficiency and theoretical ethanol yield per hectare were submitted to variance analysis (ANOVA) and the means were compared by the Tukey test (α = 0.05) using the Software ASSISTAT (Silva and Azevedo 2002).
152
Results and discussion
Chemical composition of the juices The initial content of total reducing sugars and BRIX in the juices showed different concentrations for each cultivar. Juices from Willey, Wray and BR 506 strains had the highest °BRIX and TRS values (Table 1). The ethanol production from sweet sorghum juices in submerged fermentation is directly related to TRS concentrations; that is, up a certain level, juices with higher TRS and °BRIX concentrations result in higher ethanol concentrations by the yeast. TRS concentration above 270 g l -1 is supposed to be inhibitory and might induce oxidative stress under very high gravity fermentation (Thomas et al. 1996). °BRIX is a common analysis in sugar and ethanol producing companies, and allows direct field readings of the juices' sugar content. This variable indicates the concentration of soluble solids in the juice (in g 100 ml-1) that are possibly correlated to the content of total reducing sugars. Under the experimental conditions of this study, an increase in the °BRIX of the juices from distinct sweet sorghum cultivars resulted in a linear increase (R2=0.895) in the TRS content (Figure 1). Other studies on the fermentation of sweet sorghum juices also showed linear relations between TRS content and °BRIX (Guigou et al. 2011 - R2 = 0.960 and Tsuchihashi and Goto 2004 - R2 = 0.807). Besides, the measurements of sugar content, nutrient availability and medium pH is essential to monitor the feedstock quality in the fermentation process. The mineral
153 composition is very important for the alcoholic fermentation process, especially in the nutrition and fermentative metabolism of the yeast cells (Walker 2004). Among the analyzed minerals, potassium had the highest content in the level of 3742.9 mg l -1, the total nitrogen and phosphorus had an average of 681.2 mg l-1 and 47.4 mg l-1, respectively (Table 1). These contents are mostly influenced by soil type, crop management and by the ability of each cultivar to absorb nutrients from the soil. Potassium is the most abundant cation in yeast, constituting 1-2% of cell dry weight and acting as a major cofactor for enzymes involved in oxidative phosphorylation, protein biosynthesis and carbohydrate catabolism (Jones and Greenfield 1994). Nitrogen is important for yeast multiplication and also responsible for activation of conveyor systems sugars, increasing the entry of sugar into the cell (Lagunas et al. 1982). Phosphorus is essential for the energy metabolism and the synthesis of the nucleic acids. This element is considered essential for the absorption of carbohydrates, conversion of sugar into alcohol and ATP production in glycolysis so as respiratory chain (Amorim 1985; Vasconcelos 1987). Despite the importance of these elements in the fermentation there are no available studies that report the mineral composition of the feedstock used in the fuel ethanol production and even less about the synergistic effect of the minerals in the fermentative metabolism of the yeast. For this reason, more detailed studies are necessary to evaluate these effects. The pH is a very valuable parameter in the fermentation process, as it controls nutrient dissolution and assimilation, extracellular degrading enzymatic activity and also prevents the proliferation of contaminating microorganisms of the alcoholic fermentation (Lima et al. 2002). The juices of the eight evaluated cultivars showed an average initial pH of 5.04 (ranging from 4.60 to 5.41), which is adequate for fermentation with yeast (pH 5.0 - 6.5). Similar pH values were observed for Dale
154 cultivar (pH 5.4) (Dimple et al. 2010) and for sweet and foraging cultivars (pH 4.56) (Davila-Gomes et al. 2011). There was a reduction in the pH of all fermentations to pH around 3.94 (data not shown) that may be related to the production of organic acids in the sugar metabolism by yeast (Bai et al. 2008). Alcoholic fermentation of the juices and ethanol yield per hectare Higher ethanol concentrations obtained from the fermentation of Willey, Wray and BR 506 (Table 2) cultivars juices can be explained by the high starting content of TRS, as there was a linear correlation (R²=0.893) between the concentrations of starting total reducing sugars and ethanol (Figure 2). The average ethanol concentration for the fermentation of the juices was 50.06 g l-1 (from 30.6 to 64.7 g l-1), which is lower than the 89.5 g l-1 obtained by Laopaiboon et al. (2007) by fermenting the juice of the Keller sweet sorghum variety. This difference can be explained by the higher concentration of soluble solids, the nutrient supplementation and the higher fermentation time (average of 48h) of that report. The highest Qp values were observed for Willey, Wray and BR 506 cultivars (Table 2). Qp is directly related to ethanol concentration and fermentation time, representing a very important kinetic parameter for the viability of commercial alcoholic fermentation. In this sense, the mean volumetric productivity of 8.34 g l-1h-1 is above near values reported for sweet sorghum juice fermentation (Khongsay et al. 2010 - 1.92 g l-1 h-1 and Ratnavathi et al. 2010- 1.16 g l-1h-1). This difference can be explained by the longer fermentation times seen in the referenced studies (36 and 60 h, respectively). Another important kinetic parameter of the fermentation process is the ability of yeasts to produce ethanol from the available sugar and can be expressed as the sugar
155 conversion efficiency (SCE). The results for SCE showed differences between cultivars (Table 3) and the better results obtained for IPA 467 and BR 501 cultivars may be related to lower ethanol content seen in the fermentation of their juices, as ethanol may inhibit the fermentation process (Walker 2004). Mean values obtained for SCE in the experimental data set (90.2 %) are within the range of the main results found in scientific literature (68.6 – 94.1 %) (Wu et al. 2010; Guigou et al. 2011), evidencing the potential for fermentation of the evaluated cultivars. The total and viable cell concentrations were almost constant during all fermentations. In general terms, the values obtained for theoretical ethanol yield per hectare were low (mean = 1741.92), indicating that the cultivation practices under the assessed environmental conditions need to be improved, as well as the sugar-to-ethanol conversion efficiency. In a study conducted by Zaho et al. (2009) under another environmental condition and using distinct cultivars, with estimated mean value for two years of cultivation was 4.729 l ha-1. However, the highest theoretical ethanol yields for hectare (Table 3) were obtained for SF 15 (3142.51 ± 428.47 l ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 l ha-1), both influenced by the high production of biomass by these cultivars. Conclusion The sweet sorghum stem juice showed potential for ethanol production in northeastern, Brazil. The cultivars SF 15 and BR 506 presented great potential for ethanol production per hectare and are promising for large-scale cultivation.
156 The authors acknowledge the financial support from CNPq (edital 46/2009, processo 551284/2010-2) and Facepe (edital 09/2010, processo APQ 07185-01/10). The Genetech company for the equipment used in the fermentation assays and the Japungú distillery (PB) for making industrial yeast biomass and the gas chromatograph available.
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161 Legend to Figures
Figure 1 Correlation between °BRIX and the content of total reducing sugars (TRS) for the juices of sweet sorghum cultivars
Figure 2 Correlation between total reducing sugars content (TRS) and ethanol concentration in the fermented juices from sweet sorghum cultivars
162 Table 1 Preliminary characterization of juices from distinct sweet sorghum cultivars obtained from a field experiment in Goiana, PE, Brazil Cultivar
°BRIX
TRS (g 100ml-1)
TN (mg l-1)
P (mg l-1)
K (mg l-1)
pH
IPA 467
13.0 ± 0.2 e1
10.59 ± 0.6 c
591.3 ± 70.4 c
54.4 ± 1.7 b
2808.7 ± 126.8 de
5.14 ± 0.01 c
Rio
12.7 ± 0.12 e
12.10 ± 0.7 bc
641.1 ± 52 bc
32.4 ± 1.1 f
4356 ± 425.5 b
4.73 ± 0.02 e
Tale
10.8 ± 0.2 f
10.47 ± 0.5 c
595.9 ± 36.5 c
48.5 ± 1.6 c
2390.7 ± 386 ef
5.26 ± 0.02 b
Willey
18.27 ± 0.12 a
17.28 ± 1.4 a
295.5 ± 62.2 d
37.2 ± 1.9 e
5729.2 ± 292.7 a
5.10 ± 0.02 c
Wray
16.3 ± 0.12 c
15.82 ± 0.4 a
737.9 ± 26.6 b
43.7 ± 0.9 d
3325.8 ± 111 cd
4.60 ± 0.02 f
BR 501
9.7 ± 0.12 g
6.39 ± 0.5 d
971.7 ± 50.5 a
24.5 ± 2.1 g
5879.6 ± 556.4 a
4.96 ± 0.02 d
BR 506
17.0 ± 0.2 b
16.48 ± 0.4 a
727.1 ± 15.8 bc
54.2 ± 0.6 b
3726.3 ± 200.5 bc
5.11 ± 0.01 c
SF 15
13.6 ± 0,2 d
13.34 ± 0.5 b
916.4 ± 54.4 a
84.2 ± 1.8 a
1726.6 ± 168.6 f
5.41 ± 0.02 a
Mean
13.9
12.81
681.2
47.4
3742.9
5.1
CV (%)
1.2
5.5
7.2
3.3
8.6
0.3
n=3 ± std. deviation 1: Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05); TRS – total reducing sugars; TN – total nitrogen.
163 Table 2 Kinetic parameters in the static fermentation of the juices from different cultivars of sweet sorghum at 33 °C using industrial yeast (pure milk) obtained from the Japungú distillery, PB, Brazil Cultivar
P (g l-1)
Qp(g l-1h-1)
Yp/s
IPA 467
52.10 ± 0.7 cd*
8.68 ± 0.12 cd
0.49 ± 0.03 a
Rio
50.83 ± 3.6 cd
8.47 ± 0.59 cd
0.42 ± 0.04 bc
Tale
45.60 ± 2.3 d
7.60 ± 0.38 d
0.44 ± 0.02 abc
Willey
64.77 ± 4.4 a
10.79 ± 0.74 a
0.44 ± 0.01 abc
Wray
59.10 ± 1.7 ab
9.85 ± 0.28 ab
0.38 ± 0.02 c
BR 501
31.00 ± 0.4 e
5.16 ± 0.07 e
0.49 ± 0.04 a
BR 506
59.07 ± 1.3 ab
9.84 ± 0.21 ab
0.40 ± 0.01 c
SF 15
54.40 ± 0.4 bc
9.07 ± 0.06 bc
0.42 ± 0.02 de
Mean
52.10
8.68
0.43
CV (%)
4.42
4.42
5.83
* n=3 ± std. deviation. P: Ethanol concentration; Q p: Ethanol volumetric productivity; Yp/s: ethanol yield in grams per gram of sugar consumed: Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05).
164
Table 3 Theoretical ethanol yield per hectare for sweet sorghum cultivars grown in Goiana, PE Cultivar
Biomass yield (Mg
SCE
CEY
(%)
(l ha-1)
ha-1)
IPA 467
26.77 ± 9.88
97.17 ± 5.40 a
1917.29 ± 825.43 bc
Rio
11.97 ± 2.20
82.95 ± 7.53 bc
948.56 ± 121.84 cd
Tale
17.57 ± 2.39
86.57 ± 1.71 abc
1305.39 ± 174.76 bcd
Willey
13.72 ± 1.71
86.60 ± 2.03 abc
1681.21 ± 154.44 bcd
Wray
22.17 ± 2.67
74.05 ± 4.02 c
2065.54 ± 224 b
BR 501
13.56 ± 0.20
96.34 ± 7.78 ab
680.95 ± 16.30 d
BR 506
20.01 ± 2.88
79.38 ± 0.72 c
2193.95 ± 383.58 ab
SF 15
35.44 ± 4.98
81.67 ± 3.35 c
3142.51 ± 428.47 a
Mean
20.15
85.59
1741.92
CV (%)
-------
5.64
21.59
* n=3 ± std. deviation. SCE: sugar-to-ethanol conversion efficiency, CEY: Calculated ethanol yield, Calculated using the equation = TRS (%) x Fresh biomass (Mg ha -1) x 6.5 x SCE x (1/0.79). Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05).
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Emmanuel Damilano Dutra
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL JULHO – 2014
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares – PROTEN do Departamento de Energia Nuclear da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de doutor em Tecnologias Energéticas e Nucleares. Área de concentração: Fontes Renováveis de Energia.
Orientador: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio de Morais Júnior
RECIFE – PERNAMBUCO – BRASIL JULHO – 2014
Catalogação na fonte Bibliotecária Margareth Malta, CRB-4 / 1198 D978a
Dutra, Emmanuel Damilano. Avaliação da produção de etanol de primeira e de segunda geração a partir da biomassa de sorgo sacarino / Emmanuel Damilano Dutra. - Recife: O Autor, 2014. 164 folhas, il., gráfs., tabs. Orientador: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes. Coorientador: Prof. Dr. Marcos Antonio de Morais Júnior. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CTG. Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Energéticas e Nucleares - PROTEN, 2014. Inclui Referências e Anexo. 1. Energia Nuclear. 2. Fontes renováveis de energia. 3. Bioenergia. 4. Culturas energéticas. 5. Biomassa. 6. Biocombustíveis. I. Menezes, Rômulo Simões Cezar. (Orientador). II. Morais Júnior, Marcos Antonio de. (Coorientador). III. Título.
UFPE
621.4837 CDD (22. ed.)
BCTG/2014-210
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO
Emmanuel Damilano Dutra
APROVADA EM: 18.07.2014
ORIENTADOR: Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior
COMISSÃO EXAMINADORA:
Prof. Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes- DEN/UFPE
Prof. Dr. Flávio Luiz Honorato Silva – Dep. Eng. Alimentos/UFPB
Prof. Dr. Cesar Augusto de Moraes Abreu – DEQ/UFPE
Profa. Dra. Katia Aparecida da Silva Aquino - IFPE
Prof. Dr. Alexandre Libânio Reis - CETENE
DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a minha mãe Claudia Helena Damilano Dutra e a meu pai Carlos Cesar Dornelles Dutra.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradecer ao Deus de todas as coisas, pois em sua sabedoria criou a dinâmica da vida, seus mistérios e desafios e sua infindável beleza. Meu forte agradecimento ao professor orientador Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes, pelos ensinamentos, pela confiança, pela oportunidade e principalmente pela amizade. Agradecimentos ao professor co-orientador Dr. Marcos Morais pela paciência e orientação durante as fases da tese. Meus agradecimentos ao CNPq pela bolsa concedida para execução deste projeto de pesquisa e ao Departamento de Energia Nuclear - UFPE. Agradecimentos ao Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste (Cetene) pelo total apoio na pesquisa e pela disponibilidade de espaço para a realização dos experimentos de fermentação, pré-tratamento e hidrólise enzimática. Ao professor Dr. Everardo Sampaio Barreto de Sá pelas conversas e valorosas sugestões. Aos colegas do Grupo de Energia da Biomassa: Júlio Cesar, Kennedy Nascimento, Tiago Althoff, Dario Primo, Mona Nagai, Eric Xavier, Samuel, Karina Guedes, Taciana e Nilson pelo companheirismo e ensinamentos. Aos colegas do Laboratório de Bioprocessos do Cetene: Alexandre Libânio companheiro de discussão e experimentos, Rafael Barros, Raquel, Aldenise e ao sempre disposto Isaac. Meus agradecimentos aos técnicos do laboratório de biomassa do DEN, Gilberto, Pedro e Claudenice pelo apoio e companheirismo nas atividades laboratoriais. Agradecimentos especiais aos alunos de iniciação científica que me apoiaram nos trabalhos de laboratório, Diogo, Janis Joplim e Pedro Paulo. A minha esposa, Rosiene Medeiros do Nascimento, todo meu reconhecimento por estar comigo nos momentos de dúvidas e dificuldades, que não foram poucos. Obrigado. Por fim a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a realização desta tese que sem dúvida é parte de uma construção coletiva.
SUMÁRIO
Pg.
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... LISTA DE TABELAS......................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS......................................................... RESUMO.............................................................................................................. ABSTRACT.......................................................................................................... INTRODUÇÃO....................................................................................................
18
CAPÍTULO I........................................................................................................
21
1.
INTRODUÇÃO........................................................................................
24
2.
ASPECTOS GERAIS DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO....
26
3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO...........................................................................................................
29
4. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO SORGO SACARINO............................................................................................................
35
5. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DOS GRÃOS DO SORGO SACARINO..............................................................................................................
38
6. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO BAGAÇO E DAS FOLHAS DO SORGO SACARINO......................................................................
39
7. BIOMASSA DE SORGO SACARINO COMO MATÉRIA-PRIMA PARA BIORREFINÁRIAS.....................................................................................
41
8.
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................
43
9.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................
44
CAPÍTULO II:..........................................................................................................
50
1.
INTRODUÇÃO.............................................................................................
53
2. COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA E SEUS PRODUTOS DE HIDRÓLISE................................................................................
56
3. ABORDAGEM SOBRE A QUÍMICA DO PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 EM MEIO ALCALINO.......................................................................
58
4. PRINCIPAIS VARIÁVEIS QUE AFETAM O PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2.................................................................................................................
62
5. ESTUDOS COMPARATIVOS DE PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 ALCALINO...............................................................................................................
67
6. PRINCIPAIS DESAFIOS DO USO EM LARGA ESCALA DO H2O2 ALCALINO PARA PRÉ-TRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA............................................................................................
69
7.
CONSIDERAÇÕES FINAIS.......................................................................
71
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
72
CAPÍTULO III.........................................................................................................
75
1.
INTRODUÇÃO............................................................................................
78
2.
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
80
2.1 Obtenção da biomassa de sorgo sacarino e caracterização dos caldos.............................................................................................................
80
2.2 Ensaios de fermentação..........................................................................
80
2.3 Produção de etanol calculada..................................................................
81
2.4 Análises estatísticas.................................................................................
82
RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................
83
3.1 Caracterização química dos caldos..........................................................
83
3.2 Fermentação alcoólica dos caldos e produção de etanol por hectare............................................................................................................
85
4.
CONCLUSÕES.............................................................................................
89
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
90
CAPÍTULO IV.........................................................................................................
93
1.
INTRODUÇÃO............................................................................................
96
2.
MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
98
2.1 Experimento de campo............................................................................
98
2.2 Caracterização dos caldos das cultivares................................................
98
2.3 Caracterização dos bagaços das cultivares.............................................
99
2.4 Fermentação dos caldos..........................................................................
99
2.5 Pré-tratamento e hidrólise enzimática dos bagaços................................
100
2.6 Fermentação dos hidrolisados...............................................................
101
2.7 Análises estatísticas..............................................................................
101
RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................
102
3.1 Experimento de campo.........................................................................
102
3.
3.
3.2 Caracterização inicial e fermentação dos caldos..................................
103
3.3 Pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados.................................................................................................
106
4.
CONCLUSÕES..........................................................................................
111
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................
112
CAPÍTULO V:......................................................................................................
116
1.
INTRODUÇÃO.........................................................................................
118
2.
MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................
121
2.1 Biomassa.............................................................................................
121
2.2 Pré-tratamento....................................................................................
121
2.3 Hidrólise Enzimática..........................................................................
121
2.4 Ensaios de fermentação em bancada..................................................
122
2.5 Hidrólise e fermentação em biorreator...............................................
123
2.6 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR).......................................................................................................
123
2.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)......................................
123
2.8 Difratometria de raios x (DRX)..........................................................
124
2.9 Métodos analíticos...............................................................................
124
2.10 Análises estatísticas...........................................................................
125
RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................
126
3.1 Caracterização da biomassa lignocelulósica pré-tratada.....................
126
3.2 Análise de deslignificação dos bagaços por FTIR, MEV/EDS e DRX...........................................................................................................
129
3.3 Fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis..............................
134
4.
CONCLUSÕES........................................................................................
139
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................
140
CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................
144
ANEXO I ……………………………………………………………………..
145
3.
LISTA DE FIGURAS Capítulo 1
Pg.
Figura 1
Composição da biomassa de sorgo sacarino de cultivares plantadas no Nordeste do Brasil............................................................................
Figura 2
Composição química da biomassa de sorgo sacarino IPA 467 em função do método de caracterização. Os bagaços são oriundos de experimentos diferentes e em épocas de colheitas diferentes...............................................................................................
Figura 3
Perfil de decomposição de açúcares redutores totais do caldo de sorgo sacarino em função da temperatura de estocagem. T1: 4 °C, T2: 25 °C e T3: 45 °C............................................................................
Capítulo 2 Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
29
34
36
Pg. Vista geral do crescimento de publicações com o uso do prétratamento H2O2 alcalino para diferentes tipos de biomassas lignocelulósica. Fonte: ISI web of knowledge termo de busca “Alkaline hydrogen peroxide pretreatment”.......................................
54
Mudanças na morfologia da palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino (1% H2O2, pH 11,5, temperatura ambiente por 24 h): a) palha de trigo moída sem pré-tratamento (100x); b) palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino após secagem à 100 °C por 24 h (100x); c) palha de trigo pré-tratada com H2O2 desidratada em etanol e seca no ponto crítico (200x); e d,e) aumento da amostra vista na imagem c em dois cortes, as setas mostram a separação das fibras de celulose. Adaptado de Gould (1985)....................................................
61
Influência da concentração de sólidos totais no pré-tratamento da palha de milho com peróxido de hidrogênio (24 h, 0,5 g H2O2/g biomassa) na eficiência de conversão de celulose em glicose. A biomassa pré-tratada foi neutralizada e diluída a 0,2 % glucana e digerida enzimaticamente com Accellerase 1000 (15 mg/g glucana) por 48h. Fonte: Adaptado: Banerjee et al. (2011)................................
62
Efeito do tempo de duração da reação de pré-tratamento com H2O2 alcalino (2,15% m/v H2O2, pH 11,5) na biomassa de palha de trigo (8,6 % m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 120 h). Fonte: Adaptado Saha e Cotta, 2006.....................................................
63
Efeito da concentração de H2O2 em solução para o pré-tratamento (pH 11,5, 35 °C, 24 h) da casca de arroz (15,0% m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 72 h, 0,4 mL de cada preparação enzimática. g de casca de arroz-1). Adaptado de Saha e Cotta, 2007............................................................................................
64
Figura 6
Efeito do valor inicial do pH na reação de pré-tratamento da biomassa de kenaf (1% H2O2, 2% sólidos totais (m/v), 25 °C por 24 h). Adaptado: Gould, 1985...................................................................
Capítulo 3
Pg.
Figura 1
Correlação entre o °Brix e os teores de açúcares redutores totais (ART) para os caldos das cultivares de sorgo sacarino.......................
Figura 2
Correlação entre os teores de açúcares redutores totais (ART) e as concentrações de etanol nos caldos fermentados das cultivares de sorgo sacarino.......................................................................................
Capítulo 4 Figura 1
Figura 2
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
84
87 Pg.
Teores de °Brix em função da época de colheita dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas no experimento de campo. Valores para n=4, MG: Média geral para a fase colheita dos colmos, Letras iguais nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, CV(%)= 17,20..................................... Perda de massa durante a etapa de pré-tratamento do bagaço de diferentes cultivares de sorgo sacarino com H2O2 (40 g.L-1 substrato, 7,5 % H2O2, pH 11,5, 1h, temperatura ambiente). Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade......................................
Capítulo 5 Figura 1
65
102
108
Pg. Espectros de FTIR para amostras de bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino pré-tratadas com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.......................................................
130
Espectros de FTIR para amostras de bagaço de sorgo sacarino prétratadas com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...........................................................................................
130
Difratogramas de raios X para amostras de bagaço de cana-de-açúcar “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólidolíquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...................................................................
132
Difratogramas de raios x para amostras de bagaço de sorgo sacarino “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólidolíquido, 25 °C, 1h, 150 rpm...................................................................
132
Imagens de MEV para amostras de bagaço de cana-de-açúcar in natura (a) e após pré-tratamento (b) e sorgo sacarino in natura (c) e após pré-tratamento (d). Pré-tratamento com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm......................................
133
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Aspecto fermentativo de D. bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas........................................... Aspecto fermentativo de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de sorgo sacarino, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas.............................................................................................. Cinética de fermentação de Dekkera/Brettanomyces bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em reator de bancada. Os valores representam a média de duplicatas......................
135
136
138
LISTA DE TABELAS Capítulo 1
Pg.
Tabela 1
Potencial de produção de biomassa de sorgo sacarino no semiárido do NE do Brasil no ano de 2010.......................................................
27
Tabela 2
Composição de açúcares presentes em algumas cultivares de sorgo sacarino..............................................................................................
30
Tabela 3
Teores de macro e micronutrientes no caldo da cultivar de sorgo sacarino KKU 40...............................................................................
31
Tabela 4
Composição química do bagaço de sorgo para diferentes cultivares...........................................................................................
33
Capítulo 2
Pg.
Tabela 1
Conteúdos de celulose, hemicelulose e lignina comumente reportados para as principais biomassas lignocelulósicas................
57
Tabela 2
Eficiências de hidrólise enzimática reportados para diferentes tipos de biomassas pré-tratadas com H2O2 alcalino...................................
59
Tabela 3
Efeito da temperatura na solubilização de lignina e hemicelulose (% matéria seca) presentes na biomassa de palha de centeio prétratada com H2O2 (2%, pH 11,5 por 12 h). Adaptado: Sun et al. (2000)................................................................................................
Capítulo 3 Tabela 1
Tabela 2
Tabela 3
65
Pg Caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino obtidas de experimento de campo no município de Goiana – PE......................................................................................
83
Parâmetros cinéticos na fermentação estática de diferentes caldos de cultivares de sorgo sacarino utilizando fermento industrial (leite puro) obtida na destilaria Japungú, PB à 33 °C..............................
86
Produção teórica de etanol por hectare para as cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Goiana, PE.............................
Capítulo 4
88
Pg.
Tabela 1
Caracterização inicial dos caldos das cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Itambé-PE.............................................
Tabela 2
Parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das cultivares de
104
sorgo sacarino, condição estática, 6h, 33°C......................................
105
Tabela 3
Composição química do bagaço in natura e após pré-tratamento com H2O2 de diferentes cultivares de sorgo sacarino.......................
107
Tabela 4
Eficiências de hidrólise enzimática para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino, 10 FPU/g bagaço, 50°C, pH = 4,8, 48h.....................................................................................................
109
Tabela 5
Parâmetros cinéticos da fermentação dos hidrolisados de diferentes cultivares de sorgo sacarino com D. bruxellensis, 32°C, 7h, condição estática...............................................................................
110
Capítulo 5
Pg.
Tabela 1
Teores de celulose, hemicelulose e lignina em detergente ácido no bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de sorgo sacarino in natura e após o pré-tratamento (base seca).....................................................
127
Tabela 2
Perda de massa durante o pré-tratamento com H2O2 e teores de açúcares e perda de massa após a hidrólise enzimática (48h) da biomassa de BC e BS........................................................................
128
Tabela 3
Parâmetros cinéticos para a fermentação dos hidrolisados da biomassa de BC e BS por D. bruxellensis com tempo de 7h............
134
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BEN: Balanço energético nacional IPA: Instituto Agronômico de Pernambuco DNSA: Ácido dinitrosalicílico ANOVA: Análise de variância EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecuária CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística NREL: National Renewable Laboratory LDA: Lignina detergente ácido CONAB: Companhia Nacional de Abastecimento N-FAN: Nitrogênio Free Amino Nitrogen CE: Condutividade elétrica TAPPI: Techinical Association of the Pulp and Paper Industry ART: Açúcares redutores totais SST: Sólido solúveis totais APPS: Associação paulista de produtores de sementes e mudas FTIR: Espectrometria de infravermelho com transformada de Fourrier MEV: Microscopia eletrônica de varredura DRX: Difratometria de raios-x °C: Graus Celsius g: Grama RPM: rotação por minuto ha: hectare h: hora L: Litro mL: mililitro pH: Potencial hidrogeniônico
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ETANOL DE PRIMEIRA E DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO Autor: Emmanuel Damilano Dutra Orientador: Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientado: Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior
RESUMO Com um cenário de aumento populacional, crescente demanda de energia e degradação ambiental, torna-se necessário a inserção de fontes energéticas renováveis para suprir a crescente demanda de energia. Dentre as fontes renováveis, a energia da biomassa é uma das mais promissoras, pois apresenta potencial para produção de diversos biocombustíveis, como etanol, biogás e biodiesel, além de uma gama variada de produtos químicos e energia. No entanto, a aptidão para a produção de energia a partir da biomassa pode ser afetada em zonas com reduzidas disponibilidades de água, uma vez que culturas energéticas tradicionais demandam grandes quantidades de água por unidade de biomassa produzida. Nesse contexto, o estudo de plantas com alta eficiência hídrica torna-se fundamental para produção de energia de forma sustentável. O sorgo sacarino é uma cultura energética com potencial para a produção de biocombustíveis com elevada eficiência hídrica e baixo consumo de insumos a partir de diferentes frações da biomassa. O caldo é rico em açúcares prontamente fermentescíveis como a sacarose, glicose e frutose, que são facilmente transformados em etanol pelas leveduras industriais. O bagaço, que é o subproduto da extração do caldo dos colmos do sorgo, é rico em carboidratos insolúveis como a celulose e a hemicelulose, que podem produzir etanol após etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática ou ácida. Nesse contexto, o objetivo deste projeto foi avaliar a utilização da biomassa de sorgo sacarino para a produção de etanol, na zona da mata norte de Pernambuco. Para isso foram executados experimentos de produção de etanol a partir do caldo e do bagaço após pré-tratamento e hidrólise enzimática de cultivares de sorgo sacarino, oriundas de experimento de produção de biomassa em campo experimental. Em relação ao etanol de primeira geração foram observadas altas variabilidades na produção de açúcares e etanol para as diferentes cultivares avaliadas, com destaque para as cultivares SF15 e BR 506 com potenciais de produção de etanol em 3142 e 2194 L.ha-1. Em relação ao etanol de segunda geração, não houve diferença na composição química entre as cultivares e o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino foi eficiente para remover lignina sob reduzido tempo e baixo consumo de energia e obter eficiências de hidrólise enzimática entre 60 a 88% e fermentação dos hidrolisados entre 70 a 85% em função da glicose. A levedura D. bruxellensis demonstrou ser um micro-organismo promissor para fermentação dos hidrolisados. Análises estruturais confirmaram o efeito do prétratamento nos bagaços de sorgo. Os resultados obtidos indicam o potencial de uso da biomassa de sorgo sacarino para aumentar a produção de etanol na região Nordeste do Brasil. Palavras-chave: Fontes Renováveis de Energia; Bioenergia, Culturas energéticas, Biomassa, Biocombustíveis.
EVALUATION OF THE PRODUCTION OF FIRST AND SECOND GENERATION ETHANOL FROM SWEET SORGHUM BIOMASS Autor: Emmanuel Damilano Dutra Orientador: Dr. Rômulo Simões Cezar Menezes Co-orientado: Dr. Marcos Antonio de Moraes Júnior ABSTRACT With a scenario of population growth, increasing energy demand and environmental degradation there is need to increase the generation of renewable energy sources to provide the energy needs of society. Among the renewable sources, the energy of biomass is one the most promising because it can produce several biofuels like biogas, biodiesel and ethanol, besides a series of chemical products and energy. However, the aptitude for the production of energy from the biomass can be drastically affected in zones with reduced water availability, since traditional energy crops demand great quantities of water per unity of biomass produced. In this context, the study of crops with high water use efficiency is important for the production of sustainable energy. Sweet sorghum is an energy crop with potential for the production of biofuels with high water efficiency and low consumption of inputs. The biofuels may be produced from different fractions of the biomass of sorghum. Juice is rich in readily fermentable sugar like sucrose, glucose and fructose which are easily transformed in ethanol by the industrial yeasts. The bagasse that is the by-product of the extraction of the juice of the stems of sweet sorghum is rich in insoluble carbohydrates like cellulose and the hemicellulose, which can produce ethanol after stages of pretreatment and enzymatic or acid hydrolysis. In this context, the aim of this work was to evaluate the use of sweet sorghum biomass for ethanol production in the Atlantic Forest Zone of Pernambuco. For this reason, experiments were conducted for the ethanol production from juice and bagasse after pretreatment and enzymatic hydrolysis of sweet sorghum cultivars originated from field experiments. In relation to ethanol from first generation we observed high variability in the production of sugar and ethanol for the different cultivars evaluated, with highlight to cultivars SF 15 and BR 506 with potential for ethanol production of 3142 and 2194 L.ha-1, respectively. In relation to second-ethanol generation, there were no differences in chemical composition among cultivars and the pretreatment with H2O2 in alkaline medium was efficient to remove lignin under reduced time and low energy consumption. This pretreatment presented efficiencies of enzymatic hydrolysis between 60 to 85% and hydrolyzed fermentation between 70 to 85% based in glucose conversion. The yeast D. bruxellensis proved to be a promising micro-organism for fermentation of hydrolysates. Ultra structural analysis has confirmed the effect of pretreatment in the sweet sorghum bagasse. The results indicated the potential of sweet sorghum biomass to increase the ethanol production in the Northeastern region of Brazil. Keywords: Renewable energy sources, Bioenergy, Energy crops, Biomass, Biofuels,
18 INTRODUÇÃO Com uma população estimada em aproximadamente 9 bilhões de pessoas no ano de 2050 (Lutz et al., 2001), aumentará a pressão na demanda de energia, atualmente suprida em cerca de 83% por materiais de origem fóssil (Goldemberg, 2009). O aumento no uso destes materiais poderá ocasionar forte diminuição nos recursos energéticos não renováveis e ainda magnificar o efeito estufa acarretando mudanças climáticas que podem afetar o ecossistema terrestre, em especial a disponibilidade de água. Neste cenário fica evidente a necessidade de inserção de novas alternativas para suprir, em parte, as necessidades energéticas da humanidade de uma forma mais sustentável, como as fontes renováveis de energia. Dentre as fontes renováveis de energia, destacam-se a hidrelétrica, solar, eólica, geotérmica, energia das ondas e a biomassa. Fortes investimentos em pesquisa e desenvolvimento tecnológico têm sido realizados em todo o mundo para viabilizar o uso destas fontes de energia, em especial a energia da biomassa. Como parte destes esforços, surgiu o conceito de biorrefinaria, que tem como objetivo central a aplicação de métodos e processos com o intuito da utilização integral das matérias-primas e dos resíduos do processo, com diminuição das emissões de gases de efeito estufa durante o ciclo de vida dos produtos gerados neste conceito (Bastos, 2007; Rodrigues, 2011). No Brasil, o uso intensivo da biomassa para geração de energia é uma realidade desde a década de 70, quando o programa governamental (Proálcool) estimulou a substituição de derivados fósseis por biocombustíveis. Atualmente, a biomassa responde por aproximadamente 29% da matriz energética nacional e o país é exemplo de matriz energética limpa e renovável com 42 % da oferta interna de energia renovável (BEN, 2013). Os principais biocombustíveis produzidos no país são o etanol e o biodiesel. O etanol é produzido quase que exclusivamente a partir da sacarose da cana-de-açúcar e o biodiesel a partir de óleos vegetais, principalmente óleo de soja, de algodão e gorduras animais. Em algumas regiões do Brasil a limitação hídrica afeta diretamente a viabilidade de culturas agrícolas energéticas tradicionais, como cana-de-açúcar e soja. Como por exemplo, a zona da mata norte no nordeste brasileiro, onde a produção da cana-deaçúcar depende de irrigação para alcançar elevadas produtividades. Com a limitação hídrica atual e com cenário de possíveis reduções das precipitações como consequência de mudanças climáticas, torna-se evidente a necessidade de pesquisas com culturas
19 agrícolas que tenham alta eficiência na produção de biomassa com menor exigência hídrica. O sorgo sacarino apresenta-se com potencial, uma vez que produz biomassa com alta eficiência fotossintética e menor exigência hídrica que a cana e adapta-se bem em diferentes condições de solo e clima (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). A utilização da biomassa de sorgo sacarino para produção de biocombustíveis está centrada em três tecnologias principais: 1) fermentação direta dos açúcares presentes no caldo dos colmos; 2) hidrólise enzimática do amido presente nas panículas e fermentação dos hidrolisados e 3) aproveitamento do material lignocelulósico presente no bagaço, após pré-tratamento, hidrólise e fermentação dos açúcares liberados para a produção de etanol. Em cada uma destas rotas tecnológicas, ainda são necessários esforços para aprimorar os processos para maiores produções de etanol a partir da biomassa do sorgo. Na fermentação direta dos açúcares do caldo, maiores eficiências ainda são buscadas, com investigações que vão desde novos micro-organismos até a influência da qualidade da matéria-prima como excesso ou falta de nutrientes. Na produção de etanol a partir dos grãos, melhoras nas eficiências de hidrólise enzimática e também na fermentação ainda são possíveis de acontecer com design de novos processos (Viikary et al., 2012). No aproveitamento do bagaço para produção de etanol estão os maiores gargalos do ponto de vista tecnológico e ambiental, uma vez que existe uma gama variada de prétratamentos que podem ser usados para aumentar as taxas de hidrólise enzimática. Prétratamentos que demandem baixo consumo de energia e não gerem inibidores para os processos biológicos são preferíveis para o processo. Melhorias na etapa de hidrólise enzimática e fermentação também ainda são desafios para esta tecnologia. Neste contexto o objetivo geral desta tese foi avaliar a utilização da biomassa de sorgo sacarino com cultivares tradicionalmente cultivadas na região Nordeste do Brasil para a produção de etanol. Para atingir tal objetivo a tese foi organizada em 5 capítulos que abrangem diferentes abordagens para o uso da biomassa de sorgo. No capítulo 1, intitulado “Potencial de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino no Nordeste do Brasil: Desafios e oportunidades” é apresentada uma discussão sobre o potencial de produção de etanol com a biomassa de sorgo sacarino a partir de diferentes frações da planta, como caldo, grãos, bagaço e folha. São apresentadas as principais tecnologias existentes dos processos de conversão e discutidos os principais gargalos para o cultivo do sorgo na região Nordeste do Brasil. No capítulo 2, “Aplicação do peróxido de hidrogênio no pré-tratamento de biomassa” é apresentada uma revisão sobre o uso do pré-tratamento com H2O2 para
20 diferentes tipos de biomassas e as principais características que fazem do seu uso um pré-tratamento eficiente e com baixo consumo de energia. Também são discutidos os efeitos das principais variáveis do processo de pré-tratamento e os desafios para tornar este pré-tratamento viável em nível industrial. O capítulo 3, “Produção de etanol a partir do caldo do colmo de diferentes cultivares de sorgo sacarino em Pernambuco, Nordeste do Brasil”, enfoca o potencial de produção de etanol de cultivares de sorgo sacarino cultivadas em área de reduzida precipitação na zona da mata de Pernambuco. Este trabalho aborda apenas a produção de etanol a partir do caldo das diferentes cultivares. No capítulo 4, “Produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de cinco cultivares de sorgo sacarino”, é abordada a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de cinco cultivares de sorgo sacarino em região de reduzida precipitação da zona da mata de Pernambuco. Neste capítulo foi possível determinar a melhor época de colheita dos colmos para as diferentes cultivares avaliadas. Para finalizar, no capítulo 5, “Produção de etanol de segunda geração a partir do bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino por Dekkera bruxellensis GDB 248”, foi comparada a produção de etanol dos bagaço de sorgo sacarino e cana-de-açúcar com micro-organismo com capacidade para fermentar celobiose e glicose.
21 CAPÍTULO I
POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO NO NORDESTE DO BRASIL: DESAFIOS E OPORTUNIDADES
22
POTENCIAL DE PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO NO NORDESTE DO BRASIL: DESAFIOS E OPORTUNIDADES
RESUMO O sorgo sacarino é uma cultura energética com potencial para a produção de etanol a partir de diferentes frações da biomassa. O caldo é rico em açúcares diretamente fermentescíveis facilmente transformados em etanol pelas leveduras industriais. Os grãos são ricos em amido que podem ser fermentados a etanol após a hidrólise enzimática ou ácida. O bagaço é rico em açúcares insolúveis como a celulose e as hemiceluloses, que podem produzir etanol após hidrólise enzimática ou ácida. A fim de avaliar o potencial de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino na região nordeste, principalmente em área de reduzida precipitação pluviométrica, foram reunidas informações referentes à produção de etanol a partir do caldo, dos grãos e do bagaço de sorgo sacarino. A utilização integral da biomassa de sorgo sacarino pode gerar 6730 L.ha-1, sendo os principais desafios tecnológicos relacionados com o melhoramento das cultivares com características sacarinas no aumento das produtividade de biomassa e nos teores de açúcares, com otimizações de processos nos três eixos de produção (caldo, grãos e bagaço) para melhorar as eficiências de conversão de açúcares em etanol e desenvolvimento de processos de aproveitamento integral da biomassa de sorgo sacarino. Palavras-chave:
Bioenergia,
Culturas
enzimática, Etanol lignocelulósico
energéticas,
Biocombustíveis,
Hidrólise
23 ABSTRACT The sweet sorghum is a energy crop with potential for ethanol production from different fractions of the plant. The juice is rich in readily fermentable sugars, such as sucrose, glucose and fructose, which are easily processed into ethanol by industrial yeasts. The grains are rich in starch that can be fermented by ethanol after enzymatic or acid hydrolysis. The bagasse, the by-product of the extraction of juice from sorghum stalks, is rich in insoluble sugars like cellulose and hemicelluloses, which can produce ethanol after steps of pretreatment and enzymatic or acid hydrolysis. In order to evaluate the potential of ethanol production from sweet sorghum biomass in Northeastern Brazil, particulary in the areas of reduced rainfall, this review aimed at gathering information available in the literature regarding the production of ethanol from juice, grains and bagasse of sweet sorghum. The results indicate that the integral utilization of the sweet sorghum biomass can generate about 6730 L.ha-1 of ethanol. The main technological challenges are related to the improvement of cultivars with high sugar content, with optimizations in the three axes of processes (Juice, grains and bagasse) of ethanol production and integrative processes of full exploitation of sweet sorghum biomass. Key words: Bioenergy, Energy crops, Enzymatic Hydrolysis, Lignocellulosic ethanol.
24 1. INTRODUÇÃO A produção de biocombustíveis a partir de fontes renováveis está aumentando no mundo. Como uma medida para substituir os combustíveis de origem fóssil e diminuir as emissões de gases poluentes que podem causar mudanças climáticas. Os principais biocombustíveis produzidos são biodiesel, biogás e etanol. O etanol é produzido a partir de carboidratos como a sacarose e o amido, sendo a cana-de-açúcar e o milho as principais culturas energéticas para sua produção (Sánchez e Cardona, 2008). A escolha da matéria-prima para a produção do etanol depende das condições ambientais da região. No Brasil, predomina o cultivo da cana-de-açúcar, porém em algumas regiões do país a limitação hídrica afeta diretamente a viabilidade de culturas agrícolas energéticas tradicionais. Como exemplo, a zona da mata no nordeste brasileiro, onde a produção da cana-de-açúcar depende de irrigação para uma adequada produção e o semiárido nordestino onde não há cultivo de culturas energéticas. Com a limitação hídrica atual e com cenário de possíveis reduções das precipitações como consequência de mudanças climáticas, torna-se evidente a necessidade de pesquisas com culturas agrícolas desenvolvidas para elevada produção de biomassa com menor exigência hídrica, como sorgo sacarino (Rooney et al., 2007). O sorgo sacarino é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol, e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilakoglou et al., 2011). É uma gramínea com ciclo fotossintético C4, cultivada em vários países distribuídos nas diferentes regiões do globo (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). É originário da África, sendo domesticado na Etiópia, cerca de 5.000 anos atrás. O sorgo granífero é o quinto cereal mais cultivado no mundo (40 milhões de hectares em 2009, Kumar et al., 2011). Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005), ração e fibras (Murray et al., 2008). Como principais características destacam-se a eficiência no uso de água (1/3 da canade-açúcar e 1/2 do milho) e bom desenvolvimento em diferentes condições edafoclimáticas. Em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos rico em amido e 50 t ha-1 de colmos rico em açúcares solúveis como sacarose, glicose e frutose (Wu et al., 2010) no caldo e carboidratos insolúveis (celulose e hemicelulose) no bagaço gerado após extração do caldo. A produção de etanol a partir das diferentes frações da planta de sorgo sacarino varia em função das cultivares, das condições edafoclimáticas e dos tipos
25 de tecnologias utilizadas nos processos de conversão. De uma forma geral a produção de etanol a partir do caldo situa-se em aproximadamente 3450 L.ha-1 (Prasad et al., 2007), do amido em 800 L.ha-1 (Zhao et al., 2009) e da fração celulósica + hemicelulósica do bagaço em 5400 L.ha-1 (Zhao et al., 2009). Apesar da retomada com as pesquisas no desenvolvimento do sorgo sacarino como matéria-prima para geração de biocombustíveis no Brasil e no mundo, na região Nordeste do Brasil ainda são incipientes as informações acerca desta cultura para fins energéticos. Esforços do IPA no desenvolvimento e melhoramento de cultivares de sorgo forrageiro-sacarino na região datam da década de 70, obtendo principalmente informações referentes à produção de biomassa e eficiência de uso de água e nutrientes (Tabosa et al., 2009). No contexto da retomada dos estudos com biomassas avaliadas em décadas passadas, o objetivo desta revisão foi reunir informações referentes à utilização da biomassa do sorgo sacarino como matéria-prima para a produção de etanol a partir das diferentes frações da biomassa, com foco principal na região Nordeste do Brasil. Além disso, pretende-se discutir as principais dificuldades da implantação desta cultura e as novas perspectivas do ponto de vista das biorrefinarias.
26 2. ASPECTOS GERAIS DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO O sorgo é uma cultura agrícola de importância indiscutível para os seres humanos. Desde os primórdios da civilização, o homem tem domesticado e trabalhado esta cultura para produção de alimentos. Atualmente, o sorgo granífero é o quinto cereal em área cultivada no mundo e estima-se que 40 milhões de hectare sejam cultivados anualmente (Kumar et al., 2011). O sorgo é uma cultura de colmos longos que pode atingir altura entre 0,6 a 6 m, cada colmo produzindo folhas e panícula que da sustentação às sementes. Possui ciclo fotossintético do tipo C4, sendo inicialmente o que lhe confere maior eficiência fotossintética e uso da água que culturas de ciclo C3. É uma cultura de ciclo curto, quatro meses, e que se propaga através de sementes, além de ter bom desenvolvimento em uma gama variada de solos e clima. O sorgo pode ser divido em quatro grandes grupos, cada um com suas características de uso: 1) granífero, tipo de sorgo com porte baixo e alta produtividade de panículas ricas em amido, utilizado principalmente na alimentação humana e animal; 2) forrageiro, tipo de sorgo com elevada produção de biomassa e açúcares estruturais como celulose e hemicelulose, sendo principalmente utilizado como forragem e para a produção de silagem; 3) fibroso, tipo de sorgo de porte alto e alongado como colmos ricos em celulose e hemicelulose e pequena fração (20%) de açúcares não estruturais, tendo aplicação na área de produção de celulose e 4) sacarino, tipo de sorgo com porte alongado e rico em carboidratos não estruturais como sacarose, glicose, frutose e estruturais (celulose e hemicelulose) (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012), sendo o grupo de maior potencial para produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. No Brasil, os dados oficiais indicam o cultivo de 1.270.013 hectares (APPS, 2012), sendo 935.443 ha de sorgo granífero e 334.520 ha de sorgo forrageiro sem índices para sorgo sacarino. Cabe destacar, que estes valores correspondem a comercialização de sementes híbridas, sendo considerado que cada 10 kg de semente equivale a 1 ha plantado e que as áreas cultivadas com cultivares locais não estão contempladas. As regiões sudeste e centro-oeste são as maiores produtoras. Na região Nordeste do Brasil cultiva-se principalmente o sorgo forrageiro para produção de silagem para alimentação animal na região semiárida, mas recentemente tem-se buscado cultivares do tipo sacarino para a produção de etanol (Dutra et al., 2013). Grande parte dos dados relatados para a região Nordeste do Brasil indicam produtividades de
27 biomassa variadas dentro das mesorregiões específicas e sobre manejos diferentes. Na mesorregião semiárida, dados de cultivares sacarina apontam baixas produtividades influenciadas por fatores edafoclimáticos (Tabela 1). Na mesorregião de zona da mata, produtividades maiores são documentadas (Tabosa et al., 2002). Mas quando manejado adequadamente com adubação química e orgânica e sob regime de irrigação durante o ciclo de cultivo, a cultivar SF 15 pode atingir níveis máximos de produtividade de biomassa de 194 t.ha-1 (Tabosa et al., 2013). TABELA 1. Potencial de produção de biomassa de sorgo sacarino no semiárido do NE do Brasil no ano de 2010. Cultivares*
Mg.ha-1
IPA 467-4-2
8,59
SF 11
8,31
IPA 8602600
5,53
IPA 8602589
5,22
1011
5,16
T07
10,60
IPA SF 25
11,77
T 17
11,74
IPA 8602571
6,82
BR 506
6,04
SF 15
8,23
IPA 2502
5,56
*média para três regiões semiáridas do Nordeste em três tipos de solos diferentes. Fonte: IPA (2012).
Em um estudo na região semiárida, Lima et al. (2010), objetivando selecionar, incorporar e adaptar novas tecnologias/cultivares de sorgo sacarino, mais tolerantes às condições climáticas adversas, avaliaram 12 cultivares, oriundas do Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA de PE. Os resultados de produtividade de biomassa apresentaram amplitude de mais de 40 t ha-1 de biomassa, entre a variedade mais produtiva (SF-15 com 60,77 t ha-1) e a variedade menos produtiva (WILLEY com 19,70 t ha-1), mostrando assim, a variabilidade genética entre os materiais. Souza et al. (2005), avaliando a cultivar IPA 467 em condição de irrigação e adubação orgânica e mineral,
28 obtiveram produtividades de massa verde total de 64 t ha-1, e das frações colmo e folhas de 46 t ha-1 e 18 t ha-1, respectivamente. Concluíram que as características agronômicas apresentadas pela cultura do sorgo indicam a sua potencialidade como grande produtor de biomassa, sementes e folhas, elevada capacidade de rendimento de colmos, alta percentagem de extração de caldo e alto conteúdo de sólidos solúveis totais, similar ao da cana-de-açúcar. Além da região Nordeste, dados de desempenho de produção de biomassa em diferentes regiões do Brasil são reportados por Parrella (2010), que avaliou o desempenho de 25 cultivares de sorgo sacarino em diferentes regiões edafoclimáticas visando a produção de etanol e observou que as cultivares diferiam geneticamente quanto a altura de planta, produção de biomassa verde e sólidos totais no caldo extraído dos colmos, com cultivares variando de 2,57 a 3,09 m, 38,13 a 54,56 t ha-1 e 13,99 a 20 °Brix. Apesar da grande variabilidade para a produção de biomassa, o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol está centrada em três tecnologias principais: 1) fermentação direta dos açúcares presentes no caldo dos colmos; 2) hidrólise enzimática do amido presente nas panículas e fermentação dos hidrolisados e 3) aproveitamento do material lignocelulósico presente no bagaço, após pré-tratamento, hidrólise e fermentação dos açúcares liberados para a produção de etanol.
29 3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DA BIOMASSA DE SORGO SACARINO A biomassa de sorgo sacarino com potencial para a produção de biocombustíveis é composta de colmos, folhas, caldo e grãos. A proporção de cada componente varia de acordo com a cultivar avaliada, mas a maior fração é composta de colmos, seguida de folhas e grãos (Figura 1). O caldo é composto de sacarídeos simples como glicose e frutose e dissacarídeos como a sacarose. Estes açúcares são prontamente fermentescíveis pela maioria das leveduras industriais como as da espécie S. cerevisiae. Em algumas cultivares de sorgo sacarino também são relatadas pequenas frações de amido (Barcelos, 2012). A composição dos açúcares pode variar fortemente com o tipo de cultivar avaliada (Tabela 2), bem como com o local de cultivo e a época de colheita dos colmos (Teetor et al., 2011).
Figura 1: Composição da biomassa de sorgo sacarino de cultivares plantadas no Nordeste do Brasil.
30
Tabela 2: Composição de açúcares presentes em algumas cultivares de sorgo sacarino. Cultivar
Sacarose (%)
Glicose (%)
Frutose (%)
Açúcares totais (g/L)
Referência
Berény
62,5
21
16,5
120
Sipos et al. (2009)
Wray
92
6,7
1,3
150
Teetor et al. (2011)
Rio
14,9
47,9
37,2
121
Davila-Gomez et al. (2011)
M81E
70
20
10
154
Wu te al. (2010)
KKU40
71,7
12,1
9,7
161,7
Laopaiboon et al. (2009)
Apesar da tradição no cultivo de sorgo no nordeste brasileiro ainda são escassas as informações quanto à composição de açúcares em termos de sacarose, glicose e frutose dos caldos das principais cultivares usadas na região. O conhecimento dos açúcares presentes no caldo é importante, pois caracteriza a cultivar de sorgo para a produção de açúcar ou exclusivamente para a produção de biocombustíveis e outros produtos. Uma cultivar largamente plantada em várias regiões do pais, inclusive no Nordeste, como a BRS 506, apresenta 62,9 % de sacarose, 25,8 % de glicose e 11,3% de frutose (EMBRAPA, 2012). Também é importante salientar a lacuna de informações agroindustriais em relação às cultivares, tais como grau de pureza, pol, pol% e fibra que são quantificações utilizadas na indústria sucroalcooleira para determinar a qualidade da matéria-prima (Silva Costa et al., 2011). Além dos teores de açúcares, o caldo possui macro e micronutrientes que são essenciais para a viabilidade do processo de bioconversão dos açúcares em biocombustíveis (Walker, 2004). Os principais nutrientes na composição do caldo do sorgo para cultivar KKU 40 cultivada na Tailândia estão expressos na Tabela 3. Assim como para os teores de açúcares, informações sobre as concentrações de nutrientes nos caldos das principais cultivares plantadas na região Nordeste do Brasil são escassos e geralmente são reportados juntamente com os nutrientes do colmo (Formiga et al., 2012).
31 Tabela 3: Teores de macro e micronutrientes no caldo da cultivar de sorgo sacarino KKU 40. Nutrientes
Caldo de sorgo sacarino*
N
657 mg.L-1
P
20 mg.L-1
K
1790 mg.L-1
Na
170 mg.L-1
S
120 mg.L-1
Ca
166 mg.L-1
Mg
194 mg.L-1
Fe
2 mg.L-1
Mn
3 mg.L-1
Cu
0,3 mg.L-1
Zn
1,4 mg.L-1
*Fonte: Laopaiboon et al. (2009) Além do caldo, o grão de sorgo é uma fração importante da planta sendo classificado como cariopse nua, composta por pericarpo, endosperma e embrião (SernaSaldivar et al., 2012). O grão do sorgo apresenta composição química semelhante à do grão de milho, com teores de amido entre 60 a 80%. Além do amido, o grão também possui lipídeos e proteínas. O percentual de cinzas é geralmente baixo, com valores entre 1-2%, assim como os teores de fibra bruta (1,4%) e auxiliam na digestibilidade dos grãos, principalmente para nutrição animal. Algumas cultivares de sorgo apresentam elevados teores de taninos o que dificulta a conversão enzimática e consequentemente a produção de etanol. A produção de biocombustíveis a partir do grão enfrenta, além de dificuldades técnicas, entraves do ponto de vista ético uma vez que o amido presente nos grãos pode ser utilizado para produzir uma gama variada de alimentos, o que acarreta no conflito alimentos x biocombustíveis. Pouca informação acerca da composição química dos grãos de sorgo são encontradas para variedades cultivadas na região Nordeste. Apenas para a cultivar IPA 467 tem-se relatado teor de amido nos grãos em média de 61% (Souza et al., 2005). Além do caldo e do grão de sorgo sacarino, o bagaço e as folhas são materiais lignocelulósicos ricos em celulose, hemicelulose e lignina, com grande variação em sua composição (Tabela 4). O percentual de celulose encontra-se predominantemente na
32 faixa de 32 a 45%, o de hemicelulose entre 16 a 27% e o de lignina varia de 14 a 20%. Esta grande diferença se dá devido ao uso de sorgo das mais diversas variedades, cultivado e processado em condições distintas e também devido ao emprego de técnicas analíticas diferentes em cada estudo, sendo mais comuns metodologias baseadas nas normas do National Renewable Energy Laboratoty (NREL) (Hames et al., 2008; Sluiter et al., 2008), da TAPPI (Techinical Association of the Pulp and Paper Industry) e de Van Soest (1963). Assim como o bagaço, as folhas do sorgo sacarino são compostas de celulose, hemicelulose e lignina, mas geralmente apresentam valores mais elevados de lignina que o bagaço (Kim et al., 2012).
33
Tabela 4: Composição química do bagaço de sorgo sacarino para diferentes cultivares. Cultivar
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Lignina (%)
Extrativos (%)
Cinzas (%)
Referência
NR
27,3
14,5
14,3
32,2
----
Li et al. (2010) (NREL)
AC791
32,5
19,8
11,7
17,5
-----
Xu et al. (2010) (NREL)
NR
35,6
20,2
18,2
18,7
------
Li et al. (2010) (NREL)
Sucrosorgo 405
38,5
21,4
17,6
13,3
3,7
Panagiotopoulos
et
al. (2010) (TAPPI) Chuntian No.2
45,3
26,3
15,2
-----
------
Zhang et al. (2011) (Van Soest, 1963)
M81-E
32,1
26,4
5,2
-----
-----
Han et al. (2013) (Van Soest)
Topper
45
28
22
----
5
Chen et al. (2012) (NREL)
Berény
36,25
27,68
18,6
NR
NR
Sipos et al. (2009) (NREL)
34 Para as principais cultivares de sorgo sacarino desenvolvidas e adaptadas para produção no Nordeste do Brasil, os dados de composição dos bagaços são escassos quando não inexistentes. As informações existentes são, na sua grande maioria, de análises bromatológicas usadas na área de alimentação animal (Aguiar et al., 2006). A caracterização da cultivar IPA 467 foi feita pelo grupo de energia da biomassa DENUFPE através de metodologias do NREL e de Van Soest (Figura 2). Diferenças significativas foram observadas nos teores de lignina para as duas metodologias uma vez que a determinação de LDA subestima o valor real de lignina, pois não quantifica a lignina solúvel (Frei, 2013). No entanto, ainda são necessários mais esforços para unir a etapa de produção de biomassa no campo e análise do material quanto à composição do bagaço das folhas para tomada de decisão quanto ao aproveitamento do material.
Figura 2: Composição química da biomassa de sorgo sacarino IPA 467 em função do método de caracterização. Os bagaços são oriundos de experimentos diferentes e em épocas de colheitas diferentes.
35 4. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO SORGO SACARINO A produção de etanol a partir do caldo de sorgo sacarino é realizada de forma semelhante à produção a partir do caldo sacarino da cana-de-açúcar. Após moagem dos colmos, o caldo é purificado e submetido à fermentação com leveduras industriais, principalmente as da espécie Saccharomyces cerevisiae, com eficiência entre 85 – 90 % de conversões dos açúcares em etanol para caldos com 120 g.L-1 de ART inicial (Laopaiboon et al., 2007). Importante parâmetro tecnológico de produção é a eficiência de extração de caldo dos colmos, com valores aceitáveis entre 50 a 70% de eficiência de extração, mas com necessidade de desenvolvimento de tecnologia para aumentos de eficiência
para
valores
próximos
aos
observados
para
a
cana-de-açúcar,
aproximadamente de 90%. (Eggleston et al., 2013). Estima-se que o sorgo sacarino possa produzir em média entre 2500 e 4000 litros de etanol por hectare a partir do caldo do colmo (Almodares e Hadi, 2009). Por se tratar de uma cultura de ciclo curto, pode ser cultivado mais de um ciclo por ano dependendo das condições ambientais, o que poderia aumentar a produção de etanol por unidade de área. O caldo é composto principalmente por açúcares, sacarose, glicose e frutose, prontamente fermentescíveis pelas leveduras industriais (Wu et al., 2010). Devido à grande variabilidade genética e as condições ambientais, a produção de caldo e a concentração de açúcares pelas cultivares de sorgo sacarino podem variar fortemente e por consequência a produção de etanol por unidade de área. Uma desvantagem em relação à cultura da cana-de-açúcar é a rápida decomposição dos açúcares presentes no caldo do sorgo sacarino. Esta observação é crítica quando se postula a introdução do sorgo sacarino como matéria-prima na região Nordeste do Brasil, uma vez que são observadas altas temperaturas ambientais que podem maximizar a decomposição dos açúcares presentes no caldo. Neste contexto, experimentos conduzidos com caldos de cultivares locais em três temperaturas de armazenamento (4 °C, 25 °C e 45 °C), mostraram variações nos teores de açúcares redutores totais, quantificados pelo método do ácido dinitrosalisílico (Miller, 1957), durante 20 dias nas temperaturas 25 °C e 45 °C, sem mudanças significativas a 4 °C (Figura 3).
36
Figura 3: Perfil de decomposição de açúcares redutores totais do caldo de sorgo sacarino em função da temperatura de estocagem. T1: 4°C, T2: 25°C e T3: 45°C. Grande parte dos estudos com a fração do caldo de sorgo sacarino buscam novas cultivares com potencial de produção de etanol. Em recente estudo conduzido na região Nordeste do Brasil, Dutra et al. (2013) avaliaram oito cultivares de sorgo sacarino quanto à concentração de açúcares redutores no caldo para a produção de etanol. Os resultados indicaram diferenças significativas entre as cultivares avaliadas (64 g.L-1 a 164,8 g.L-1), sendo as mais promissoras para a produção de etanol a BR 506 (59,07 ± 1,3 g.L-1), Willey (64,77 ± 4,4 g.L-1) , Wray (59,07 ± 1,3 g.L-1) e IPA 467-4-2 (52,10 ± 0,7 g.L-1). Para o conjunto dos dados experimentais a eficiência de conversão dos açúcares presentes nos caldos para etanol foi 88,4 % do valor teórico. Os maiores potenciais de produção de etanol por hectare foram observados nas cultivares BR 506 e SF 15. Em outro estudo com o caldo de cultivares de sorgo sacarino, em Colônia – Uruguai Guigou et al. (2011) investigaram a produção de etanol a partir do caldo de três cultivares (M81, Topper e Theis), com três condições de materiais: colmo + folhas + panícula; colmo + folhas e sem panícula; e colmo limpo. A eficiência de extração do caldo não foi diferente entre as cultivares, mas o efeito da combinação afetou significativamente a extração do caldo. A concentração de açúcares no caldo extraído das diferentes cultivares não foi influenciada pelas combinações, com valores altos de açúcares em todas: Topper 148 a 191 g.L-1; Theis 135 a 147 g.L-1;e M81 110 a 130 g.L-
37 1
. Após 24 h de fermentação com Saccharomyces cerevisiae – Fleischmann a 30 °C 100
rpm, as concentrações de etanol obtidas foram: Topper 69 a 82 g.L-1; Theis 70 a 75 g.L1
; e M81 43 a 50 g.L-1. Além da busca de novas cultivares e técnicas de pós-colheita, diferentes técnicas
de fermentações têm sido utilizadas para a produção de etanol a partir do caldo do colmo do sorgo sacarino. Laopaiboon et al. (2007) investigaram a produção de etanol a partir do caldo do sorgo sacarino, variedade keller, na Tailândia, em sistemas em batelada e batelada alimentada com a levedura S. cerevisiae. No sistema operado em batelada, com concentração inicial celular de 1x108 células mL-1 e sólidos solúveis totais (SST) de 24° Brix a concentração de etanol (P), rendimento (Yp/s) e produtividade (Qp) foram 100 g L-1, 0,42 g g-1 e 1,67 g L-1 h-1, respectivamente. No sistema em batelada alimentada, os autores sugeriram uma única alimentação como a melhor estratégia, com o teor de sólidos solúveis inicial de 24 °Brix, com resultados para os parâmetros cinéticos P, Yp/s e Qp de 120 g L-1, 0,48 g g-1 e 1,11 g L-1 h-1, respectivamente. Sistemas com células imobilizadas em suportes podem diminuir os custos de produção de etanol a partir do caldo do sorgo sacarino, pois tem como principais vantagens atuar com altas concentrações de inóculo, melhor mistura de fases, operar com altas taxas de fermentação, reutilizar as células no processo e menor inibição pelos produtos formados (Laopaiboon e Laopaiboon, 2012). Considerando que as recuperações de etanol devem ser aumentadas juntamente com a diminuição do gasto de energia, fermentações com altas concentrações de açúcares iniciais (>270 g.L-1) têm sido avaliadas (Loapaibon et al., 2009). Geralmente este tipo de processo permite obter vinhos com teor de etanol com 100-120 g.L-1, mas apresenta desvantagem de resultar em baixas produtividades volumétricas pelo elevado tempo de processo (40 -120h) e afetar a viabilidade das células de levedura. Na abordagem com altas concentrações iniciais de açúcares, esforços têm sido realizados para melhorar a eficiência de fermentação através do screening dos principais nutrientes que afetam a fermentabilidade dos caldos. Um estudo com fermentação de caldo de sorgo sacarino, avaliando as influências de Zn, Mg, Mn e de extrato de levedura como fonte de nitrogênio no processo, demonstrou que a importância segue a seguinte ordem: extrato de levedura > Mn+2 > Zn+2 > Mg+2 (Deesuth et al., 2012).
38 5. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DOS GRÃOS DO SORGO SACARINO O processo de produção de etanol a partir dos grãos de sorgo sacarino é semelhante ao modo de produção de etanol a partir dos grãos de milho, pois está baseado na transformação do amido em glicose, através de hidrólise enzimática com αamilase e glucoamilase e posterior fermentação dos hidrolisados com leveduras. No entanto ainda são escassas as publicações sobre o uso dos grãos de sorgo para produção de etanol, principalmente devido ao aproveitamento alimentício dos grãos. A produção de grãos de sorgo granífero e sacarino situa-se entre 2 a 3 t ha-1. A concentração média de amido nos grãos de sorgo é bastante variável e depende da cultivar e do local de produção. Em média, pode-se produzir aproximadamente 815 L de etanol por hectare (Zhao et al., 2009). Otimizações de processo têm sido relatadas, a exemplo do trabalho de Barcelos et al. (2011) que avaliaram a hidrólise enzimática do amido do grão de sorgo e a fermentabilidade do hidrolisado enzimático empregando uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae. A concentração de amido nos grãos foi de 79 % na matéria seca. As melhores condições de hidrólise enzimática foram: diâmetro de partícula de 0,5 mm; relação sólido:líquido de 1:3; carga de 20 µL de α-amilase e 40 µL de glucoamilase por g de grão. Nestas condições de hidrólise enzimática, o hidrolisado fermentado apresentou máxima concentração de etanol, 86,7 g.L-1, correspondendo a 20,8 g de etanol para cada 100 g de grãos de sorgo em 16 h de fermentação. Assim como para a produção de etanol a partir do caldo, maiores concentrações de etanol, que reduzem os gastos de energia no processo de destilação, também são buscadas a partir do amido do grão usando a abordagem da alta concentração de açúcares iniciais. Neste contexto Bovchora et al. (2000) avaliaram a co-fermentação de grãos de sorgo com caldo em altas concentrações de açúcares iniciais (34 g de sólidos dissolvidos em 100 mL) com levedura do gênero Saccharomyces cerevisiae, por 96 h. Quando comparada com condições normais de fermentação, a recuperação de etanol foi 3 vezes superior, no entanto nem todo açúcar foi consumido pelas leveduras. Dados para a região Nordeste do Brasil em relação à produção de amido por diferentes cultivares são incipientes. Apenas são relatados dados de composição de amido para a IPA 467 utilizada para produção de alimento com teores médio de 61% (Souza et al., 2005).
39 6. PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO BAGAÇO E DAS FOLHAS DO SORGO SACARINO Estudos com a fração lignocelulósica do bagaço do sorgo sacarino são fundamentais para aumentar a produção de etanol por unidade de área plantada e tornar o balanço energético mais positivo. Com isso, várias pesquisas têm sido realizadas para tornar viável a produção de etanol a partir da celulose. Estima-se que a produção de etanol a partir do bagaço seja de aproximadamente 2423 litros de etanol por hectare (Prasad et al., 2007). Para transformar os polissacarídeos insolúveis constituintes do bagaço e das folhas, geralmente são necessárias etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática ou ácida. Existem vários tipos de pré-tratamentos disponíveis e a escolha de um método específico ou a combinação de métodos vai depender do uso dos hidrolisados. Para a biomassa de sorgo, vários métodos são reportados (Sipos et al., 2009; Shen et al., 2012; Wang et al., 2012) com vantagens e desvantagens bem como diferentes estratégias de hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados. Avaliações com quatro tipos de pré-tratamento do bagaço de sorgo sacarino, cultivar Chuntian No.2, foram realizadas para aumentar a suscetibilidade à hidrólise enzimática: uso de líquidos iônicos, explosão a vapor, lime (cal) e ácido diluído. Os melhores resultados de conversão de celulose e concentração de glicose foram obtidos com o pré-tratamento com explosão a vapor, 70 % e 25 g L-1, respectivamente. Comparando com o tratamento controle, a explosão a vapor teve conversão 2,5 vezes maior. Para todos os pré-tratamentos avaliados foi verificada a desorganização da estrutura cristalina da celulose e aumento da área superficial disponível, que tornou a celulose mais acessível à hidrólise enzimática. Infelizmente não foi realizada pelos autores a fermentação dos hidrolisados lignocelulósicos (Zhang et al., 2011). Em outro estudo foram avaliadas as produções de etanol a partir do bagaço de sorgo sacarino pré-tratado com ácido fosfórico e hidróxido de sódio, com ou sem ultrasonificação e posterior hidrólise enzimática com celulases e β-glicosidase comerciais. O fungo Mucor hiemalis foi utilizado como micro-organismo fermentador a 32 °C, 120 rpm e por 60 h. Após os pré-tratamentos foram alcançados eficiência de conversão de celulose entre 79 e 92%, sendo o melhor resultado obtido com o prétratamento com hidróxido de sódio (12 % m/v) combinado com ultrasonificação. A fermentação por 24 h do bagaço pré-tratado com NaOH-ultrasonificação e hidrolisado
40 com enzimas acarretou na produção de etanol com 81% de eficiência com relação ao valor teórico (Goshadrou et al., 2011). A produção de etanol a partir da palhada (colmos e folhas) de sorgo forrageiro também foi alvo de estudo por apresentar elevada produção de biomassa na região sudeste do Brasil. Foi avaliada a cultivar BRS 655, desenvolvida pela Embrapa, com três tipos de pré-tratamento (alcalino com NaOH, ácido com H2SO4 e H2SO4 seguido de NaOH) e dois tempos de reação (15 e 30 min), sendo observadas melhoras significativas na etapa de hidrólise enzimática com eficiências acima de 90% de conversão de celulose em glicose (Cardoso et al., 2013). Além do pré-tratamento, investigações na etapa de hidrólise enzimática são fundamentais para viabilizar a tecnologia de conversão pela rota bioquímica. Neste cenário, os trabalhos com hidrólise enzimática da biomassa de sorgo inicialmente foram desenvolvidos para baixas concentrações de biomassa (20 a 100 g.L-1, Sipos et al., 2009; Shen et al., 2011) que permitiam pequenas recuperações finais de etanol. Atualmente, os estudos estão focados em usar altas cargas de sólidos > 250 g.L-1 o que diminui a eficiência de hidrólise, mas aumenta a recuperação de etanol após a fermentação dos hidrolisados (Wang et al., 2012). Em relação a estudos com a fração lignocelulósica das cultivares desenvolvidas e adaptadas para a região Nordeste do Brasil, os resultados são escassos quando não inexistentes e não há respostas para: qual o teor de celulose, hemicelulose e lignina para cultivares locais? Qual o melhor tipo de pré-tratamento para a biomassa de sorgo disponível na região? Que tipo de abordagem de hidrólise deve-se utilizar enzimática ou ácida? Estas perguntas devem ser respondidas juntamente com as determinações dos potenciais de produção de etanol por unidade de área para estas frações.
41 7.
BIOMASSA
DE
SORGO
COMO
MATÉRIA-PRIMA
PARA
BIORREFINARIAS O conceito recente de biorrefinaria refere-se a um sistema integrado de instalações e equipamentos desenvolvidos para conversão da biomassa por rota termoquímica ou bioquímica com o objetivo de produzir combustíveis, energia e produtos químicos (FitzPatrick et al., 2010). Os métodos aplicados para conversão da biomassa são semelhantes ao de uma refinaria de petróleo. O conceito de produção através de sistemas integrados ganhou força com a grande disponibilidade de biomassa residual oriundas das atividades de produção e faz parte dos esforços de sustentabilidade almejados pelo setor acadêmico e industrial. Neste cenário, o sorgo sacarino tem sido avaliado como matéria-prima para o desenvolvimento de biorrefinarias em diversas rotas de aproveitamento integral da biomassa, pois apresenta características como elevada produção de biomassa com menor consumo de água e insumos (Xin e Wang, 2011). O sorgo sacarino foi avaliado para produção de etanol, butanol e um polímero de ácido lático com características biodegradáveis. A produção de etanol foi efetuada com a fração do caldo com elevadas concentrações iniciais de açúcares (300 g.L-1) sendo alcançadas eficiências de conversão de açúcares em etanol na ordem de 97% após 54 h de fermentação com Saccharomyces cerevisiae. O butanol foi produzido a partir do bagaço após hidrólise com ácido acético e fermentação com Clostridium acetobutylicum e o resíduos gerados após a hidrólise foram utilizados para produzir o polímero biodegradável (Yu et al., 2012). Em outra abordagem de utilização integral da biomassa de sorgo sacarino cultivar ME81, foram avaliadas as produções de etanol a partir dos grãos, folhas e bagaço. Os grãos, contendo 73,48% de amido, foram hidrolisados com α-amilase e amiloglucosidase durante 12 h e os hidrolisados fermentados com leveduras. O bagaço contendo 47,47% de celulose, 28% de hemicelulose e 19% de lignina e as folhas 42% celulose, 30% hemicelulose e 22% de lignina foram submetidas ao pré-tratamento com hidróxido de cálcio a 121 °C por 1h e hidrólise enzimática com celulases e β-glicosidase a 50°C e 200 rpm por 48h. Os hidrolisados foram submetidos à fermentação com leveduras durante 2dias. O caldo contendo 15 % m/v de açúcares simples (sacarose, glicose e frutose) também foi submetido à fermentação com leveduras nas mesmas condições descritas para os hidrolisados dos grãos e do bagaço. O balanço geral para a
42 produção de etanol a partir de 1 ton de biomassa de sorgo foi de 59 kg de etanol (Kim et al., 2012). Em recente revisão sobre o processamento da biomassa de sorgo sacarino para bioprodução de produtos de alto valor agregado, identificaram-se vários produtos que podem ser produzidos com as diferentes frações da biomassa, tais como forragem, silagem, energia na forma de vapor e papel a partir do bagaço e também produtos de fermentação como etanol, acetona, butanol, lipídeos, ácido láctico, hidrogênio e metano (Whitfield et al., 2012). Na região Nordeste do Brasil, ainda não foram implantados estudos que integrem as diferentes fases de produção de biomassa (agronômica) com processamento (engenharias, química) desta biomassa para a produção de biocombustíveis, energia e produtos de alta valor agregado, o que indica um alto nicho de aproveitamento desta biomassa. Usando dados de composição química da biomassa da cultivar IPA 467 com as equações propostas por Zhao et al. (2009) para caldo, grãos e bagaço juntamente com produtividade de biomassa por hectare, pode-se estimar um cenário de produção de etanol de 6730 L.ha-1.
43 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS A região litorânea do Nordeste do Brasil é uma área de tradição no cultivo de cana-de-açúcar para a produção de açúcar e etanol. Esta região abrange uma pequena fração da área total do Nordeste e em algumas partes o gradiente de precipitação se reduz e inviabiliza o cultivo desta cultura energética. É neste contexto que o cultivo do sorgo sacarino pode ser inserido como matéria-prima complementar com diversas oportunidades de produção de combustíveis, energia e produtos de alto valor agregado. Para o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino ainda são necessários vários esforços em diferentes áreas de pesquisa : 1) Melhoramento vegetal de cultivares de sorgo sacarino; 2) Melhora nas eficiências dos processos fermentativos a partir do caldo; 3) Viabilidade de produção de etanol a partir dos grãos de cultivares de sorgo sem interferir na oferta de alimentos; 4) Design de processos de pré-tratamentos, hidrólise enzimática ou ácida e fermentação de hidrolisados competitivos; 5) Integração das diferentes abordagens na produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino e aproveitamento dos seus resíduos para geração de energia e outros produtos; e 6) Levatamento dos custos de produção de etanol a partir da biomassa de sorgo sacarino.
44 9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, E. M., LIMA, G. F. C., SANTOS, M. V. F., CARVALHO, F. F. R., GUIM, A., MEDEIROS, H. R., BORGES, A. Q. Rendimento e composição químicobromatológica de fenos triturados de gramíneas tropicais. Revista Brasileira de Zootecnia, v.35, p.2226-2233, 2006. ALMODARES, A.; HADI, M.R. Production of bioethanol from sweet sorghum: A review. African Journal of Agricultural Research, v.4, p.772-780, 2009. BARCELOS, C.A. Aproveitamento das frações sacarínea, amilácea e lignocelulósica do sorgo sacarino [Sorghum bicolor (L.) Moench] para produção de bioetanol. Tese Doutorado Tecnologias de Processos Químicos e Bioquímicos, UFRJ, Rio de Janeiro, 334p, 2012. BARCELOS, C.A.; MAEDA, R.N.; BETANCUR, J.V.; PEREIRA JR, N. Ethanol production from sorghuns grains [Sorghum bicolor (L.) Moench]: evaluation of the enzymatic hydrolysis and the hydrolysate fermentability. Braziliam Journal of Chemical Engineering, v.28, p.597-604, 2011. BVOCHORA, J.M.; READ, J.S.; ZVAUYA, R. Application of very high gravity technology to the cofermentation of sweet stem sorghum juice and sorghum grain. Industrial Crops and Products, v.11, p.11-17, 2000. CARDOSO, W.S.; TARDIN, F.D.; TAVARES, G.P.; QUEIROZ, P.V.; MOTA, S.S.; KASUYA, M.C.M.; QUEIROZ, J.H. Use of sorghum straw (Sorghum bicolor) for second generation ethanol production: Pretreatment and enzymatic hydrolysis. Química Nova, v.36, p.623-627, 2013. CHEN, C.; BOLDOR, C.; AITA, G.; WALKER, M. Ethanol production from sorghum by a microwave-assited dilute ammonia pretreatment. Bioresource Technology, v.110, p.190-197, 2012. DAVILA-GOMEZ, F.J.; CHUCK-HERNANDEZ, C.; PEREZ-CARRILLO, E.; ROONEY, W.L.; SERNA-SALDIVAR, S.O. Evaluation of bioethanol production from five different varieties of sweet and forage sorghums (Sorghum bicolor (L) Moench). Industrial Crops and Products, v.33, p.611-616, 2011. DEESUTH, O.; LAOPAIBOON, P.; JAISIL, P.; LAOPAIBOON, L. Optimization of nitrogen and metal ions supplementation for very high gravity bioethanol fermentation from sweet sorghum juice using an ortogonal array design. Energies, v.5, p.3178-3197, 2012. DUTRA, E.D.; NETO, A.G.B.; SOUZA, R.B.; MORAIS JUNIOR, M.A.; TABOSA, J.N.; MENEZES, R.S.C. Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Brazil. Sugar Tech, v.15, p.316-321, 2013.
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50 CAPÍTULO II
APLICAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO NO PRÉTRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
51 APLICAÇÃO DO PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO NO PRÉTRATAMENTO DE BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA
RESUMO O pré-tratamento é uma etapa essencial para aumentar a eficiência da hidrólise enzimática da biomassa lignocelulósica. Os métodos de pré-tratamento mais utilizados atualmente operam em elevadas temperaturas (180 – 240 °C) e pressões (0,69 – 4,9 MPa) e geram uma gama de inibidores de crescimento biológico, como furfural e hidroximetilfurfural (HMF). Com isso, intensificou-se a busca de novas abordagens de pré-tratamento efetivo que operem em temperatura e pressão ambiente e minimizem a geração de inibidores. Dentre estes métodos, o peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2 alcalino) vem ganhando espaço por ser efetivo para uma gama variada de biomassas lignocelulósicas, possibilitando valores elevados de eficiência de hidrólise enzimática. No entanto, é pouco discutido nas principais revisões publicadas na literatura. Logo, o objetivo deste trabalho foi investigar o uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) alcalino como agente de pré-tratamento com o propósito de melhorar a eficiência da hidrólise enzimática para diferentes tipos de biomassas e discutir sobre os pontos chave do prétratamento. Por fim, são discutidos os principais desafios deste método quanto à aplicação em larga escala. Palvras-chaves: Bioenergia, Biomassa Lignocelulósica, Pré-tratamento, Hidrólise Enzimática, Etanol Celulósico, Biorrefinarias.
52
ABSTRACT Pretreatment is an essential step to increase the efficiency of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass. The main pretreatment methods used currently operate at high temperatures (180 a 240 °C) and pressures (0.69 to 4.9 MPa) and generate a range of inhibitors of biological processes, such as furfural and hidroximethilfurfural. With this, there has been intensified the search for new effective pretreatment approaches that operate at ambient temperature and pressure and minimize the generation of inhibitors. Among these methods the alkaline hydrogen peroxide has been gaining space to be effective for a wide range of lignocellulosic biomasses, enabling high values of enzymatic hydrolysis efficiency. However, this methods is still poorly discussed in the main reviews found in the literature. Therefore, the aim of this work was to investigate the use of H2O2 alkaline for pretreatment with the purpose of improving the efficiency of enzymatic hydrolysis to different types of biomass and discuss about the key points of the pretreatment. Finally, we discuss the major challenges for the application of this method in large scale. Key words: Bioenergy, Lignocellulosic biomass, Pretreatment, Enzymatic Hydrolisys, Cellulosic Ethanol, Biorefinery.
53 1.
INTRODUÇÃO A diminuição da oferta de combustíveis fósseis em conjunto com os problemas
ambientais ocasionados pela queima destes materiais evidencia o desafio da sociedade moderna em desenvolver novas formas de geração de energia baseada em fontes renováveis. Dentre as fontes renováveis, a biomassa representa um elevado potencial, uma vez que é parte do ciclo do carbono na natureza e vem sendo utilizada pelo homem desde os primórdios da civilização, além de apresentar grande disponibilidade e baixo custo de aquisição (Cheng e Timilsina, 2011). O termo biomassa, do ponto de vista energético, compreende os materiais de origem orgânica como as florestas energéticas, resíduos orgânicos municipais, culturas agrícolas, resíduos das culturas agrícolas, etc. Até recentemente, a biomassa lignocelulósica era vista em muitos casos como uma matéria-prima sem valor e que deveria ser descartada, no entanto vários grupos de pesquisa no mundo estão aplicando esforços e recursos a fim de tornar economicamente viável o uso da biomassa para produção de biocombustíveis, energia e produtos químicos de alto valor agregado, através de rotas termoquímica e bioquímica (McKendry, 2002; Galbe e Zacchi, 2012). A rota bioquímica é uma das tecnologias mais utilizadas para a produção de biocombustíveis, com ênfase principal na produção de etanol e biogás. No entanto, devido à composição química da biomassa lignocelulósica torná-la altamente resistente a degradação biológica, sendo necessária uma etapa de pré-tratamento para facilitar a sua transformação em produtos energéticos. O objetivo principal de um pré-tratamento é desestruturar a matriz lignocelulósica e facilitar a separação dos polissacarídeos e da lignina, o que acarreta maior acessibilidade para etapa de hidrólise enzimática (Mosier et al., 2005). Existem vários tipos de pré-tratamento reportados na literatura, sendo classificados pelo método de ação em químicos, físicos, físico-químicos e biológicos (Sun e Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Alvira et al., 2010). Em geral, a escolha do pré-tratamento apresenta vantagens e desvantagens. Critérios para um pré-tratamento efetivo devem ser levados em consideração, uma vez que esta etapa é uma das mais onerosas para a produção de biocombustíveis a partir da biomassa. Produção de fibras de celulose reativas, baixa degradação da celulose e hemicelulose, não formação de possíveis inibidores do processo de hidrólise e fermentação, minimização da demanda de energia, redução dos custos de diminuição do tamanho das partículas, redução do custo de materiais para a construção de reatores de pré-tratamento, produção
54 minimizada de resíduos e baixo consumo de produtos químicos; são alguns dos requisitos desejados para a escolha de um pré-tratamento (Mohammad e Karimi, 2008). Dentre as várias opções de pré-tratamento disponíveis, a grande maioria necessita de grandes quantidades de energia e/ou altas pressões o que resulta em elevado custo de processo. Exemplos de pré-tratamentos efetivos que demandam elevado consumo de energia e/ou altas pressões: explosão a vapor (Ramos, 2003; 160 290°C, p = 0,69 - 4,85 MPa) e tratamento ácido (Sánchez e Cardona, 2008; 160 200°C). Pré-tratamentos efetivos que possam ser conduzidos em temperaturas e pressões ambientes tem sido foco de pesquisas nos últimos anos, o que pode ser mensurado pelo aumento do número de publicações de artigos com o uso de H2O2 alcalino (Figura 1).
Figura 1: Vista geral do crescimento de publicações com o uso do prétratamento H2O2 alcalino para diferentes tipos de biomassas lignocelulósica. Fonte: ISI web of knowledge termo de busca “Alkaline hydrogen peroxide pretreatment”.
No entanto, as principais revisões de métodos de pré-tratamento de biomassa lignocelulósica não reportam o uso do peróxido de hidrogênio (H2O2) como prétratamento efetivo. Com isso, a presente revisão aborda a utilização do H2O2 alcalino como agente de pré-tratamento de biomassa visando melhorar a eficiência da hidrólise enzimática. Para o melhor entendimento, descreve-se brevemente a composição química da biomassa lignocelulósica e os aspectos relacionados à química do pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino. Também são descritas as principais variáveis que
55 influenciam o pré-tratamento com o H2O2 e consequentemente a sacarificação enzimática. É feita uma comparação entre o pré-tratamento com H2O2 alcalino e outros tipos de pré-tratamento. Adicionalmente, são discutidos os principais desafios para o uso em larga escala do H2O2 alcalino no pré-tratamento de biomassa lignocelulósica e apresentadas algumas considerações finais.
56 2. COMPOSIÇÃO DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA E SEUS PRODUTOS DE HIDRÓLISE A
biomassa
lignocelulósica
é
composta
principalmente
de
celulose,
hemicelulose e lignina (Tabela 1), e pequenas frações de extrativos e cinzas. A celulose é um polissacarídeo homogêneo de cadeia longa mais abundante na natureza e representa aproximadamente 40% do peso seco da biomassa, formada por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas do tipo β-1-4. Apresenta-se na forma cristalina com regiões amorfa, sendo a forma amorfa mais susceptível a hidrólise enzimática. A hidrólise da celulose acarreta a produção de glicose que é facilmente convertida pela maioria dos micro-organismos. A hemicelulose, o segundo polissacarídeo mais importante depois da celulose, é um polímero heterogêneo complexo, formado por unidades de açúcares de 5 e 6 carbonos. Em sua cadeia principal, é formada por xilose e suas ramificações podem conter L-arabinose, galactose e manose, além de ácidos urônicos e grupos acetilas. A hidrólise da hemicelulose produz principalmente xilose, um carboidrato de 5 carbonos que apenas alguns micro-organismos conseguem metabolizar. A lignina, depois da celulose, é o principal componente da parede celular de plantas e atua na estruturação da celulose e hemicelulose. É uma estrutura complexa e heterogênea formada principalmente por compostos fenólicos e seus derivados. Apresenta baixa biodegradabilidade e apenas alguns micro-organismos especializados são capazes de degradá-la, como os fungos da podridão branca e os fungos da podridão parda (Aguiar e Ferraz, 2011).
57
Tabela 1: Conteúdos de celulose, hemicelulose e lignina comumente reportados para as principais biomassas lignocelulósicas. Biomassa lignocelulósica
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
Lignina (%)
46
27,8
10,7
Palha de milho
35-40
17-35
7-18
Palha de trigo
30
50
15
Palha de arroz
36-47
19-25
10-24
Casca de arroz
35,6
12
15,4
Bagaço de cana-de-açúcar
39,6
19,7
25,8
Bagaço de sorgo-sacarino
34
25
18
Palha de centeio
37,9
36,9
17,6
Palha de colza
44,6
20
20
Palha de cevada
34,4
23
13,3
Miscanthus
Fonte:Sun et al. (2000); Sun e Cheng, 2002; Saha e Cotta, 2007; Rabelo et al. (2008); Sipos et al.(2009); Saha e Cotta, 2010;Karagos et al. (2011); Wang et al. (2012).
58
3. ABORDAGEM SOBRE A QUÍMICA DO PRÉ-TRATAMENTO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO ALCALINO O peróxido de hidrogênio é um metabólito natural, presente em muitos organismos, e participa de várias rotas biológicas, principalmente as envolvidas na decomposição de lignina por fungos possuidores de sistemas enzimáticos complexos (Aguiar e Ferraz, 2011).Também vem sendo utilizado há muitos anos na indústria de papel e celulose, como agente no processo de branqueamento e na área de tratamento de efluentes como reagente nos processos oxidativos avançados (POA) (Mattos et al., 2003). Por suas características altamente oxidantes, Gould (1985) investigou o uso do peróxido de hidrogênio para a melhora da disgestibilidade enzimática de resíduos agrícolas, bem como os mecanismos de atuação do H2O2. Pré-tratamento com H2O2 tem sido aplicado com sucesso para uma gama variada de biomassas lignocelulósicas com a intenção principal de melhorar o rendimento da hidrólise enzimática através da deslignificação. Rendimentos de hidrólise enzimática para diferentes biomassas podem ser observados na Tabela 2 e dependendo das condições avaliadas valores entre 67 a 95% são reportados.
59
Tabela 2: Eficiências de hidrólise enzimática reportados para diferentes tipos de biomassas pré-tratadas com H2O2 alcalino Referência
Biomassa lignocelulósica
Composição química (%)
Enzimas utilizadas
Carga de enzimas
Conversão de celulose (%)
Conversão da hemicelulose (%)
Sacarificação enzimática (%)
Gould (1985)
Palha de trigo
35,9 celulose
Celulase T.ressei
5 mg/mL
95
NR
NR
44,24 celulose
Celluclast
16 ml de cada enzima 100 g de biomassa
NR
NR
96,70
25,23 hemicelulose
Novozyme 188
4 mL/100 g de biomassa para cada enzima
67,38
81,10
74
Celulase T. ressei e βglicosidase de A. Níger
3,42 FPU/g biomassa pré-tratada e 1 UI βglicosidase/g de biomassa pré-tratada
69,4
NR
83,42
Celulases não especificada.
50 FPU/g de biomassa pré-tratada
NR
NR
95,70
Cellulases Micelase
20 FPU/ g biomassa pré-tratada
78,92
NR
74,84
44,8 hemicelulose Saha e Cotta (2006)
Palha de trigo
Viscostar 150L Saha e Cotta (2007)
Casca de arroz
35,62 celulose
Celluclast
11,96 hemicelulose
Novozyme 188 Viscostar 150L
Rabelo et al. (2008)
Bagaço de cana-deaçúcar
39,6 celulose 21,4 hemicelulose
Qi et al. (2009)
Palha de trigo
40,98 celulose 36,96 hemicelulose
Yamashita et al. (2010)
Bambu
45,5 celulose 22,8 hemicelulose
60 A utilização do H2O2 para pré-tratamento de biomassa lignocelulósica está fundamentada nas reações químicas que este agente oxidante sofre em meio líquido alcalino. A sua dissociação gera o ânion hidroperóxido (HOO-), através da Equação (1).
(1)
Em meio alcalino, o ânion hidroperóxido pode reagir com H2O2 que acarreta a formação do radical hidroxila e superóxido, conforme a Equação (2). +
(2)
Na ausência de outros reagentes os radicais hidroxila e superóxido podem combinar-se gerando oxigênio e água, Equação 3.
Logo, a equação geral de decomposição de H2O2 em meio alcalino pode ser resumida na Equação 4. (4) Para cada mol de H2O2 adicionado são gerados 0,5 mol de O2. No entanto, quando da presença de outros compostos que reagem com os radicais formados na equação 2, uma quantidade menor de O2 é produzida. Por outro lado, o peróxido de hidrogênio é instável em meio alcalino e rapidamente se decompõe, particularmente na presença de alguns metais de transição como manganês, ferro e o cobre, o que leva a geração de radicais hidroxilas (OH.) e superóxidos (
, através das reações 5, 6 e 7, que participam nas reações de
deslignificação (Sun et al., 2000).
61 Equação geral: M/M+
Apesar das duas rotas de decomposição possíveis para o peróxido de hidrogênio, dados experimentais evidenciaram a predominância da reação 2 na deslignificação de materiais lignocelulósicos (Gould, 1985). No trabalho de Karagoz et al. (2012), os autores utilizaram a adição de metais no pré-tratamento pode auxiliar para minimizar a degradação da celulose e maximizar a solubilização da lignina. Neste contexto, a biomassa de palha de colza foi submetida ao pré-tratamento com H2O2 em condições alcalina (2,5 % v/v H2O2, pH 11,5, 50 °C por 1h) com seis diferentes concentrações de MgSO4 (0; 0,25; 0,5; 1; 1,25 e 1,5 % m/v) sendo observado efeito na solubilização da lignina que variou de 22,83 para 65,66%, quando a concentração de MgSO4 aumentou de 0 para 0,25% m/v. Em contrapartida, concentrações acima de 0,25% de MgSO4 resultaram em decréscimos na solubilização da lignina. A lignina é provavelmente o maior sitio de ataque químico pelos radicais gerados na decomposição do H2O2 em meio alcalino. Apesar de micrografias eletrônicas indicarem mudanças nas características físicas e morfológicas nas fibras de celulose (Figura 2) com pequenas perdas de glicose < 5%, o restante da celulose na fração sólida é altamente susceptível a hidrólise enzimática com celulases.
Figura 2: Mudanças na morfologia da palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino (1% H2O2, pH 11,5, temperatura ambiente por 24 h): a) palha de trigo moída sem pré-tratamento (100x); b) palha de trigo pré-tratada com H2O2 alcalino após secagem à 100 °C por 24 h (100x); c) palha de trigo pré-tratada com H2O2 desidratada em etanol e seca no ponto crítico (200x); e d,e) aumento da amostra vista na imagem c em dois cortes, as setas mostram a separação das fibras de celulose. Adaptado de Gould (1985).
62 4. PRINCIPAIS VARIÁVEIS QUE AFETAM O PRÉ-TRATAMENTO COM H2O2 Para que um pré-tratamento seja efetivo são necessárias investigações sobre a influência das principais variáveis que afetam o desempenho do pré-tratamento avaliado. Para o pré-tratamento com H2O2, as principais variáveis são: concentração de sólidos no reator, tempo de residência no reator, concentração de H2O2 do meio reacional, temperatura da reação de pré-tratamento e pH da reação. A seguir, são abordadas como cada uma destas variáveis afetam a reação de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica com H2O2. A concentração de sólidos no reator reflete a quantidade de massa a ser prétratada pelo volume ou massa da reação de pré-tratamento. Esta variável é largamente utilizada como fator determinante na melhora da eficiência de reações de prétratamento. Estudos iniciais com o uso do H2O2 alcalino foram conduzidos com baixas concentrações de sólidos totais, geralmente 2% obtendo elevadas eficiências de conversão de celulose em glicose (90%) (Gould, 1985 a,b). No entanto, em escala industrial maiores cargas de sólidos são desejáveis, uma vez que acarretam em menores custos de reatores e maiores recuperação do produto. O aumento na concentração de sólidos totais acarreta maiores liberações de açúcares, após digestão enzimática da biomassa pré-tratada, para as condições de estudo conduzidas por Banerjee et al. (2011) (Figura 3).
Figura 3: Influência da concentração de sólidos totais no pré-tratamento da palha de milho com peróxido de hidrogênio (24 h, 0,5 g H2O2/g biomassa) na eficiência de conversão de celulose em glicose. A biomassa pré-tratada foi neutralizada e diluída a 0,2 % glucana e digerida enzimaticamente com Accellerase 1000 (15 mg/g glucana) por 48h. Fonte: Adaptado: Banerjee et al. (2011). Ef: Eficiência de conversão e BL: carga de biomassa.
Concentrações entre 15% (Saha e Cota, 2007) e 40% (Gould et al., 1989) de sólidos totais no pré-tratamento com H2O2 alcalino de biomassas como palha de trigo e
63 cevada já foram reportadas na literatura com resultados satisfatórios na melhora da digestibilidade enzimática. O tempo de pré-tratamento, que é definido como o tempo de contato da biomassa lignocelulósica com o agente de pré-tratamento, vária bastante de acordo com o tipo de pré-tratamento utilizado, de alguns minutos (explosão a vapor) até horas (hidrólise alcalina) e dias (utilização de fungos). Para o pré-tratamento com H2O2 alcalino são reportados vários tempos de reações, em função das condições de operação e da biomassa pré-tratada. Para a biomassa de palha de trigo pré-tratada com 2,15% H2O2 (v/v) e teor de sólidos totais de 8,6% (m/v), 24°C e pH 11,5, o aumento de 3 h para 24 h na reação de pré-tratamento acarretou maiores liberações de açúcares totais (glicose+xilose+arabinose) após hidrólise enzimática (Saha e Cotta, 2006) (Figura 4).
Figura 4: Efeito do tempo de duração da reação de pré-tratamento com H2O2 alcalino (2,15% v/v H2O2, pH 11,5) na biomassa de palha de trigo (8,6 % m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 120 h). Fonte: Adaptado Saha e Cotta, 2006.
Para a biomassa de bagaço de cana-de-açúcar o tempo de reação de prétratamento não foi significativo na liberação de açúcares (glicose) em altas concentrações de H2O2, o que levou a condução de condições ótimas de pré-tratamento para o bagaço de cana em 7,35% v/v H2O2, 25 °C por 1h, com hidrólise enzimática realizada com celulases obtidas a partir de Tricoderma reesei (3,5 FPU. g biomassa seca pré-tratada-1) e β-glicosidase obtidas a partir de Aspergilus niger (1,0 CBU. g biomassa seca pré-tratada-1) nas condições de 50 °C e 100 rpm (Rabelo et al., 2011). A concentração de H2O2 em solução tem influência significativa na melhora da acessibilidade da biomassa a hidrólise enzimática. Pode variar fortemente de acordo com a biomassa avaliada, a depender principalmente da recalcitrância da matéria-prima.
64 Geralmente, os estudos apresentam variações da ordem de 1 - 10 % de H2O2 em solução. Em estudos com casca de arroz, um resíduo de grande disponibilidade em regiões produtoras deste cereal e de elevada complexidade devido principalmente ao elevado teor de cinzas, Saha e Cotta. (2007) investigaram a influência da concentração do H2O2 em solução para maximizar a liberação de açúcares após hidrólise enzimática com celulases, β-glicosidase e xilanases. O aumento da concentração de H2O2 (0 a 7,5% v/v) acarretou maiores liberações de açúcares da biomassa da casca de arroz. No entanto, com a concentração fixada em 10% houve redução na liberação de açúcares (Figura 5).
Figura 5: Efeito da concentração de H2O2 em solução para o pré-tratamento (pH 11,5, 35 °C, 24 h) da casca de arroz (15,0% m/v) na sacarificação enzimática (45 °C, pH 5,0, 72 h, 0,4 mL de cada preparação enzimática. g de casca de arroz-1). Adaptado de Saha e Cotta, 2007.
A temperatura de pré-tratamento é uma variável que está diretamente relacionada com a demanda de energia do método de pré-tratamento, o que incide no custo do processo. Os métodos de pré-tratamentos utilizados em níveis de planta piloto e de demonstração consomem elevadas quantidades de energia, pois operam em temperaturas elevadas (180 - 250 °C). Estudos com H2O2 alcalino são realizados em condições amenas de temperatura (25 - 70 °C) e pressão. O efeito do aumento da temperatura no pré-tratamento com H2O2 varia de acordo com a biomassa lignocelulósica avaliada. Para a biomassa de palha de centeio, pré-tratada com 2% (m/v) H2O2, pH 11,5 e 12 h da reação, o aumento da temperatura acarretou maiores solubilizações de lignina e hemicelulose para a fração líquida (Tabela 3).
65 Tabela 3: Efeito da temperatura na solubilização de lignina e hemicelulose (% matéria seca) presentes na biomassa de palha de centeio pré-tratada com H2O2 (2%, pH 11,5 por 12 h). Adaptado: Sun et al. (2000). Fração da biomassa
Temperatura da reação de pré-tratamento (°C) 20
30
40
50
60
70
Lignina solubilizada (%)
52,7
75,7
81,8
83,1
85,8
87,8
Hemicelulose solubilizada (%)
44,2
52,5
70,0
70,0
71,3
71,9
Para a biomassa de bagaço de cana-de-açúcar, o aumento da temperatura não influenciou na maior liberação de açúcares redutores totais e glicose na hidrólise enzimática, sendo os melhores resultados na conversão de celulose em glicose (62,4%) obtidos com temperatura de 20 °C, 5% H2O2, 4% sólidos totais (m/v) por 6 h (Rabelo et al., 2008). A eficiência do pré-tratamento com H2O2 alcalino é fortemente dependente do pH do meio, pois está associado a geração do ânion hidroperóxido, conforme descrito na Equação 1. Estudos de Gould (1985) demonstraram que o valor ótimo de pH é de 11,5 (Figura 6).
Figura 6: Efeito do valor inicial do pH na reação de pré-tratamento da biomassa de kenaf (1% H2O2, 2% sólidos totais (m/v), 25 °C por 24 h). Adaptado: Gould, 1985. ED: Eficiência de deslignificação.
Estudos reportam o uso de H2O2 sem correção do pH do meio o que acarreta menores eficiências de liberação de açúcares durante a hidrólise enzimática. Em um estudo comparativo de pré-tratamentos químicos de biomassa de plantas aquáticas usadas na depuração de água, o pré-tratamento com H2O2 não foi efetivo para melhorar
66 a hidrólise enzimática (10 % m/v sólidos totais; 1% v/v H2O2; temperatura ambiente por 2 h). No entanto quando combinado com solução de NaOH foram obtidos os melhores resultados de hidrólise enzimática (1% m/v NaOH, temperatura ambiente por 12 h seguida da adição de 1% m/v H2O2, temperatura ambiente por 12 h) (Mishima et al., 2006). A análise conjunta das variáveis que afetam o pré-tratamento com H2O2 alcalino é de suma importância para descrever as condições ótimas para cada tipo de biomassa lignocelulósica avaliada e, dependendo do objetivo de aproveitamento dos açúcares liberados podem ser ajustadas e otimizadas.
67 5.
ESTUDOS
COMPARATIVOS
DE
PRÉ-TRATAMENTO
COM
H 2 O2
ALCALINO O tipo de pré-tratamento escolhido para melhorar a eficiência da hidrólise enzimática depende do tipo de biomassa disponível e do objetivo de utilização dos açucares liberados. Em estudo comparativo para produção de açúcares a partir da biomassa de palha de milho foram avaliados os pré-tratamentos com H2O2 (10% m/v sólidos totais, 0,5 g H2O2/g sólidos totais, temperatura ambiente por 24 h) e explosão com amônia (AFEX - 2:1 amônia/sólidos, conteúdo de umidade 200%, 150 °C e tempo de residência de 30 minutos). Os melhores resultados expressos pela liberação de glicose (95 ± 2,4% x 61,5 ± 1,5%) e xilose (75,1 ± 0,9% x 53,4 ± 2,1%) foram obtidos com o uso do H2O2 alcalino (Banerjee et al., 2011). Em outro estudo comparativo, caules de algodão foram submetidos a 4 tipos de pré-tratamentos; ácido sulfúrico (H2SO4), hidróxido de sódio (NaOH), peróxido de hidrogênio (H2O2) (10% m/v sólidos, 0,5; 1 e 2% m/v, 90 e 121 °C à 15 psi por 30, 60 e 90 minutos) e ozônio (4 °C por 30, 60 e 90 minutos com injeção continua de ozônio), para melhorar a hidrólise enzimática. Os sólidos pré-tratados foram submetidos à sacarificação enzimática com Celluclast 1.5L e Novozym 188 nas seguintes condições: 5% sólidos, pH 4,8, 50 °C, 150 rpm e 40 FPU/g celulose. Nestas condições o prétratamento com H2O2 não foi efetivo na conversão de glicose quando comparado ao prétratamento com NaOH (49,82 ± 1,40% x 60,79 ± 2,75%) mas apresentou melhor desempenho que o pré-tratamento com H2SO4 (49,82 ± 1,40% x 23,85 ± 1,21%). Cabe salientar que os autores não efetuaram a reação de pré-tratamento com H2O2 em pH ótimo (11,5), o que pode ter influenciado na baixa deslignificação observada (32,01% à 2%, 60 min., 121 °C à 15 psi) (Silvestein et al., 2007). A fim de investigar o uso do bagaço de sorgo sacarino para a produção de bioetanol, a biomassa foi submetida a 5 tipos de pré-tratamento, NaOH diluído com autoclavagem (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH autoclavado 121 °C por 60 min), NaOH concentrado (10% m/v sólidos totais, 20% m/v NaOH, temperatura ambiente por 2h), NaOH diluído com autoclavagem e imersão em H2O2 (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH, 121 °C por 60 min., após atingir temperatura ambiente adição de 5% w/v H2O2 por 24 h), H2O2 alcalino (10% m/v sólidos totais, 2% m/v NaOH por 2h, adição de 5% m/v H2O2, temperatura ambiente por 24 h); e autoclavagem (10% m/v sólidos totais, 121 °C por 60 min). Os resíduos sólidos dos diferentes pré-tratamentos, após lavagem com água, foram submetidos à hidrólise enzimática com Celluclast1.5 L e Novozymes
68 188, com carga enzimática de 20 FPU g sólidos-1 e 40 IU g sólidos-1 com carga de sólidos de 2%, pH 4,8, com agitação à 50 °C. Nas condições citadas, o melhor prétratamento foi a combinação de solução diluída de NaOH com imersão em H2O2 com resultado de 74,29 ± 0,81% de conversão de celulose (Cao et al., 2012). Além de palha de milho, caules de algodão e bagaço de sorgo sacarino, estudo com palha de cevada foi realizado com vistas a obter a melhor estratégia de sacarificação enzimática. A biomassa foi submetida a 3 tipos de pré-tratamentos, ácido diluído (10% m/v sólidos totais, 0,75% m/v H2SO4, 121 °C por 1h), lime (10% m/v sólidos totais, 1% m/v Ca(OH)2, 121 °C por 1h) e H2O2 alcalino (10% m/v sólidos totais, 2,5% m/v H2O2, pH 11,5, 250 rpm, 35 °C por 24h). A sacarificação enzimática do material pré-tratado foi realizada com enzimas comerciais, Celluclast 1.5L (celulase), Novozym 188 (β-glicosidase) e ViscoStar 150L (hemicelulase) com dose de 0,15 mL de cada enzima por g sólidos-1, pH 5,0, 45 °C por 120 h. Nas condições citadas no estudo, o melhor resultado de sacarificação enzimática foi obtido com o prétratamento com H2O2 alcalino (94% x 91% lime x 88% ácido diluído) (Saha e Cotta, 2010).
69 6. PRINCIPAIS DESAFIOS DO USO EM LARGA ESCALA DO H2O2 ALCALINO
PARA
PRÉ-TRATAMENTO
DE
BIOMASSA
LIGNOCELULÓSICA O uso do peróxido de hidrogênio em meio alcalino apresenta vantagens e desvantagens, assim como qualquer método de pré-tratamento. Dentre as principais vantagens estão o baixo consumo de energia, a não geração de inibidores (hidroximetilfurfural e furfural), a fácil disponibilidade de aquisição do H2O2 e do NaOH, a não necessidade de reatores especiais para a reação de pré-tratamento e compatibilidade com altas cargas de sólidos. Além disso, o uso do H2O2 alcalino acarreta condições de esterilidade para o processo de pré-tratamento e hidrólise enzimática, dispensando a necessidade do uso de antibióticos (Banerjeeet al., 2012). Como desvantagem, a salinidade gerada com correção do pH (uso de HCl) para a etapa de hidrólise enzimática, uma vez que as reações de pré-tratamento ocorrem no valor de pH ótimo de 11,5 e a hidrólise enzimática geralmente é conduzida em pH 4,8. Além disso, um dos principais entraves para o escalonamento do H2O2 está no preço deste reagente em conjunto com o NaOH. Estima-se que para processar 1 tonelada de biomassa de palha de milho, o custo envolvido seria de US$ 102-125 para reação de pré-tratamento com baixa concentração de H2O2 (0,125 g H2O2/g biomassa) somados à US$ 36 para NaOH ($ 300/t) (Banerjee et al., 2011). Uma das soluções para contornar o alto custo do H2O2 é usá-lo em concentrações reduzidas durante o prétratamento, o que geralmente acarreta em necessidade de controle do pH da reação. Outro desafio importante está na necessidade de moagem inicial da biomassa a ser pré-tratada com H2O2. É um fato que a diminuição do diâmetro da partícula aumenta a área superficial e melhora a eficiência de pré-tratamento e hidrólise enzimática. A maioria dos trabalhos citados nesta revisão usaram diâmetros de partículas reduzidos (0,5 - 3 mm) o que acarreta elevação dos custos do processo. No entanto, já foi reportado na literatura o uso do H2O2 alcalino para pré-tratamento biomassa de bagaço de cana-de-açúcar sem a necessidade do processo de moagem com resultados satisfatórios de hidrólise enzimática (Rabelo et al., 2008). Além disso, geralmente estudos experimentais são conduzidos com quantidades entre 1-10 g o que gera resultados elevados de eficiência de pré-tratamento e hidrólise enzimática. Quando se realiza o aumento de escala dos protocolos experimentais, nem sempre são atingidos os valores relatados na etapa de laboratório. Isto acontece principalmente pelas dificuldades de processo como transferência de massa e
70 dificuldade de agitação para o contato sólido-reagente. No entanto, em estudo recente realizado com biomassa de palha de milho, o aumento de escala foi realizado com sucesso. Em escala de laboratório, 1 g de palha de milho foi pré-tratada com 0,125 g H2O2 g sólidos-1 com controle de pH com eficiência de liberação de glicose de 73,8 ± 2,2%; e em escala de demonstração 1 kg de palha de milho foi pré-tratada em condições semelhantes com eficiência de liberação de glicose de 75% (Banerjee et al., 2011; Banerjee et al., 2012).
71 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS O pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino é comprovadamente eficiente para pré-tratar uma gama variada de biomassas, com resultados elevados de eficiência de hidrólise enzimática ao ser usado de forma isolada ou com combinação com outro método de pré-tratamento. Além disso, valores elevados de solubilizações de lignina e hemicelulose para a fração líquida credenciam fortemente este método de prétratamento em biorrefinarias.
72 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGUIAR, A. e FERRAZ, A. Mecanismos envolvidos na biodegradação de materiais lignocelulósicos e aplicações tecnológicas correlatas. Química Nova, v.34, n.10, p.1729-1738, 2011. ALVIRA, P.; TOMÁS-PEJÓ, E.; BALLESTEROS, M.; NEGRO, M.J. Pretreatment Technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, v.101, n.13, p.4851-4861, 2010. BANERJEE, G.; CAR, S.; LIU, T.;WILLIAMS, D.L.; MEZA, S.L.; WALTON, J.D.; HODGE, D.B. Scale-up and integration of alkaline hydrogen peroxide pretreatment, enzymatic hydrolysis, and ethanolic fermentation. Biotechnology and Bioengineering, v.109, n.4, p.922-931, 2012. BANERJEE, G.; CAR, S.; SCOTT-CRAIG, J.; HODGE, D.B.; WALTON, J.D. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnology for Biofuels, v.4, n.16, p.1-15, 2011. CAO, W.; SUN, C.; LIU, R.; YIN, R.; WU, X. Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse. Bioresource Technology, v.111, s/n, p.215-221, 2012. CHENG, J.J.; e TIMILSINA, G.R. Status and barriers of advanced biofuel technologies: A review. Renewable Energy, v.36, n.12, p.3541-3549, 2011. GALBE, M.; e ZACCHI, G. Pretreatment: The key to efficient utilization of lignocellulosic materials. Biomass and Bioenergy, In press, 2012. GOULD, J.M. eFREER, S.N. High-efficiency ethanol production from lignocellulosic residues pretreated with alkaline H2O2. Biotechnology and Bioengineering, v. 26, n.6, p.628-631, 1984. GOULD, J.M. Enhanced polysaccharide recovery from agricultural residues and perennial grasses treated with alkaline hydrogen peroxide. Biotechnology and Bioengineering, v.27, n.6, p.893-896, 1985b. GOULD, J.M. Studies on the mechanism of alkaline peroxide delignification of agricultural residues.Biotechnology and Bioengineering, v.27, n.3, p.225-231, 1985a. GOULD, J.M.; JASBERG, B.K.; FAHEY, G.C.; BERGER, L.L. Treatment of wheat straw with alkaline hydrogen peroxide in modified extruder.Biotechnology and Bioengineering, v.33, n.2, p.233-236, 1989. KARAGOZ, P.; ROCHA, I.V.; OZKAN, M.; ANGELIDAKI, I. Alkaline peroxide pretreatment of rapeseed straw for enhancing bioethanol production by same vessel saccharification and co-fermentation. Bioresource Technology, v.104, s/n, p.349-357, 2012.
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conversion
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75
CAPÍTULO III
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO COLMO DE DIFERENTES CULTIVARES DE SORGO SACARINO EM PERNAMBUCO, NORDESTE DO BRASIL
Artigo publicado. Sugar Tech, v.15, n.3, p.316-321, 2013. DOI 10.1007/s12355013-0240-y. Anexo 1
76
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO DO COLMO DE DIFERENTES CULTIVARES DE SORGO SACARINO EM PERNAMBUCO, NORDESTE DO BRASIL
RESUMO A disponibilidade das reservas e as questões ambientais evidenciam o declínio dos combustíveis fosseis no futuro. Os biocombustíveis apresentam-se como alternativa renovável para produção de combustíveis, com destaque para o etanol. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir da fermentação do caldo dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino, oriundos de experimento de avaliação de cultivares com potencial energético no município de Itambé, PE. Foram conduzidos experimentos de fermentações dos caldos, delineados inteiramente ao acaso com 8 tipos de caldos e 3 repetições, com levedura industrial Saccharomyces cerevisiae à 33 °C sob condição estática com tempo de 6h. Os resultados indicaram diferenças significativas entre as cultivares (p < 0,01) para todos os parâmetros avaliados, com destaque para a concentração de etanol e as altas produtividades volumétricas a partir da fermentação dos caldos das cultivares Willey (P = 64,77 ± 4,4 g.L-1 e Qp= 10,79 ± 0,74 g.L-1.h-1), Wray (P = 59,10 ± 1,7 g.L-1 e Qp = 9,85 ± 0,28 g.L-1.h-1) e BR 506 (P = 59,07 ± 1,3 g.L1 e Qp = 9,84 ± 0,21). No entanto, os maiores potenciais para produção de etanol por hectare foram observados para as cultivares SF 15 (3142,51 ± 428,47 L.EtooH.ha-1) e BR 506 (2193,95 ± 383,58 L.EtooH.ha-1). Palavras-chave: Fontes Renováveis, Biocombustíveis, Fermentação alcoólica, Culturas Energéticas.
77 ABSTRACT The decline in the use of fossil fuels in the future is evidenced by the availability of its reserves and related environmental issues. Biofuels are presented as a renewable alternative to fossil fuel production, including ethanol. However, ethanol production demands the use of agricultural land and other natural resources, with emphasis on water. The purpose of this study was to evaluate the potential of eight sweet sorghum cultivars in order to expand the ethanol production to areas with limited supply of water, not suitable for sugarcane without irrigation. The samples of cultivars produced by breeding programs in the state of Pernambuco, Brazil, were analyzed for fermentation by industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, at 33°C, under static conditions for a period of 6 hours. All assessed parameters showed some statistically significant differences among cultivars (p < 0.01), especially ethanol concentration (P) and the volumetric productivities (Qp) in the following order: Willey (P = 64.77 ± 4.4 g L-1 and Qp= 10.79 ± 0.74 g L-1h-1), Wray (P = 59.10 ± 1.7 g L-1 and Qp = 9.85 ± 0.28 g L-1h-1) and BR 506 (P = 59.07 ± 1.3 g L-1 and Qp = 9.84 ± 0.21 g L-1h-1). The highest potentials for ethanol yield per hectare were observed for the cultivars SF 15 (3142.51 ± 428.47 L ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 L ha-1). Therefore, the cultivar BR 506 seems to be very promising as an energy crop to be produced in areas with environmental conditions similar to Pernambuco.
Keywords: Renewable Sources; Biofuels; Alcoholic fermentation; Energy Crops.
78
1. INTRODUÇÃO A magnitude do uso atual de combustíveis de origem fóssil tende a um declínio no futuro devido a diversos fatores, como a disponibilidade e facilidade de acesso as reservas existentes e, principalmente, devido aos efeitos da emissão de gases de efeito estufa sobre o meio ambiente. Neste contexto tem-se buscado cada vez mais o uso de fontes renováveis de energia, dentre elas as baseadas em bioenergia (energia proveniente de biomassas) incluindo-se o uso de culturas energéticas para a produção de biocombustíveis, como o biodiesel e etanol (Sánchez e Cardona, 2008). A produção de etanol vem crescendo, a cada ano, no mundo. O etanol pode ser produzido a partir de diferentes fontes de biomassa, como as culturas amiláceas (milho e grãos de cereais), sacarinas (cana-de-açúcar, beterraba sacarídea e o sorgo sacarino) e celulósicas (madeiras e resíduos das culturas) (Walker, 2011). No Brasil, a produção de etanol é proveniente principalmente da fermentação do caldo sacarino da cana-deaçúcar. Nos anos de 2009-2010, foram produzidos no Brasil aproximadamente 24 bilhões de litros de etanol, com estimativas de aumento para 37 bilhões entre 2012-2013 (Amorin et al., 2011). Porém a produção de etanol a partir da cana-de-açúcar tem limitações principalmente em áreas de precipitação reduzida, o que evidencia a necessidade de inserção de novas matérias-primas para produção de etanol a partir de culturas energéticas que possuam uma maior eficiência no uso de água, como o sorgo sacarino. O sorgo é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol, e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilokoglou et al., 2011). É uma gramínea C4, cultivada em vários países, e que apresenta um ciclo fotossintético eficiente. É originário da África sendo o quinto cereal mais cultivado no mundo. Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005) como complemento de ração animal e para obtenção de fibras (Murray et al., 2008). Suas principais características residem na eficiência no uso de água (1/3 da cana-de-açúcar e 1/2 do milho) e no bom desenvolvimento em diferentes tipos de clima e solos. Em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos e 50 t ha-1 de colmos, sendo o caldo presente no colmo, rico em sacarose, glicose e frutose, a parte de maior interesse para a produção de etanol de
79 primeira geração (Wu et al., 2010). A produção de etanol a partir da fermentação do caldo do sorgo situa-se em aproximadamente 3451 L.ha-1 (Prasad et al., 2007). No contexto da busca por novas matérias-primas para a produção de biocombustíveis, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir da fermentação do caldo extraído dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino, oriundos de experimento de avaliação de cultivares com potencial energético no município de Goiana, PE.
80 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Obtenção da biomassa de sorgo sacarino e caracterização dos caldos
Os colmos das diferentes cultivares de sorgo foram gentilmente cedidas pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA) através de ensaio de campo para avaliação da produtividade de biomassa de cultivares de sorgo no município de Itambé, PE, localizado na Zona da Mata Norte de Pernambuco com precipitação média anual de aproximadamente 1600 mm e temperatura média ambiental de 25 °C. As cultivares avaliadas foram: IPA 467-4-2, Rio, Roma, Theys, Tale, Willey, Wray, BR 501, BR 506 e SF 15. A colheita foi realizada na fase de maturação dos grãos. A partir da biomassa colhida foram removidas as folhas e as panículas dos colmos a fim de proceder à extração do caldo à colmo limpo em sistema moenda simples de caldo de cana. Os diferentes caldos de sorgo foram caracterizados inicialmente quanto: (1) teor de °Brix usando refratômetro portátil modelo RT-30ATC da Instruterm com escala de 0 a 32 °Brix; (2) concentração de açúcares redutores totais (ART) pelo método do acido 3-5dinitrossalicílico (Miller, 1959); (3) teor
de nutrientes, após digestão sulfúrica
catalisada com peróxido de hidrogênio (Thomas et al., 1967): Nitrogênio total (Nt) pelo método Kiehldal, Fósforo total (Pt) por colorimetria e Potássio (K) por fotometria de chamas (Embrapa, 1999); e (4) pH em potenciômetro de bancada da marca Digimed. Posteriormente os caldos foram armazenados em freezer à -4 °C para posteriores ensaios de fermentações.
2.2 Ensaios de fermentação As fermentações foram conduzidas no sistema batelada simples em erlenmeyers de 500 mL de volume total sob temperatura controlada a 33 °C e em condição estática pelo período de 6 h. Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata dispostos em delineamento inteiramente casualizado. Nos erlenmeyers foram adicionados 100 mL de caldo de sorgo não esterilizado e inoculados com 10 % m/v (108 células.mL-1) de fermento industrial (leite puro) obtido junto a destilaria Japungú-PB com perfil predominante da linhagem de Saccharomyces cerevisiae - P1 (Silva-Filho et al., 2005)
81 Após as fermentações, os caldos fermentados foram centrifugado a 8000 rpm por 5 minutos e os sobrenadantes coletados e submetidos as análises analíticas. Nos caldos fermentados foram determinados açúcares redutores totais pelo método DNS (Miller, 1959) expresso em equivalente de glicose. O etanol produzido foi quantificado pelo método cromatográfico, utilizando-se um cromatógrafo gasoso modelo CG-90 com detector por ionização de chamas nas seguintes condições operacionais: 95 °C, 130 °C e 160 °C para as temperaturas da coluna, do injetor e do detector, respectivamente. O gás de arraste utilizado foi N2. A viabilidade celular foi determinada em câmara de Neubauer utilizando Azul de Metileno como discriminante de células. Os parâmetros cinéticos calculados nas fermentações foram: produtividade volumétrica de etanol (QP), rendimento de etanol (Yp,s) expresso em g de etanol.g-1 de açúcar consumido e eficiência de conversão de açúcares em etanol (ECA). Conforme as equações (1) e (2).
Onde P concentração de etanol (g.L-1), T tempo de fermentação (h) e 0,51 rendimento teórico máximo de etanol por consumo de 1g de glicose.
2.3 Produção de etanol calculada Com os resultados de açúcares redutores totais e eficiência de conversão dos açúcares em etanol foi determinada a produção teórica de etanol por hectare para cada cultivar de sorgo sacarino avaliada, de acordo com equação (3) proposta por (Zhao et al., 2009) com modificações no uso do valor da eficiência de conversão dos açúcares em etanol.
82
Onde ART (açúcares redutores totais, %), biomassa fresca (produção de biomassa fresca para cultivar de sorgo sacarino, Mg.ha-1), 6,5 (conversão de açúcares em etanol), ECA (Eficiência de conversão dos açúcares em etanol); e 0,79 (densidade do etanol em g.mL-1).
2.4 Análises estatísticas O desenho experimental utilizado foi inteiramente casualizado e todas as determinações analíticas foram realizadas em triplicata. Os resultados obtidos para °Brix, teores de Nt, P e K, concentração de ART inicial, pH inicial e final, etanol, produtividade volumétrica, rendimento, eficiência de conversão de açúcares em etanol e produção teórica de etanol por hectare foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as medias foram comparadas pelo teste de Tukey a um nível de significância de p ≤ 0,05 usando o Software ASSISTAT (Silva e Azevedo, 2002).
83
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Caracterização química dos caldos
Os resultados para ART, °Brix, Nt, P, K e pH estão expressos na tabela 1. A ANOVA indicou diferenças significativas (p < 0,01) entra as cultivares avaliadas para todas as variáveis de caracterização química dos caldos. Os caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 apresentaram os caldos com maiores °Brix e ART (Tabela 1). A produção de etanol a partir da fermentação submersa de caldos sacarinos está diretamente relacionada com a concentração de ART, ou seja, ate certo limite caldos com maiores concentrações de ART e °Brix acarretam maiores concentrações de etanol pelas leveduras. Acima de 270 g.L-1 fermentação em alta grávida com grande possibilidade de inibição pelo substrato e elevado estresse oxidativo (Thomas et al., 1999).
Tabela 1: Caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino obtidas de experimento de campo no município de Goiana – PE. °Brix
ART (g.100mL-1)
Nt (ppm)
IPA 467
13,0 ± 0,2 e1
10,59 ± 0,6 c
591,3 ± 70,4 c
Rio
12,7 ± 0,12 e
12,10 ± 0,7 bc
Tale
10,8 ± 0,2 f
Willey
Cultivares
P (ppm)
K (ppm)
pH
54,4 ± 1,7 b
2808,7 ± 126,8 de
5,14 ± 0,01 c
641,1 ± 52 bc
32,4 ± 1,1 f
4356 ± 425,5 b
4,73 ± 0,02 e
10,47 ± 0,5 c
595,9 ± 36,5 c
48,5 ± 1,6 c
2390,7 ± 386 ef
5,26 ± 0,02 b
18,27 ± 0,12 a
17,28 ± 1,4 a
295,5 ± 62,2 d
37,2 ± 1,9 e
5729,2 ± 292,7 a
5,10 ± 0,02 c
Wray
16,3 ± 0,12 c
15,82 ± 0,4 a
737,9 ± 26,6 b
43,7 ± 0,9 d
3325,8 ± 111 cd
4,60 ± 0,02 f
BR 501
9,7 ± 0,12 g
6,39 ± 0,5 d
971,7 ± 50,5 a
24,5 ± 2,1 g
5879,6 ± 556,4 a
4,96 ± 0,02 d
BR 506
17,0 ± b
16,48 ± 0,4 a
727,1 ± 15,8 bc
54,2 ± 0,6 b
3726,3 ± 200,5 bc
5,11 ± 0,01 c
SF 15
13,6 ± d
13,34 ± 0,5 b
916,4 ± 54,4 a
84,2 ± 1,8 a
1726,6 ± 168,6 f
5,41 ± 0,02 a
Média geral
13,9
12,81
681,2
47,4
3742,9
5,1
CV (%)
1,2
5,5
7,2
3,3
8,6
0,3
n=3 ± desvio padrão 1: Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
O °Brix é uma análise rotineira nas empresas que produzem açúcar e etanol, e possibilita leitura direta no campo dos teores de açúcares nos caldos. Esta variável
84 expressa à concentração de sólidos solúveis no caldo em g.100 mL-1 que devem ser correlacionados com os teores de açúcares redutores totais. Para as condições experimentais estudadas o aumento do °Brix nos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino acarretou aumento linear (R2=0,895) nos teores de ART (Figura 1). Outros estudos de fermentação de caldos de sorgo sacarino demonstraram correlação linear entre a concentração de ART e °Brix (Guigou et al., 2011 - R2 = 0,960 e Tsuchihaschi e Goto, 2004 - R2 = 0,807).
Figura 1: Correlação entre o °Brix e os teores de açúcares redutores totais (ART) para os caldos das cultivares de sorgo sacarino.
Além da concentração de açúcares no caldo, a quantificação dos teores de nutrientes e do pH são essenciais para monitorar a qualidade da matéria-prima no processo de fermentação. Foram observados elevados teores de Nt, P e K no caldo de todas as cultivares (Tabela1). Os teores de nutrientes nos caldos são influenciados pelo tipo de solo, manejo das culturas e pela capacidade de cada cultivar em absorver os nutrientes do solo. O pH é uma variável de extrema relevância no processo fermentativo, uma vez que controla a dissolução dos nutrientes, atividade enzimática e impede a proliferação de micro-organismos contaminantes da fermentação alcoólica (Lima et al., 2002). Os resultados do pH inicial dos caldos das 8 cultivares avaliadas foi de 5,04 (4,60 – 5,41) o que determina um valor adequado para a fermentação com leveduras (pH 5,0 – 6,5). Resultados semelhantes para os valores de pH foram observados para cultivar Dale - 5,4 (Dimple et al., 2010) e para cultivares sacarinas e
85 forrageiras, 4,56 (Davila-Gomes et al., 2011). Para todas as fermentações houve reduções nos valores de pH (dados não apresentados), que podem estar relacionadas com a produção de ácidos orgânicos no metabolismo dos açúcares pelas leveduras (Bai et al., 2008). 3.2 Fermentação alcoólica dos caldos e produção de etanol por hectare Os resultados para os parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino estão apresentados na tabela 2. A ANOVA para as concentrações de etanol (P) evidenciaram diferenças significativas (p < 0,01) entre as cultivares, com destaque para as cultivares Willey, Wray e BR 506. As maiores concentrações de etanol obtidas durante a fermentação dos caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 podem ser explicadas pela elevada concentração de ART inicial, uma vez que os dados experimentais demonstraram correlação linear (R2=0,893) entre as concentrações de açúcares redutores totais iniciais e a concentração de etanol (Figura 2). Para o conjunto dos dados experimentais, a media geral da concentração de etanol para a fermentação dos diferentes caldos foi de 50,06 g.L-1 (30,6 – 69,8 g.L-1) resultado inferior ao observado no estudo realizado por Laopaiboon et al. (2007) na fermentação do caldo de sorgo sacarino variedade Keller, com valor médio de P = 89,47 g.L-1. Esta diferença pode ser explicada pela maior concentração de sólidos solúveis, pela suplementação de nutrientes e pelo maior tempo de fermentação (media de 48 h).
86
Tabela 2: Parâmetros cinéticos na fermentação estática de diferentes caldos de cultivares de sorgo sacarino utilizando fermento industrial (leite puro) obtida na destilaria Japungú, PB à 33 °C. P (g.L-1)
Qp(g.L-1.h-1)
Yp/s
IPA 467
52,10 ± 0,7 cd
8,68 ± 0,12 cd1
0,49 ± 0,03 a
Rio
50,83 ± 3,6 cd
8,47 ± 0,59 cd
0,42 ± 0,04 bc
Tale
45,60 ± 2,3 d
7,60 ± 0,38 d
0,44 ± 0,02 abc
Willey
64,77 ± 4,4 a
10,79 ± 0,74 a
0,44 ± 0,01 abc
Wray
59,10 ± 1,7 ab
9,85 ± 0,28 ab
0,38 ± 0,02 c
BR 501
31,00 ± 0,4 e
5,16 ± 0,07 e
0,49 ± 0,04 ab
BR 506
59,07 ± 1,3 ab
9,84 ± 0,21 ab
0,40 ± 0,01 c
SF 15
54,40 ± 0,4 bc
9,07 ± 0,06 bc
0,42 ± 0,02 de
Media Geral
52,10
8,68
0,43
CV(%)
4,42
4,42
5,83
Cultivares
*valores para n=3 ± desvio padrão. ART: Açucares redutores totais; P: Concentração de etanol; Q p: Produtividade volumétrica de etanol; Yp/s: rendimento de etanol por grama de açúcar consumido: Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
87
Figura 2: Correlação entre os teores de açúcares redutores totais (ART) e as concentrações de etanol nos caldos fermentados das cultivares de sorgo sacarino.
De forma semelhante à concentração de etanol, os resultados da ANOVA para a produtividade volumétrica de etanol (Qp) apresentaram diferenças significativas (p < 0,01) entre as cultivares, sendo as maiores Qp observadas para as variedades Willey, Wray e BR 506. A Qp está diretamente relacionada com a concentração de etanol e o tempo de fermentação e representa um parâmetro cinético de suma importância para a viabilidade comercial da fermentação alcoólica. Neste sentido, a produtividade volumétrica média para o conjunto dos dados experimentais obtidos nas fermentações, de 8,34 g.L-1.h-1 está acima dos principais valores para a fermentação de caldo de sorgo sacarino encontrados na literatura (Khongsay et al., 2010 - 1,92 g.L-1.h-1 e Ratnavathi et al., 2010 - 1,16 g.L-1.h-1]. Esta diferença pode ser explicada pelos elevados tempos de fermentação conduzidos nos estudos citados, entre 36 e 60 h. Os resultados ANOVA para o rendimento (Yp/s) e para a eficiência de conversão de açúcares em etanol (ECA) foram semelhantes, com destaque para as cultivares IPA 467 e BR 501. Os melhores resultados para estas cultivares podem estar relacionados com os reduzidos teores de etanol observados na fermentação dos caldos, pois o etanol pode agir como inibidor do processo fermentativo (Walker, 2004). Para o conjunto de dados experimentais os valores médios de Yp/s e ECA, 0,46 g.g-1 e 89,0 %, estão de acordo com os principais resultados encontrados na literatura para a fermentação de caldo de sorgo sacarino (0,35 – 0,48 g.g-1 e 68 – 94 %) (Guigou et al., 2011); e (92,45
88 %) (Wu et al., 2010), o que demonstra a fermentabilidade dos caldos das cultivares avaliadas. Os resultados para a produção teórica de etanol por hectare estão expressos na tabela 3. A ANOVA indicou diferenças significativas entre as cultivares de sorgo sacarino avaliadas (p < 0,01). Os maiores valores foram obtidos para as cultivares SF 15 (3142,51 ± 428,47 L.ha-1) e BR 506 (2193,95 ± 383,58 L.ha-1), influenciados pela elevada produção de biomassa verificados para as duas cultivares. De uma forma geral foram observados baixos valores de produção teórica de etanol por hectare (média geral = 1741,92), o que denota a necessidade de melhoramento das práticas de cultivo do sorgo sacarino sob as condições ambientais avaliadas (Khongsay et al., 2010) e aumento da eficiência de conversão dos açúcares em etanol. Em estudo conduzido por Zhao et al. (2009) em condições ambientais diferentes e com cultivares diferentes foram estimados valores de 4729 L.ha-1 média para dois anos de cultivo. Tabela 3: Produção teórica de etanol por hectare para as cultivares de sorgo sacarino cultivadas no município de Goiana, PE. Mg.ha-1
ECA (%)
L.EtooH.ha-1
IPA 467
26,77 ± 9,88
97,17 ± 5,40 a
1917,29 ± 825,43 bc
Rio
11,97 ± 2,20
82,95 ± 7,53 bc
948,56 ± 121,84 cd
Tale
17,57 ± 2,39
86,57 ± 1,71 abc
1305,39 ± 174,76 bcd
Willey
13,72 ± 1,71
86,60 ± 2,03 abc
1681,21 ± 154,44 bcd
Wray
22,17 ± 2,67
74,05 ± 4,02 c
2065,54 ± 224 b
BR 501
13,56 ± 0,20
96,34 7,78 a
680,95 ± 16,30 d
BR 506
20,01 ± 2,88
79,38 ± 0,72 c
2193,95 ± 383,58 ab
SF 15
35,44 ± 4,98
81,67 ± 3,35 c
3142,51 ± 428,47 a
Média geral
20,15
85,59
1741,92
CV (%)
-----
5,64
21,59
Cultivares
*valores para n=3 ± desvio padrão. ECA: Eficiência de conversão de açúcares em etanol, L.EtooH.ha -1: Calculado de acordo com a equação = ART(%) x Biomassa fresca (Mg.ha-1) x 6,5 x ECA x (1/0,79). Médias com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
89
4. CONCLUSÕES Os caldos das cultivares Willey, Wray e BR 506 apresentaram as maiores concentrações de açúcares redutores totais iniciais e as maiores concentrações de etanol nos caldos fermentados. No entanto, os maiores potenciais para produção de etanol por unidade de área foram observados para as cultivares SF 15 e BR 506.
90 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMODARES, A.; E HADI, M.R. Production of bioethanol from sweet sorghum: A review, African Journal of Agricultural Research, V.4, p.772-780, 2009. AMORIM, H. V.; BASSO, L. V.; LOPES, M. L.; Sugar cana juice and molasses, beet molasses and sweet sorghum: composition and usage. In: The alcohol textbook, 5th edition, Org: INGLEDEW, W.M.; AUSTIN, G.D.; KLUHSPIES, C.; KELSALL, D.R. Nottingham University press: Nottingham, 2009, pp.39-46. BAI, F. W.; ANDERSON, W. A.; MOO-YONG, M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks, Biotechnology Advances, V.26, p. 89-105, 2008. DAVILA-GOMES, F. J.; CHUCK-HERNANDEZ, C.; PEREZ-CARRILLO, E.; ROONEY, W. L.; SERNA-SALDIVAR, S. O. Evaluation of bioethanol production from five different varieties of sweet and forage sorghums (Sorghum bicolor (L) Moench), Industrail Crops and Products, V.33, p.611-616, 2011. DIMPLE, K. K.; BELLMER, D. D.; HUNKE, R. L.; WILKINS, M. R.; CLAYPOOL, P. L. Influence of temperature, pH and yeast on in-field production of ethanol from unsterilized sweet sorghum juice, Biomass and Bioenergy, V.34, p.1481-1486, 2010. EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Informática Agropecuária. “Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes”, 1°Ed, Brasília, 1999, pp.370. GUIGOU, M.; PÉREZ, L. V.; LAREO, C.; LLUBERAS, M. E.; VÁZQUEZ, D.; FERRARI, M. D. Bioethanol production from three sweet sorghum varieties: evaluation of post-harvest treatment on sugar extraction and fermentation, Biomass and Bioenergy, V.35, p. 3058-3062, 2011. KHONGSAY, N.; LAOPAIBOON, L.; LAOPAIBOON, P. Growth and batch ethanol fermentation of Saccharomyces cerevisiae on sweet sorghum stem juice under normal and very high gravity conditions, Biotechnology, V.9, p. 9-16, 2010. LAOPAIBOON, L.; THANONKEO, P.; JAISIL, P.; LAOPAIBOON, P. Ethanol production from sweet sorghum juice in batch and fed-batch fermentations by Saccharomyces cerevisiae, World Journal Microbiology Biotechnology, V.23, p. 1497-1501, 2007.
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93
CAPÍTULO IV
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO E DO BAGAÇO PARA CINCO CULTIVARES DE SORGO SACARINO
94
PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DO CALDO E DO BAGAÇO PARA CINCO CULTIVARES DE SORGO SACARINO
RESUMO O uso da biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol está aumentando no mundo. No Nordeste do Brasil, o Instituto de Pesquisas Agronômicas (IPA) desenvolveu cultivares com aptidão para produção de forragem e energia. No entanto, ainda são escassas as informações sobre a performance destas cultivares para a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. Com isso, o objetivo deste trabalho foi inicialmente identificar a influência da fase de colheita dos colmos de 5 cultivares de sorgo sacarino na produção de açúcares sob condiçoes de sequeiro em Itambé, PE. Posteriormente foi avaliada a produção de etanol a partir do caldo e do bagaço para as diferentes cultivares. O experimento em campo foi conduzido em arranjo fatorial com dois fatores, 5 cultivares x 3 épocas de colheita, com quatro repetições. Os experimentos de fermentação, pré-tratamento e hidrólise enzimática foram delineados inteiramente ao acaso, em quadruplicata. Os dados de todas as variáveis avaliadas foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey (5% probabilidade). Os resultados indicaram influência da fase de colheita sobre o teor de sólidos solúveis totais, sendo a fase de colheita de grão leitoso/pastoso escolhida para as avaliações de produção de etanol de primeira e segunda geração. A produção de etanol a partir do caldo foi influenciada pela cultivar avaliada com maior produção pela cultivar SF 15. Diferenças significativas foram observadas para a composição química dos bagaços da cultivares, mas sem diferença nas eficiências de hidrólise enzimática que em média apresentou 64,87% de conversão de celulose em glicose. A biomassa de cultivares de sorgo sacarino desenvolvidas e adaptadas para a região Nordeste do Brasil apresentam potencial para produção de etanol a partir do caldo e do bagaço. Palavras Chave: Bioenergia, Culturas energéticas, Biocombustíveis, Zona da Mata de Pernambuco.
95 ABSTRACT The use of sweet sorghum biomass as feedstock for ethanol production has been increasing in the world. In Northeastern Brazil, the Agricultural Research Institute of Pernambuco (IPA) developed cultivars that are suitable to be used as forage for animal feeding or as energy source. However, information on the performance of sugar and ethanol production from the juice and bagasse of these cultivars is still scarce. Hence, in this study we aimed to identify how the harvest period of the stems from 5 sweet sorghum cultivars influences the production of sugar and ethanol under rainfed conditions in the municipality of Itambé, state of Pernambuco. Subsequently we evaluated the ethanol production from juice and bagasse of the different cultivars. The field experiment was evaluated in a factorial arrangement with two factors (5 cultivars and 3 harvest periods) and fours replications. The fermentation experiments, pretreatment and enzymatic hydrolysis were delineated in a completely randomized design in quadruplicate. Data obtained for all variables evaluated were submitted to an Analysis of Variance and the means compared by the Tukey test at 5% of probability. Results showed that the harvest period influenced the total soluble solids, and the harvest period of milk grain was chosen for assessments of ethanol production of first and second generation. Ethanol production from juice differed among cultivars with the best performance by cultivar SF 15. Significant differences were observed for the chemical composition of bagasses between cultivars, but there where no difference in efficiencies of enzymatic hydrolysis. The average conversion of cellulose in glucose was 64.87%. The cultivars of sweet sorghum biomass developed and adapted for the Northeastern region of Brazil showed potential for ethanol production from the juice and bagasse. Keywords: Bioenergy, Energy crops, Biofuels, Forest zone of Pernambuco.
96
1.
INTRODUÇÃO A fim de mitigar os efeitos ambientais do uso de combustíveis fósseis no setor
de transporte, crescem no mundo as iniciativas para inclusão dos biocombustíveis na matriz energética, principalmente o etanol. Atualmente são produzidos no mundo cerca de 100 bilhões de litros de etanol, sendo os principais produtores os EUA e o Brasil (Walker, 2011). O etanol pode ser produzido a partir de diferentes tipos de biomassa, com destaque principal para culturas sacarinas (cana-de-açúcar e beterraba sacarina) e amiláceas (milho e trigo). Além disso, esforços de pesquisa estão concentrados para viabilizar a produção a partir da biomassa lignocelulósica (Sánchez e Cardona, 2008). Com o objetivo de aumentar a produção de etanol, culturas energéticas avaliadas em décadas passadas voltaram a despertar interesse de pesquisadores em diversos países como EUA (Han et al., 2012), India (Vinutha et al., 2014), China (Gnansounou et al., 2005) e no Brasil (EMBRAPA, 2011). Dentre as culturas energéticas, o sorgo sacarino vem ganhando destaque para produção de etanol, pois apresenta possibilidade de aproveitamento integral da biomassa que geralmente contém 37% de caldo, 8% de grãos, 36% de bagaço e 19% de folhas (Kim et al., 2012). O sorgo é uma cultura amplamente divulgada quanto ao seu potencial para produção de etanol e vários trabalhos evidenciam o seu potencial como fonte de biomassa com menor exigência de água (Almodares e Hadi, 2009; Vasilakoglou et al., 2011). É uma gramínea com ciclo fotossintético C4, cultivada em vários países, e que apresenta alta eficiência na transformação do CO2 em açúcares via fotossintese. É originário da África, sendo o quinto cereal mais cultivado no mundo. Seu principal uso é como forragem, mas também pode ser utilizado para a produção de energia (Reddy et al., 2005), como complemento de ração animal e para obtenção de fibras (Murray et al., 2008). Suas principais características residem na eficiência no uso de água e no bom desenvolvimento em diferentes tipos de clima e solos (Zegada-Lizarazu e Monti, 2012). Sua produtividade é bastante variável e depende das condições de cultivo e das condições ambientais, mas em geral o sorgo sacarino produz 2 t ha-1 de grãos e 50 t ha-1 de colmos, sendo o caldo presente no colmo, rico em sacarose, glicose e frutose, a parte de maior interesse para a produção de etanol de primeira geração (Wu et al., 2010). A produção de etanol a partir da fermentação do caldo do sorgo situa-se em aproximadamente 3451 L ha-1(Prasad et al., 2007), mas pode variar fortemente em função da região de cultivo e da cultivar avaliada (Teetor et al., 2010).
97 Grande parte das informações sobre o aproveitamento da biomassa de sorgo sacarino para a produção de etanol diz respeito às cultivares desenvolvidas em países como EUA, China e Índia. No Brasil, apesar dos esforços da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) e do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), ainda são poucas as cultivares desenvolvidas para as diferentes condições edafoclimáticas e faltam informações sobre a real produção de etanol para cada cultivar. Em trabalho anterior (Dutra et al., 2013), foi demonstrado o potencial de algumas cultivares de sorgo sacarino, colhidas na fase de maturação, em Pernambuco com valores teóricos de etanol por hactare entre 681 e 3142 L a partir da fração caldo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi inicialmente avaliar a melhor fase de colheita dos colmos e posteriormente a
produção de etanol a partir do caldo e do bagaço de
diferentes cultivares com histórico de produção na região Nordeste do Brasil.
98
2.
MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Experimento de campo Um experimento de campo foi conduzido, em 2011, na estação experimental do
Instituto Agronômico de Pernambuco (07º24' S e 35º06' W Gr), em Itambé, Zona da Mata Norte de Pernambuco, para avaliar o desempenho agronômico das cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502. A área apresenta precipitação média anual de 1200 mm e temperatura média anual de 25°C. O solo na área experimental foi caracterizado como franco argilo-arenoso, contendo 577, 102, 321 g.kg-1 de areia, silte e argila, respectivamente. Aproximadamente 30 dias do plantio foram aplicados 1,5 Mg.ha-1 de calcário. Também foi realizada uma adubação de fundação aplicando 777 kg.ha-1 da formulação N (Uréia), P (Superfosfato simples) e K (Cloreto de potássio) 9090-60. Um mês após o plantio foi realizada uma adubação de cobertura aplicando 60 kgN.ha-1 na forma de uréia. A colheita dos colmos foi realizada em três fases de desenvolvimento da planta, emborrachamento (FC1), grão leitoso/pastoso (FC2) e grão duro ou maturidade (FC3). A partir da colheita de 10 plantas, cortadas rente ao chão, foram removidas as folhas e panículas a fim de realizar a extração do caldo, a colmo limpo, em sistema de moenda de caldo de cana, sendo cada amostra de colmo passada três vezes pelos rolos. A identificação da melhor época de colheita permitiu efetuar determinações de produção de etanol no ponto ótimo. 2.2 Caracterização dos caldos das cultivares Após a extração e filtração, os caldos foram caracterizados quanto aos teores de sólidos solúveis totais (SST) °Brix, usando refratômetro portátil Instruterm modelo RT30ATC, com escala de 0 a 32 °Brix, e as concentrações de açúcares totais (AT), determinados pela soma dos teores de sacarose, glicose e frutose por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), usando coluna cromatográfica AminexHPX 87H (300 x 7,8mm, Bio-Rad) a 50° C; fase móvel H2SO4 5mM numa vazão de 0,6mL/min; empregando o detector índice de refração (RI). Nos caldos das cultivares também foram quantificados os teores de nitrogênio (FAN- free amino nitrogen) pelo método da ninidrina e de nutrientes após digestão com ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio
99 (Thomas
et
al.,
1967).
Nos
extratos
gerados
foram
determinados
Ptotal
(espectrofotometria) e K (fotometria de chamas). 2.3
Caracterização dos bagaços das cultivares
A caracterização das amostras de bagaço oriunda da etapa de extração dos caldos foi realizada de acordo com a metodologia de Van Soest (1963), para quantificação dos teores de FDN, FDA, carboidratos (celulose e hemicelulose) e lignina detergente ácido. A umidade foi determinada com o uso de balança analítica de infravermelho e cinzas pelo método gravimétrico, após calcinação em mufla a 600°C por 2h. 2.4 Fermentações dos caldos As fermentações foram conduzidas no sistema batelada simples em erlenmeyers de 250 mL de volume total sob temperatura controlada a 33 °C e em condição estática pelo período de 6 h. Todos os ensaios foram conduzidos em quadruplicata dispostos em delineamento inteiramente casualizado. Nos erlenmeyers foram adicionados 100 mL do caldo de sorgo esterilizado e inoculados com 10 % (m/v) de inóculo de leveduras Saccharomyces cerevisiae JP-1, previamente crescidas em meio YPD (20 g.L-1 glicose, 10 g.L-1 peptona e 10 g.L-1 extrato de levedura). No inóculo foi determinada a viabilidade celular e a concentração inicial de células pelo método de contagem, após coloração com azul de metileno, em câmara de Neubauer. Nos ensaios de fermentação dos caldos foram removidas alíquotas no tempo 0 h e após 6 h, para determinação dos açúcares consumidos e dos produtos da fermentação, como etanol e glicerol. Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: açúcares consumidos (Ac), produtividade volumétrica de etanol (Qp) e rendimento de conversão de açúcares (sacarose, glicose e frutose) em etanol (Yp/s), conforme as equações 1 e 2. -
-
(1) (2)
Onde: Qp: produtividade volumétrica; P: etanol produzido; T: tempo de fermentação; Yp/s: rendimento de etanol por açúcar consumido; e Ac: açúcar consumido.
100 2.5 Pré-tratamento e hidrólise enzimática dos bagaços O pré-tratamento foi conduzido em erlenmeyers de 250 mL de volume total, onde foram adicionados os bagaços de sorgo na razão de 4% de sólidos totais sólidolíquido com a solução de peróxido de hidrogênio em concentração de 7,5 % m/v em 100 mL de água. O ajuste do pH foi realizado com solução de NaOH 5M até o valor de 11,5. Os erlenmeyers foram incubados em mesa agitadora orbital com agitação de 150 rpm a 25 °C por 1 h. Após o termino da reação, as duas frações oriundas do pré-tratamento foram separadas em fração líquida e sólida através de filtração, nesta etapa foi possível quantificar a perda de massa na reação (Equação 3). A fração sólida foi lavada com 1,5 L de água destilada com o intuito de remover sólidos solúveis em água. A fração sólida previamente lavada e seca em estufa de circulação de ar a 45 °C foi submetida à hidrólise enzimática usando enzima comercial FibreZymeTM LDI na dose de 10 FPU.g1
de biomassa seca, sem complementação com β-glicosidades. As condições de hidrólise
foram: carga de sólidos totais de 20 g.L-1, pH 4,8 com uso de tampão citrato de sódio 0,05 M, agitação 100 rpm, temperatura de 50 °C com tempo de 48 h. Após 48 h foram removidas alíquotas para determinação da glicose liberada através de KIT enzimático glicose oxidase e açúcares redutores totais (Miller, 1965). A atividade da celulase foi quantificada em unidades de papel filtro, conforme metodologia proposta por Ghose (1987). A atividade de β-glicosidase foi determinada em base de solução de celobiose e expressa em unidades por mL, de acordo com Wood e Bhat (1988). Também foram quantificadas as atividades de xilanase, CMCase e avicelase. A eficiência da hidrólise enzimática foi expressa de acordo com a Equação 4 (Cao et al., 2012). (3) Onde PM: perda de massa; Mi: massa inicial de bagaço; Mf: massa final de bagaço. (4) Onde EH: eficiência de hidrólise enzimática; C1: concentração de glicose no hidrolisado; M: massa de bagaço seco; W: teor de celulose no bagaço pré-tratado; e 1,11 fator de conversão de celulose em glicose.
101 2.6 Fermentação dos hidrolisados Após a hidrólise enzimática dos diferentes tipos de bagaço, os hidrolisados foram submetidos à fermentação com Dekkera bruxellensis GDB 248. Os ensaios de fermentação foram conduzidos em batelada em erlenmeyers de 125 mL onde foram adicionados 100 mL de hidrolisado com 2% m/v de células de D. bruxellensis previamente crescidas em YPD por 24 h. Os frascos foram incubados a 32ºC em condição estática e amostras de 1 mL foram coletadas no início e após 7 h. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado com filtros com poros de 0,22µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por CLAE sob as condições descritas acima. Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: produtividade volumétrica de etanol (Qp) e rendimento de conversão de açúcares (glicose e celobiose) em etanol, conforme as Equações 1 e 2. 2.7 Análises estatísticas O experimento de campo foi avaliado no arranjo experimental fatorial com três fases de colheita e cinco cultivares. O experimento de fermentação dos caldos extraídos na fase de colheita de grão leitoso/pastoso foi realizado em delineamento experimental inteiramente casualizado. O experimento de pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados também foram conduzidos em delieneamento inteiramente casualizado. Todas as determinações foram realizadas em quadruplicata e os resultados para °Brix, teores de N-FAN, P, K, pH, CE, açúcares iniciais, perda de massa, teor de glicose, açúcares redutores totais, eficiência de conversão de celulose em glicose e dos parâmetros cinéticos de fermentação concentração de etanol, produtividade volumétrica e eficiência de conversão de açúcares em etanol foram submetidos
à análise de
variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a nível de significância de p ≤ 0,05 usando o Software ASSISTAT (Silva e Azevedo, 2009).
102
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Experimento de campo Inicialmente foi conduzido um experimento de campo para avaliar a melhor
fase de colheita para as diferentes cultivares de sorgo sacarino estudadas. Para isso, foi realizada a determinação da variável ºBrix durante três fases de colheita dos colmos, emborrachamento, grão leitoso/pastoso e maturidade ou grão duro. Não houve ineteração significativa de fases de colheita e cultivares. Os teores de ºBrix nas fases de colheita de grão leitoso/pastoso e de grão duro foram semelhantes e significativamente maiores que na fase de emborrachamento (Figura 1). Portanto a colheita mais cedo, na fase de grão pastoso/leitoso, foi escolhida como a melhor para avaliar as produções de etanol de primeira e segunda geração. A escolha da variável ºBrix está relacionada com a correlação direta entre os teores de sólidos solúveis totais (ºBrix) e os teores de açúcares totais nos caldos do sorgo sacarino (Guiogou et al., 2011; Dutra et al., 2013). As cultivares atingiram a fase de grão/leitoso pastoso em dias diferentes: IPA 467 em 140 dias, SF 11 em 130 dias, BR 506 em 92 dias, SF 15 em 140 dias e IPA 2502 em 92 dias.
Figura 1: Teores de °Brix em função da época de colheita dos colmos de diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas no experimento de campo. Valores para n=4, MG: Média geral para a fase colheita dos colmos, Letras iguais nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, CV(%)= 17,20. FC1: Fase de colheita de emborrachamento, FC2: Fase de colheita de grão leitoso/pastoso, e FC3: Fase de colheita de maturação.
103 3.2 Caracterização inicial e fermentação dos caldos Os resultados da caracterização inicial dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino são apresentados na Tabela 1. Todas as variáveis de caracterização dos caldos apresentaram diferenças significativas entre as cultivares de sorgo avaliadas. Os teores de °Brix variaram entre 8,95 e 16,10 e os teores de açúcares totais (sacarose, glicose e frutose) variaram entre 67,6 e 128,8 g.L-1. Geralmente os teores de °Brix e açúcares totais se correlacionam o que permite o uso da determinação de sólidos solúveis nos caldos como ferramenta importante para as indústrias sucroalcooleiras (Tsuchihashi e Goto, 2004; Guiogou et al., 2011; Dutra et al., 2013). É reportado na literatura o teor adequado de °Brix no caldo para a colheita dos colmos fica entre 15,5 e 16,5 (Prasad, 2007). Além dos teores de °Brix e açúcares totais, são importantes na caracterização do caldo os teores dos nutrientes, pH e a condutividade elétrica (CE). A análise destas variáveis permite inferir sobre a necessidade de adição ou diluição ou até mesmo correção dos caldos a serem fermentados, pois os micro-organismos necessitam de nutrientes para converter os açúcares solúveis em etanol (Bai et al., 2008). Os teores de nitrogênio N-FAN (Free amino nitrogen) variaram entre 193,4 e 670,05 mg.L-1. Os teores de P variaram entre 72,93 e 161 mg.L-1 e os teores de K entre 2768,98 e 6205,21 mg.L-1. O valores de pH para todos as cultivares foram semelhantes e com média geral de 5,24 que situa-se na fase ótima para fermentação com leveduras do gênero Saccharomyces (Dimple et al., 2010). Diferenças significativas foram observadas para a condutividade elétrica (CE), que está correlacionada com a salinidade dos caldos e pode interferir no metabolismo das leveduras e afetar o rendimento fermentativo. No entanto ainda são escassos os estudos que relacionam a CE com interferências na fermentação.
104 Tabela 1: Caracterização inicial dos caldos das cultivares de sorgo sacarino. Cultivares
°Brix
AT (g/L)
(g/100 mL)
N-FAN
P (mg/L)
K (mg/L)
pH
(mg/L)
CE (mS/cm)
IPA 467
14,65* ab
107,40 ab
193,40 b
74,90 b
5403,29 a
5,23 bc
6,03 cd
SF 11
13,95 ab
99,17 ab
294,58 ab
78,34 b
4893,17 a
5,10 c
7,24 bc
BR 506
10,35 bc
82,20 ab
670,05 a
161 a
6205,21 a
5,20 bc
9,33 a
SF 15
16,10 a
128,80 a
233,25 ab
72,93 b
2768,98 b
5,26 b
5,19 d
IPA 2502
8,95 c
67,65 b
655,24 ab
127,05 ab
5996,81 a
5,42 a
8,72 ab
*valores para n=4. AT: Açúcares totais; N-FAN: Nitrogênio free amino nitrogen; P: fósforo; K: Potássio; CE: Condutividade elétrica. Médias com a mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A variabilidade no teor de °Brix, açúcares totais, nutrientes e variáveis como pH e condutividade elétrica nos caldos das diferentes cultivares de sorgo estão associadas com a capacidade genética de cada cultivar e também com as condições ambientais como tipo de solo, precipitação, incidência de radiação solar (Zhao et al., 2009). A análise e caracterização destas variáveis em cultivares com potencial para produção de etanol é fundamental para a viabilidade do cultivo do sorgo sacarino. Os resultados dos parâmetros cinéticos após 6 h de fermentação estática com levedura Saccharomyces cerevisiae dos caldos das diferentes cultivares de sorgo sacarino estão ilustrados na Tabela 2. Como parâmetros para avaliar as cultivares foram analisados a capacidade das leveduras em consumir os açúcares dos caldos, a produção de etanol, a produtividade volumétrica de etanol produzida, o rendimento da fermentação, viabilidade celular e concentração celular. Diferenças significativas foram observadas na capacidade das leveduras em consumir os açúcares presentes no caldo das diferentes cultivares, entre 92,71 a 99,42 % de consumo (Tabela 2). Estas diferenças são produtos da qualidade dos caldos e estão relacionados com a concentração de nutrientes e outros elementos como vitaminas. Também é função do teor inicial de açúcares, pois elevadas concentrações de açúcares iniciais causam inibição pelo substrato e também pelo produto formado (Laopaiboon et al., 2009). A concentração de etanol nos caldos fermentados variou entre 28,31 a 56,38 g.L-1. Maiores teores foram observados nos caldos das cultivares com maiores teores de açúcares iniciais como SF 15. Davila-Gomez et al. (2012) observaram resultados
105 semelhantes aos avaliarem a produção de etanol a partir de cultivares de sorgo sacarino e forrageiro em região de baixa precipitação no México com teores de etanol entre 35,78 a 56,36 g.L-1. Tabela 2: Parâmetros cinéticos da fermentação dos caldos das cultivares de sorgo sacarino, condição estática, 6h, 33°C. Cultivares
Ac (%)
P (g/L)
Qp(g.L.h)
Yp/s
Vi (%)
Vf (%)
Ci (108)
Cf (108)
IPA 467
92,71b
42,37 abc
7,06 abc
0,45 a
97,03
95,54
4,46
4,63
SF 11
96,71ab
47,27 ab
7,88 ab
0,49 a
96,76
91,73
4,38
4,3
BR 506
98,11 ab
35,27 bc
5,88 bc
0,44 a
96,95
96,00
4,52
4,64
SF 15
95,64 ab
56,38 a
9,40 a
0,46 a
98,36
92,80
4,66
4,66
IPA 2502
99,42 a
28,31 c
4,71 c
0,42 a
95,86
98,64
4,9
4,82
Valores para n=4. Ac: Açúcar consumido; P: etanol; Qp: Produtividade volumétrica;Yp/s: Rendimento; Vi: viabilidade inicial; Vf: viabilidade final; Ci: Concentração inicial de células; Cf: concentração final de células. Médias com a mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
De forma semelhante à concentração de etanol, a produtividade volumétrica apresentou diferenças entre as cultivares avaliadas (Tabela 2). Destaque para a cultivar SF 15 com maior valor de Qp. Altas Qp são importantes para tornar o processo de produção de etanol a partir do sorgo sacarino viável, pois esta variável representa a produção de etanol por unidade de tempo de fermentação, o que no setor sucroalcooleiro situa-se entre 6 a 12 h para teores iniciais de açúcares de 120 g.L-1. Não foram observadas diferenças para a variável de rendimento fermentativo, que expressa à eficiência de transformação de açúcares consumidos em produto de interesse como o etanol (Tabela 2). O Yp/s variou entre 0,42 a 0,49 o que representa 82,35 % a 96,07 % de conversão dos açúcares em etanol a partir do coeficiente máximo de conversão 0,51. Não foram observados crescimentos de leveduras durante o processo de fermentação (Tabela 2). Isto é explicado pelo alto valor inicial de inóculo utilizado 10% m/v que representou média de 4,58 x 108 células.mL-1. Com relação à viabilidade celular, em geral, observou-se diminuição da viabilidade celular o que é produto da concentração de produtos que inibem a atividade das leveduras.
106 3.3 Pré-tratamento, hidrólise enzimática e fermentação dos hidrolisados A composição química para os teores de celulose, hemicelulose e lignina detergente ácido dos diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino in natura e após a etapa de pré-tratamento estão ilustradas na Tabela 3. A composição inicial apresentou diferenças significativas entre as cultivares avaliadas. Os maiores teores de celulose foram observadas para as cultivares IPA 467 e IPA 2502. Os teores de celulose variaram entre 38,64 a 42,50%. Após o pré-tratamento houve aumento para os teores de celulose para todos os bagaços entre 58,11 % a 91,42%. Os teores de hemicelulose variaram entre 27,99 a 33,34 % e após o pré-tratamento com H2O2 os valores decresceram 43,13%, 46,41%, 42,15%, 44,64% e 48,13% para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente em relação aos bagaços in natura, indicando a solubilização da hemicelulose para a fração líquida da reação. Os teores de lignina detergente ácido (LDA) variaram entre 2,63 a 4,02% e após a reação com H2O2 os valores diminuiram indicando deslignificação dos bagaços. Reduções na ordem de 78,55%, 62,68%, 86,09%, 64,16% e 71,11% foram observadas para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente em relação aos bagaços in natura. Deslignificações usando o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino são bastantes variáveis em relação ao tipo de biomassa que está sendo avaliada e com as condições de processo de pré-tratamento. Para o bagaço de cana-de-açúcar, uma biomassa lignocelulósica semelhante ao sorgo sacarino são reportados valores de remoção de lignina da ordem de 70% (Rabelo et al., 2011) em condições semelhantes de processo ao usado neste estudo. Para a biomassa de algodão reduções entre 6,22% a 32% foram observadas usando H2O2 em diferentes temperaturas e pressão (Silverstein et al., 2007). Valores ótimos de 65,66% de remoção de lignina foram observados para a biomassa de palha de colza com 5% de H2O2 em meio alcalino em 1 h reação a temperatura de 50°C (Karagoz et al., 2012). Para a biomassa de sorgo sacarino Cao et el. (2012) reportaram valor de deslignificação de 78,84% usando 5% de H2O2 por 24 h.
107
Tabela 3: Composição química do bagaço in natura e após pré-tratamento com H2O2 de diferentes cultivares de sorgo sacarino. Cultivares
Celulose (%)
Hemicelulose (%)
LDA (%)
IPA 467
42,46 ± 0,42 a
27,99 ± 0,46 b
4,01 ± 0,19 a
SF 11
38,64 ± 1,03 c
33,34 ± 1,13 a
4,02 ± 0,4 a
BR 506
40,7 ± 0,69 b
29,52 ± 0,71 b
2,66 ± 0,65 b
SF 15
38,73 ± 0,40 c
33,09 ± 0,96 a
3,07 ± 0,58 ab
IPA 2502
42,50 ± 1,03 a
33,33 ± 1,80 a
2,63 ± 0,4 b °
Após pré-tratamento H2O2 (40 g.L-1, 7,5% v/v H2O2, pH=11,5, 150 rpm, 1h, 25 C) IPA 467
67,13 ± 0,48
15,92 ± 0,12
0,86 ± 0,15
SF 11
72,81 ± 2,23
17,87 ± 0,90
1,5 ± 0,3
BR 506
73,12 ± 3,02
17,08 ± 1,56
0,37 ± 0,1
SF 15
74,12 ± 1,83
18,36 ± 0,79
1,1 ± 0,2
IPA 2502
75,15 ± 1,54
17,29 ± 1,62
0,76 ± 0,4
n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
O objetivo do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é desorganizar a matriz orgânica para possibilitar a etapa de hidrólise dos carboidratos. Para todos tipos de bagaços avaliados neste trabalho o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino resultou na perda média de massa média em 34,55%, 38,15%, 32,03%, 41,5% e 36,22% para as cultivares IPA 467, SF 15, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente (Figura 2). A perda de massa está relacionada com a solubilização de parte da lignina, extrativos, cinzas e pequenas frações de carboidratos para a fase líquida da reação. O pré-tratamento com H2O2 é um processo de deslignificação da biomassa lignocelulósica que permite alcançar uma maior eficiência na recuperação de açúcares na etapa de hidrólise enzimática (Karagoz et al., 2012) uma vez que a presença de lignina dificulta o acesso das enzimas ao substrato. Este tipo de pré-tratamento tem eficiência dependente da biomassa avaliada e os resultados indicam não haver diferença
108 significativa para a produção de glicose e com diferença significativa para os açúcares redutores (Tabela 4) para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino avaliados.
Figura 2: Perda de massa durante a etapa de pré-tratamento do bagaço de diferentes cultivares de sorgo sacarino com H2O2 (40 g.L-1 substrato, 7,5 % H2O2, pH 11,5, 1h, temperatura ambiente). Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A enzima FibreZymeTM LDI é um complexo enzimático utilizado na indústria de papel no tratamento dos efluentes. Para o seu uso na hidrólise do bagaço do sorgo sacarino foi necessário determinar as atividades enzimáticas apresentadas por este complexo. As reações de atividades para as enzimas celulase, xilanase, avicelase, CMCase e β-glicosidase foram realizadas em tampão citrato de sódio 50 mM, pH 4,8 e temperatura de 50 °C. Suas medidas resultaram nos seguintes índices de atividades: 11,563 FPU (atividade filtro de papel); 788,94 ± 63,04 U/mL xilanase; 10 CBU/mL βglicosidase; 5,9 ± 0,34 U/mL avicelase e 174,97 ± 6,72 U/mL CMCase. A eficiência de conversão de celulose em glicose (EH) após 48 h não foi afetada pelo tipo de bagaço de sorgo sacarino avaliada (Tabela 4). Valores de 61,44%, 66,11%, 59,80%, 64,69% e 72,30% foram observados para as cultivares IPA 467, SF 11, BR 506, SF 15 e IPA 2502, respectivamente. A EH depende da composição química do substrato lignocelulósico, do tipo de pré-tratamento utilizado, da carga de sólidos usados na hidrólise, da dose e do tipo de enzima, do tempo de hidrólise, bem como da metodologia de cálculo da eficiência (Modenbach e Nokes, 2013). Para condições
109 semelhantes a este trabalho CAO et al. (2010) avaliando a hidrólise enzimática do bagaço de sorgo sacarino pré-tratado com H2O2 observaram EH média de 62,46 %. Tabela 4: Eficiências de hidrólise enzimática para os diferentes tipos de bagaços de sorgo sacarino, 2% substrato, 10 FPU/g bagaço, 50°C, pH = 4,8, 48h, após prétratamento com H2O2. Biomassa
AT (g/L)
Glicose (g/L)
EH (%)
IPA 467
14,99 ± 0,83 ab
8,79 ± 0,66 a
61,44 ± 4,52 a
SF 11
13,60 ± 1,08 b
10,06 ± 2,09 a
66,11 ± 13,41 a
BR 506
15,17 ± 0,82 ab
9,31 ± 0,31 a
59,80 ± 2,60 a
SF 15
15,21 ± 1,22 ab
10,03 ± 0,63 a
64,69 ± 4,26 a
IPA 2502
16,04 ± 0,50 a
11,27 ± 2,41 a
72,30 ± 16,01 a
Valores para n=4 ± desvio padrão. Média com mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. AT: Açúcares totais, EH: Eficiência de hidrólise conversão de celulose em glicose.
A comparação com outros tipos de pré-tratamento que são utilizados para prétratar biomassa de sorgo sacarino para produção de etanol observa-se eficiências de conversão de celulose em glicose semelhantes ao apresentadas neste trabalho. Sipos et al. (2009) ao usar a explosão a vapor para pré-tratar biomassa de sorgo observaram eficiências entre 50% a 90% em diferentes tempo (5 a 10min.) e temperatura (180 a 200°C) de processo e usando enzimas Celuloclast 1.5 na dose de 20 FPU.gsubstrato -1 e Novozyme 188 na dose de 20 IU.gsubstrato-1. Em outro estudo, Zhang et al. (2011) avaliaram 4 tipos de pré-tratamento para a biomassa de sorgo sacarino, líquidos iônicos, explosão a vapor, ácido diluído e lime. As condições de hidrólise enzimática foram 10% de substrato e dose de enzima de 20 FPU.gsubstrato e tempo de 72 h. A máxima eficiência de conversão de celulose em glicose foi obtida para o pré-tratamento com explosão a vapor de 72%, seguida de ácido diluído com 50%, líquidos ionicos e lime com 40%. Uma vez que não foi observada diferenças significativas para as eficiências de hidrólise enzimatica para as diferentes cultivares de sorgo sacarino avaliadas, optou-se por fermentar o hidrólisado da cultivar SF15, pois esta cultivar se destacou na ánalise de fermentação dos caldos. Após 7 h de fermentação com D. bruxellensis a produção de etanol foi de 3,9 g.L-1 com produtividade volumétrica de 0,56 g.L-1.h-1 e rendimento de
110 tranformação de glicose em etanol de 0,40. Não foram observadas variações significativas na viabilidade celular e no crescimento da biomassa de D. bruxellensis. A fermentação de hidrolisados de biomassa geralmente leva a baixas concentrações de etanol no meio, uma vez que os teores iniciais de biomassa pré-tratada submetida à hidrólise são baixos, entre 2% a 10%, mesmo maximizando a eficiência da hidrólise enzimática, podendo chegar até 90%. Rabelo et al. (2011) ao fermentarem hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratada com H2O2 alcalino em condições semelhantes ao nosso trabalho, utilizando Saccharomyces cerevisiae, obtiveram 2,5 g.L1 1
de etanol partindo de um hidrolisado com 6,5 g.L-1 de glicose, rendimento de 0,38 g.g.
Tabela 5: Parâmetros cinéticos da fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis, 32°C, 7 h, condição estática. Bagaço
P (g/L)
Qp(g/L.h)
Yp/s
Vi (%)
Vf (%)
C.I (108)
C.F (108)
SF 15
3,9 ±0,3
0,56 ±0,03
0,40 ±0,02
95 ± 4
93 ±5
5,2 ±0,6
5,4 ±0,8
Valores para n=4 ± desvio padrão. P: concentração de etanol; Qp: produtividade volumétrica; Yp/s: rendimento de conversão de açúcares em etanol; Vi: viabilidade celular inicial; Vf: viabilidade celular final; C.I: concentração celular inicial; C.F: concentração celular final.
111
4.
CONCLUSÕES Com os resultados obtidos demonstrou-se que a melhor fase de colheita dos
colmos da biomassa de sorgo sacarino para antecipar a colheita é na fase de grão leitoso/pasto podendo-se estender até a maturação fisiológica dos grãos. A produção de etanol a partir do caldo foi influenciada pela cultivar avaliada, sendo a cultivar SF 15 a mais promissora, o que corrobora estudos anteriores de nosso grupo de pesquisa. O peróxido de hidrogênio foi um pré-tratamento efetivo para o tratamento de todos os tipos de bagaços das cultivares de sorgo sacarino avaliadas e permitiu eficiências razoáveis na etapa de hidrólise enzimática da biomassa. Além disso, a levedura Dekkera bruxellensis apresentou potencial para fermentar hidrolisados de biomassa.
112
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116
CAPÍTULO V
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR E SORGO SACARINO POR UMA LINHAGEM INDUSTRIAL DE Dekkera bruxellensis
117
PRODUÇÃO DE ETANOL DE SEGUNDA GERAÇÃO A PARTIR DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR E SORGO SACARINO POR UMA LINHAGEM INDUSTRIAL DE Dekkera bruxellensis RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana-deaçúcar e sorgo sacarino por Dekkera bruxellensis após pré-tratamento brando com H2O2 em meio alcalino e hidrólise enzimática com celulases. Os ensaios foram conduzidos em duplicata delineados inteiramente ao acaso e os resultados indicaram que o uso do H2O2 em meio alcalino combinado com hidrólise enzimática dos bagaços produziu hidrolisados com teores de açúcares redutores 19,71 ± 0,6 e 14,87 ± 0,1 g.L-1 e glicose 11,5 ± 0,3 e 9,57 ± 0,2 g.L-1. Análises de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier combinadas com microscopia eletrônica de varredura e difração de raios x confirmaram modificações na estrutura dos bagaços após o prétratamento. Os ensaios de fermentação foram conduzidos em duplicata utilizando uma linhagem GDB 248 de D. bruxellensis. Foi observado o consumo de celobiose presente nesses hidrolisados, além da glicose também presente. O rendimento de etanol no final da fermentação foi de 0,42 ± 0,04 g.g-1 para cana e 0,44 ± 0,03 g.g-1para sorgo. Dekkera bruxellensis tem sido reportada como uma levedura capaz de hidrolisar a celobiose para a produção de etanol, portanto se apresenta como um microrganismo promissor em meio industrial para produção de etanol de segunda geração. Palavras-chave: Biomassa Lignocelulósica, Caracterização de Biomassa, Hidrólise Enzimática, Fermentação de Hidrolisados
118 ABSTRACT The aim of this work was to evaluate the ethanol production from sweet sorghum (SSB) and sugar cane (SCB) bagasses for Dekkera bruxellensis after H2O2 alkaline pretreatment and enzymatic hydrolysis with cellulases. The experiments were conducted in duplicate delineated in completed randomized design and the results indicated that the use of H2O2 alkaline combined with enzymatic hydrolysis of bagasses produced hydrolisates with levels of glucose 9,59 ± 0,3 e 11,5 ± 0,3 g.L-1, for SCB and SSB, respectively. Moreover, analyses of FTIR combined with SEM indicated changes in structure of bagasses after pretreatment. The experiments of fermentation were carried out in duplicate delineated completely randomized design using a strain GDB 248 D. bruxellensis. It was observed the consumption of cellobiose and glucose and the ethanol production reached 4.2 g.L-1 for SCB hydrolysate and 5.3 g.L-1 for SSB hydrolysate from assimilation of cellobiose and glucose. Ethanol yeld was 0,42 ± 0,04 g.g-1 for SCB and 0,44 ± 0,03 g.g-1 for SSB. The yeast Dekkera bruxellensis has been reported as yeast capable of hydrolyzing the cellobiose for ethanol production, therefore prove to be a promising microorganism industrial environment for the production second-ethanol generation. Key words: Lignocellulosic biomass; biomass characterization; Enzymatic Hydrolysis; Fermentation of Hydrolysates.
119 1.
INTRODUÇÃO Com o aumento na demanda de biocombustíveis ao nível mundial indicada por
um aumento de consumo interno devido ao aumento na produção de veículos “bicombustíveis”, expansão das exportações, no interesse mundial pela mistura do álcool à gasolina e pelos altos preços do petróleo; e pela opção brasileira de utilização da rota etanólica na produção de biodiesel, também cresce a busca de novas fontes de matérias-primas para utilização na área da bioenergia. Dentre elas destacam-se as biomassas lignocelulósicas, compostos de celulose, hemicelulose e lignina que quando hidrolisadas liberam monômeros fermentescíveis e grande parte é considerada como resíduos dos processos agroindustriais. Na Região Nordeste do Brasil, uma importante produtora de etanol no cenário nacional, estima-se que sejam gerados 14 milhões de toneladas de bagaço de cana-de-açúcar (CONAB, 2014) e 4 milhões toneladas de bagaço de sorgo granífero que é utilizado na alimentação animal (IBGE, 2011). Desenvolver uma tecnologia para a produção de etanol a partir da biomassa, o bagaço e a palha, é um desafio maior do que produzir etanol a partir do caldo de canade-açúcar, isso por que a evolução das plantas no ambiente possibilitou uma composição química da biomassa resistente à ação das enzimas celulolíticas, devido à presença da lignina e hemicelulose associada à fibra celulósica, fonte dos principais açúcares fermentescíveis, que termina por conferir sua cristalinidade e recalcitrância (Ramos, 2003). Muitas técnicas de pré-tratamento dessa biomassa, que terminaria por disponibilizar melhor as fibras celulósicas, têm sido estudadas por muitos anos (Lin e Tanaka, 2006) e geralmente estão agrupados em quatro categorias: físicas, químicas, biológicas ou suas combinações. Os vários métodos diferentes solubilizam componentes da biomassa, gerando vários produtos diferentes, que requerem diferentes estratégias para a hidrólise e fermentação subseqüente (Maeda et al., 2011). A escolha do prétratamento adequado depende do tipo de biomassa a ser utilizada e também está relacionado com o baixo consumo de energia (temperatura e pressão ambiente) e baixa geração de inibidores de hidrólise e fermentação como hidroximetilfurfural (HMF) e furfural, neste cenário o uso do H2O2 em meio alcalino vem ganhando destaque (Saha e Cotta, 2010; Banerjee et al., 2011; Rabelo et al., 2011), pois se caracteriza por apresentar um excelente rendimento de deslignificação. A hidrólise enzimática da biomassa se configura como o método mais eficaz para os processos fermentativos, pois não gera produtos que inibem o metabolismo das
120 leveduras e produz eficientemente uma mistura de açúcares do tipo hexoses e pentoses e também dissacarídeos, tais como celobiose, quando a preparação enzimática não é suplementada com celobiase (β-glicosidases, EC 3.2.1.21) (Wang et al., 2012). Com isso, a fim de obter um processo viável, sob o ponto de vista de produção de etanol de segunda geração, estudos com microrganismos capazes de fermentar hexoses, além das frações dissacarídicas em condições limítrofes de oxigênio e glicose como Dekkera bruuxellensis,vêm sendo apontados como promissores ao cenário industrial (Blomqvist et al., 2011; Tiukova et al., 2013; Reis et al., 2014), devido à notória capacidade de assimilação para estes dissacarídeo e fermentação a etanol trazendo boas perspectivas sob o ponto de vista de produtividade (Galafassi et al., 2011). Embora muitos microorganismos sejam mencionados na literatura como capazes de assimilar xilose e celobiose como Pichia stipitis, Candida shehatae, Kluyveromyces marxianus, Debaromyces
nepalensis.
Schizosaccharomyces
pombe,
Dekkera/Brettanomyces
naardenensis e Kluyveromyces cellobivorus, estas espécies são mais suscetíveis aos estresses alcoólicos e presença de produtos tóxicos a partir dos processos de prétratamento da biomassa lignocelulósica (Lewis Liu et al., 2012; Long et al., 2012). Neste contexto, D. bruxellensis GDB 248 se apresenta como mais adaptada para os processos industriais, até mesmo por que a mesma foi isolada desses ambientes (De Souza Liberal et al., 2005), inclusive sob condições de altas concentrações de etanol (Basso et al., 2008). Diante desse aspecto tecnológico, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de etanol a partir do bagaço de cana-de-açúcar e sorgo sacarino após pré-tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) em meio alcalino e hidrólise enzimática com celulases e fermentação dos hidrolisados utilizando D. bruxellensis, fazendo um acompanhamento analítico das ultraestruturas dos respectivos bagaços em cada etapa de pré-tratamento e também analisando o perfil fermentativo dessa levedura em condições de anaerobiose restrita frente a dois tipos de resíduos lignocelulósicos provenientes da indústria sucroalcooleira da região Nordeste do Brasil.
121 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Biomassa
O bagaço de cana-de-açúcar (BC) utilizado neste trabalho foi gentilmente cedido pela usina Japungú Agroindustrial S/A, localizada no estado da Paraíba, Brasil e o bagaço de sorgo sacarino foi oriundo de experimento de avaliação de cultivares para produção de etanol cedido pelo Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA). Após a moagem, os dois tipos de bagaços foram lavados para extração de açúcares residuais e secos em estufa a 45 °C por 48h. Após a secagem os bagaços passaram por moagem, individualmente, em moinho de facas tipo Willey e recolhidas as frações que passaram pela malha de 2 mm para os experimentos de pré-tratamento. 2.2. Pré-tratamento Os dois tipos de bagaço foram submetidos ao pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino (H2O2) nas seguintes condições: 10 % (m/v) substrato, 7,5 % H2O2 (m/v) e incubação por 1h a 150 rpm à temperatura ambiente. Os ensaios foram conduzidos em frascos de Erlenmeyer com um volume total de 1000 mL. O pH do meio foi ajustado para 11,5 com solução de NaOH a 5M. Após o término da reação a fração sólida foi recuperada por filtração e lavada com 1,5 L de água destilada aquecida (c. 70°C) até eliminação da coloração com o objetivo de remoção de compostos residuais, especialmente a lignina. Após a lavagem os bagaços pré-tratados foram secos em estufa a 45 °C por 48 h. Nesta etapa foi possível determinar a perda de massa após o prétratamento (Equação 1). ( 1)
Onde PM: Perda de massa(%); Mi: massa inicial de bagaço (g); e Mf: massa final de bagaço (g). 2.3. Hidrólise enzimática
A hidrólise enzimática foi conduzida utilizando enzima comercial Celluclast® 1.5L (atividade 45 FPU.mL-1), sem complemento com β-glicosidase, cedida gentilmente pela Novozymes A/S. A estratégia de utilização de uma enzima comercial que não fosse
122 suplementada com β-glicosidase esta pautada no aproveitamento da própria celobiase detectada e metabolizada pela linhagem em estudo (Blomqvistet et al., 2011; Reis et al., 2014). Os bagaços foram suspensos em tampão citrato de sódio a 0,05 M pH 4,8 para concentração de 20 g.L-1 e tratado sob agitação 150 rpm à 50 °C por 48 h com a enzima comercial na proporção de 20 FPU.g-1 biomassa seca-1 (Cao et al., 2012). As hidrólises foram conduzidas em frascos de Erlenmeyers com volume de trabalho de 100 mL e após o término do tempo da ação enzimática, os hidrolisados foram submetidos a um aquecimento de 76 °C para desnaturação das enzimas e analisados quanto aos teores de açúcares. Com a determinação dos açúcares foi possível calcular a eficiência de hidrólise enzimática em relação à conversão de celulose em glicose + celobiose (Equação 2). ( 2)
Onde EH: Eficiência de hidrólise enzimática; C1: Concentração de glicose no hidrolisado (g); C2: Concentração de celobiose no hidrolisado(g); W: Concentração de substrato (g); f: Teor de celulose no bagaço (%); e 1,11 como fator de conversão de celulose em glicose. 2.4 Ensaios de Fermentação em Bancada
Os ensaios de fermentação foram conduzidos em batelada em frascos de Erlenmeyer onde foram adicionados 100 mL de hidrolisado lignocelulósico acrescidos com 2% m/v de células de GDB 248 previamente crescidas em YPD por 7 h. Os frascos foram incubados a 32ºC em condição estática e amostras foram coletadas periodicamente a cada hora. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado a 0,22 µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Os parâmetros cinéticos calculados ao final da fermentação foram: produtividade volumétrica de etanol (Qp) e eficiência de conversão de açúcares (glicose e celobiose) em etanol (ECA), conforme as Equações 3 e 4. -
-
(3) (4)
123 Onde: P concentração de etanol (g.L-1), T tempo de fermentação (h), Yp/s rendimento de etanol por açúcar consumido e 0,51 rendimento teórico máximo de etanol por cada 1g de glicose. 2.5 Hidrólise e fermentação em biorreator Um experimento de hidrólise enzimática seguida de fermentação utilizando bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com H2O2 alcalino, nas condições descritas acima, foi realizado em um reator New Brunswick Bioflo 110 de vaso com capacidade nominal de 1L utilizando um volume de trabalho de 0,5 L. Todos os estudos foram realizados a uma temperatura de 32°C, controlada por um banho termostático. Não houve injeção de ar, entretanto foi promovida uma pequena agitação a fim de evitar a deposição de células e biomassa celulósica (150 rpm), assegurando a esterilidade do sistema com a instalação de um filtro 0,44μm na saída de gases. As amostras foram coletadas a cada quatro horas, durante 24 (vinte e quatro) horas. Após centrifugação, o sobrenadante foi filtrado a 0,22µm e utilizado para análises de metabólitos da fermentação por CLAE. A produtividade volumétrica de etanol e eficiência de conversão (glicose e celobiose) em etanol (ECA) foram calculadas como nas Equações 3 e 4. 2.6 Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
Com objetivo de estudar as mudanças estruturais dos grupos funcionais presentes, principalmente nos polissacarídeos presentes nas amostras de biomassa lignocelulósica de bagaço de cana-de-açúcar (BC) e bagaço de sorgo Sacarino (BS) “in natura”, estas foram pré-tratadas, lavadas e secas a 65 °C até peso constante e posteriormente foram submetidas à análise de espectroscopia FTIR. Os espectros foram coletados em espectrômetro Vertex® 70 (Bruker optics, Alemanha) com resolução de 4 cm-1 sendo efetuadas 64 scans por amostra numa faixa de número de ondas de 500 a 4500 cm-1 no modo de atenuação total de refletância. 2.7 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Amostras de BC e BS in natura e pré-tratadas foram lavadas e secas a 65 °C até peso constante e foram submetidas à análise de MEV. As amostras foram aderidas em fitas de carbono suportadas em “stubs” de alumínio e metalizadas com ouro e analisadas
124 em microscópio eletrônico de varredura modelo FEI Quanta™ 200F com voltagem aplicada de 20KV, utilizando um espectômetro EDS (espectroscopia por energia dispersiva), a fim de identificar a presença de possíveis elementos que compõem as biomassas “in natura” e seus respectivos decaimentos na biomassa pré-tratada. 2.8 Difratometria de raios X (DRX) Além de análises de modificações de grupos funcionais na estrutura dos bagaços, também foram realizadas determinações de índice de cristalinidade com o objetivo de verificar alterações na cristalinidade da biomassa lignocelulósica. Amostras secas de BC e BS foram submetidas a análises de difração de raios X, utilizando um difratômetro de raios X da marca Bruker modelo D8 Advance, com intervalo angular entre 10° a 50° (ângulo de Bragg - 2θ) passo angular 0,02° e tempo de contagem de 1s. O índice de cristalinidade dos materiais foi calculado segundo a equação 5 proposta por Segal et al. (1962). x 100
(5)
Onde: CrI: índice de cristalinidade, Icristalino: intensidade no pico do plano cristalino 21°, Iamorfo: intensidade no pico amorfo 18,8°. 2.9 Métodos analíticos A caracterização dos bagaços quanto aos teores de celulose, hemicelulose, lignina e cinzas foram realizadas segundo a metodologia de Van Soest (1963). A atividade de celulase no preparado enzimático comercial foi determinada em papel filtro pelo método padrão recomendado pela IUPAC (Ghose, 1987). Os açúcares e os metabólitos da fermentação foram determinados por CLAE composto por um sistema Agilent® 120039, um injetor automático, um detector nas faixas de comprimento de onda no infravermelho e ultravioleta e uma coluna de troca catiônica AMINEX HPX-87H (Bio-Rad, USA), precedida de uma pré-coluna microGuard (Bio-Rad). A fase móvel usada foi de ácido sulfúrico 5 mM a um fluxo de 0,6 mL/min. A temperatura do forno foi de 70°C. O volume de amostra injetado foi de 20 µL. Os compostos foram identificados a partir dos seus tempos de retenção relativos e quantificados diretamente a partir de uma curva padrão com diluição seriada. Os valores representam, pelo menos, a média de duas réplicas biológicas.
125 2.10
Análises estatísticas
Os dados de hidrólise enzimática e fermentação foram analisados utilizando o Software ASSISTAT® (7.6 beta Version) (Silva e Azevedo, 2006) e conduzidos em duplicatas. Os resultados analíticos foram apresentados como média das duplicatas com seus respectivos desvios padrão.
126 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Caracterização da biomassa lignocelulósica pré-tratada Os teores de celulose, hemicelulose e lignina na biomassa in natura e após o prétratamento do BC e BS estão apresentados na Tabela 1. O BC e o BS in natura apresentaram 39,21 % e 42,46 % de celulose, 37,86 % e 38 % de hemicelulose e 11,82 % e 4,01 % de lignina detergente ácido, respectivamente. A composição química da biomassa lignocelulósica da cana-de-açúcar e do sorgo sacarino varia de acordo com o local de cultivo, cultivar avaliada, idade de colheita da biomassa e com o método de quantificação empregado, mas em média sua composição varia entre 35 a 45 % celulose, 20 a 35% hemicelulose e 3 a 15 % lignina detergente ácido (Martin et al., 2007; Zhao et al., 2009; Han et al., 2012). Após o pré-tratamento com H2O2, os teores de celulose aumentaram para os dois tipos de bagaços enquanto que os teores de hemicelulose e lignina decresceram indicando a solubilização destes componentes. A ordem de grandeza dos constituintes após o pré-tratamento foi celulose maior que a hemicelulose que por sua vez, maior que lignina detergente ácido.
127 Tabela 1 – Teores de celulose, hemicelulose e lignina em detergente ácido no bagaço de cana-de-açúcar e bagaço de sorgo sacarino in natura e após o pré-tratamento (base seca).
Biomassa
Hemicelulose (%)
LDA (%)
Celulose (%)
Cinzas (%)
Extrativos (%)
BC1
39,21 ± 1,1
37,86 ± 0,1
11,82 ± 1,5
4,92 ± 0,3
5,37 ± 0,2
BS
42,46 ± 0,5
38 ± 0,6
4,01 ± 0,2
1,09 ± 0,07
11,72 ± 1,2
40,84
37,93
7,91
3,01
8,54
Média
Após pré-tratamento H2O2 (7,5 % m/v, 100 g.L-1 biomassa, 1h, temperatura ambiente) Celulose (%)
Hemicelulose (%)
LDA (%)
Cinzas (%)
Extrativos (%)
BC
56,13 ± 0,3
30,20 ± 2,4
6,58 ± 0,7
ND
ND
BS
67,13 ± 0,5
25,92 ± 0,1
0,86 ± 0,1
ND
ND
61,63
28,06
3,72
ND
ND
Média 1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino; LDA: lignina detergente ácido; ND: não determinado.
O objetivo do pré-tratamento da biomassa lignocelulósica é desorganizar a matriz orgânica para possibilitar a etapa de hidrólise dos carboidratos. Para os dois tipos de bagaços avaliados neste trabalho o pré-tratamento com H2O2 em meio alcalino resultou na perda média de massa em torno de 36%, sem diferença significativa entre os bagaços (Tabela 2). A perda de massa está relacionada com a solubilização de parte da lignina, extrativos, cinzas e frações de carboidratos principalmente proveniente da hemicelulose para a fase líquida da reação. Resultados semelhantes foram observados por Cao et al. (2012) ao comparar 5 tipos de pré-tratamentos para pré-tratar bagaço de sorgo sacarino, dentre eles o H2O2 alcalino com perda de massa média de 32,25 %.
128 Tabela 2 – Perda de massa durante o pré-tratamento com H2O2 e teores de açúcares e perda de massa após a hidrólise enzimática (48h) da biomassa de BC e BS. Biomassa
AT (g/L)
Glicose (g/L)
PM** (%)
PM*(%)
EH (%)
BC1
35,85 ± 0,8
14,49 ± 0,1
9,57 ± 0,2
68,05 ± 0,4
84,28 ± 1,14
BS
36,45 ± 1,5
18,07 ± 0,4
11,5 ± 0,3
79,06 ± 0,9
88,07 ± 1,6
Média geral
36,15
17,32
9,45
73,55
86,18
CV (%)
3,28
2,39
3,65
0,97
6,5
1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino;*PM: perda de massa pré-tratamento; AT: Açúcares totais (Celobiose + xilose + glicose).**PM: perda de massa hidrólise enzimática.
O pré-tratamento com H2O2 alcalino é um processo de deslignificação da biomassa lignocelulósica que permite alcançar uma maior eficiência na recuperação de açúcares na etapa de hidrolise enzimática (Karagöz et al., 2012) uma vez que a presença de lignina dificulta o acesso das enzimas ao substrato. Foram observadas eficiências de remoção de lignina detergente ácido dos bagaços in natura entre 44,33 % para BC e 78,55 % para BS. Rabelo et al. (2011) ao avaliar o pré-tratamento H2O2 em meio alcalino para o bagaço de cana-de-açúcar observou redução de 70% de lignina com uma carga de sólidos no processo menor (4%) do que reportado neste trabalho (10%). Cao et al. (2012) observou 78,84 % de redução de lignina detergente ácido ao pré-tratar biomassa de sorgo sacarino com H2O2 (5 % m/v, 24h) em meio alcalino. Este tipo de pré-tratamento tem eficiência dependente da biomassa avaliada e os resultados apresentaram diferenças significativas para a produção de glicose, açúcares totais e perda de massa após hidrólise enzimática para o BC e BS (Tabela 2). A diferença entre os teores de glicose e açúcares totais para os dois tipos de bagaços podem ser explicadas pela diferença nos teores de celulose após o pré-tratamento com H2O2 (Tabela 1) e também na liberação de xilose e celobiose formada, uma vez que a hidrólise enzimática foi conduzida com celulases comerciais, sem complementação com β-glicosidases, que apresentam baixa atividade de β-glicosidases (Saha e Cotta, 2010). Também pode ser explicado pela maior remoção de lignina observada para o BS, uma vez que a remoção da lignina aumenta a eficiência de hidrólise enzimática pela eliminação de sítios de ligação não produtivos entre lignina e celulases (Kumar et al., 2009).
129 A eficiência de hidrólise enzimática, relação entre a celobiose e a glicose liberada no hidrolisado em função da carga de biomassa aplicada na hidrólise, foi de 84,28 % para o BC e 88,07% para o BS (Tabela 2). Resultados de eficiência de hidrólise enzimática para biomassa lignocelulósica de cana-de-açúcar e sorgo sacarino são bastante variáveis na literatura, em função das diferenças de composições químicas, do método de cálculo de eficiência e principalmente pelos diferentes métodos de prétratamentos utilizados. Sipos et al. (2009) avaliaram o pré-tratamento com explosão a vapor do bagaço de sorgo sacarino para melhorar a etapa de hidrólise enzimática, com celulases complementada com β-glicosidase (1,5 L Celluclast adicionada de Novozymes 188) e carga inicial de sólidos 2% m/v e observaram valores de conversão glicose entre 85 a 90%. Chandel et al. (2013) estudaram o pré-tratamento com ácido oxálico do bagaço de cana-de-açúcar em condições de hidrólise enzimática com Celluclast 1,5 L e Novozymes 188 com carga de 20 FPU. g de biomassa-1 e 30 UI. g biomassa-1 e observaram eficiência 66,51 % expresso em termos de açúcares redutores pelo total de carboidratos. 3.2 Análise de deslignificação dos bagaços por FTIR, MEV/EDS e DRX Além das avaliações de perda de massa e composição química após o prétratamento, ferramentas de análise estrutural da biomassa são importantes para corroborar mudanças na fração lignocelulósica (Chandel et al., 2013). Os resultados de FTIR, apesar de serem usados mais como uma ferramenta de comparação qualitativa, determinaram as mudanças nas estruturas químicas dos polissacarídeos presentes na superfície das biomassas lignocelulósicas pré-tratadas H2O2 em meio alcalino para as amostras de BS e BC como estão ilustradas na Figura 1 e 2.
130
Figura 1: Espectros de FTIR para amostra de bagaço de sorgo sacarino pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
Figura 2: Espectros de FTIR para amostra de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm. Nas faixas de bandas entre 2.850 e 2.920 cm-1 caracterizam presença de grupos CH2- bastante presentes em cerídeos, no qual pode ser observada presença em ambos as biomassas e o tratamento com peróxido alcalino conferiu uma pequena remoção apenas no bagaço de sorgo sacarino, significando uma redução na quantidade de frações
131 alifáticas presentes nessas estruturas. Foram observados decréscimos nas intensidades dos espectros relacionados à hemicelulose 1730 cm-1, relacionados aos grupos carbonil (C=O) e lignina 1514 (BS) e 1510 (BC), relacionados aos grupos aromáticos o que confirma os dados apresentados na tabela 1 que apontaram solubilização parcial da hemicelulose e da lignina dos bagaços após o pré-tratamento. Resultados semelhantes foram observados por Rezende et al. (2011) com bagaço de cana-de-açúcar. Uma explicação para isso deve estar relacionada à remoção de lignina associada à hemicelulose por esse método de pré-tratamento. Outra razão estaria associada à redeposição da lignina liberada sobre a superfície (espectroscopia FTIR é uma técnica de superfície, a profundidade de penetração é de aproximadamente 0,5-3 µm para materiais lignocelulósicos com a intensidade do sinal exponencialmente decrescente com profundidade de penetração) (Stewart et al., 1995). Observa-se um aumento muito significativo da quantidade lignina, seria muito precipitado afirmar que este fenômeno está conexo apenas à remoção da hemicelulose. A principal estratégia para alcançar aumentos significativos na conversão enzimática é a diminuição da cristalinidade da celulose dos resíduos lignocelulósicos. Neste sentido analises de DRX para o BC (Figura 3) e BC (Figura 4) apresentaram valores de 34% e 33,8 % para os bagaços in natura, respectivamente. Após a etapa de pré-tratamento foram verificados aumentos significativos no IC para os dois bagaços para valores de 47,6% e 47,5%. Aumentos nos IC estão relacionados com a remoção de frações amorfas de hemicelulose e outros constituintes. Resultados semelhantes foram observados por Chandel et al. (2013) que verificaram aumento no IC de de 45,61 % para 52,56 % para o bagaço de cana-de-açúcar quando submetido ao pré-tratamento com expansão de fibras com ácido oxálico. No entanto, é importante mencionar que o índice de cristalinidade deve ser corrigido pela eficiência da etapa de pré-tratamento, pois representa de forma mais real o índice de cristalinidade do material. Assim quando corrigidos os valores de IC para os dois tipos de bagaços (17,1% para BC e 17,3% para BS) é observado uma diminuição do IC para os dois bagaços o que corrobora a melhora na eficiência de conversão enzimática dos bagaços pré-tratados.
132
Figura 3: Difratogramas de raios X para amostras de bagaço de cana-de-açúcar “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
Figura 4: Difratogramas de raios x para amostras de bagaço de sorgo sacarino “In natura” e pré-tratada com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm. Ainda sobre o estudo das mudanças na ultraestrutura dos bagaços de cana e sorgo sacarino, os resultados de microscopia eletrônica de varredura reforçaram a ação do pré-tratamento por oxidação via radicais de decomposição do H2O2 em meio alcalino demonstrando alterações na extensão das fibras celulósicas e consequentemente em sua exposição, devido à remoção das frações de lignina e diminuição da sua recalcitrância.
133 Isto pode ser percebido nas diferenças entre os bagaços “in natura” (Figura 5 A e C) e os pré-tratados (Figura 5 B e D). É importante notar a presença de microespaços no bagaço de cana pré-tratado (Figura 5B) em maior quantidade que o bagaço de sorgo. Sugere-se que esses “microvazios” aparecem devido à ação deslignificante do peróxido de hidrogênio, que varia de acordo com o teor de lignina de cada material lignocelulósico e que como mostrado acima, o bagaço de cana apresenta um maior teor de lignina (Tabela 1). Para a modalidade EDS (espectroscopia de energia dispersiva), tanto o bagaço de cana quanto o bagaço de sorgo apresentaram em sua estrutura “in natura” um espectro muito intenso de silício (dados não mostrados), confirmando a presença de cinzas. Já nos bagaços pré-tratados esses espectros não aparecem mais, colaborando para a eficiência da metodologia como adequada aos processos fermentativos.
A
C
B
D
Figura 5: Imagens de MEV para amostras de bagaço de cana-de-açúcar in natura (a) e após pré-tratamento (b) e sorgo sacarino in natura (c) e após pré-tratamento (d). Prétratamento com H2O2 7,5% m/v, pH 11,5, 10% sólido-líquido, 25 °C, 1h, 150 rpm.
134 3.3 Fermentação dos hidrolisados por D. bruxellensis A fermentação de hidrolisados de biomassa geralmente acarreta em baixas concentrações de etanol no meio, uma vez que os teores iniciais de biomassa pré-tratada submetida à hidrólise são baixos, mesmo maximizando a eficiência da hidrólise enzimática. De uma forma geral não foram observadas diferenças significativas para os parâmetros cinéticos durante a fermentação dos hidrolisados de BC e BS, com exceção dos açúcares consumidos (glicose e celobiose) (Tabela 1). Em média 94,08 % dos açúcares fermentescíveis foram consumidos por D. bruxellensis em um tempo de 7h com eficiência média de conversão dos açúcares em etanol de 84,41% o que indica boa fermentabilidade dos hidrolisados (Tabela 3). Apesar de apresentar rendimentos ainda inferiores às linhagens de S. cerevisiae, GDB 248 exibiu uma melhor desempenho fermentativo, frente à conversão dos hidrolisados de bagaços de cana-de-açúcar e sorgo sacarino e em termos de produtividade etanólica, em comparação com experimentos realizados por Blomqvist (2010) empregando as linhagens CBS 11269, CBS 11270 e CBS 74, utilizando meios sintéticos contendo glicose e celobiose em concentrações equivalentes às encontradas nos hidrolisados desta pesquisa. South et al. (2010) utilizando hidrolisados de serragem de faia (Fagussp) pré-tratado hidrotermicamente com explosão à vapor, também obteve valores de rendimento (0,45 em média para seus hidrolisados) inferiores ao obtido nesse estudo utilizando CBS 11269. Sugere-se que esses baixos rendimentos estejam relacionados à baixa produção de açúcares metabolizáveis por D. bruxellensis nos estudos citados.
Tabela 3 – Parâmetros cinéticos para a fermentação dos hidrolisados da biomassa de BC e BS por D. bruxellensis com tempo de 7h. Hidrolisados
P* (g/L)
Qp (g/L.h)
ECA (%)
AC (%)
BC1
4,20 ± 0,2
0,60 ± 0,1
82,94 ± 2,9
95,65 ± 0,1
BS
5,32 ± 0,8
0,76 ± 0,1
85,88 ± 13
92,50 ± 0,7
Média geral
4,76
0,68
84,41
94,08
CV (%)
11,84
11,84
11,17
0,53
1
BC: bagaço de cana, BS: bagaço de sorgo sacarino;*P: concentração de etanol; Q p: Produtividade volumétrica de etanol; ECA: eficiência de conversão de açúcares em etanol; AC: açúcares consumido.
Além dos parâmetros cinéticos finais, também foram comparados os perfis cinéticos de fermentação dos hidrolisados de BC e BS, partido de concentrações iniciais
135 diferentes de glicose (9,57 g.L-1 para o hidrolisado de BC e 11,5 g.L-1 para o hidrolisado de BS) e celobiose (0,81 g.L-1para o hidrolisado de BC e 1,62 g.L-1 para o hidrolisado de BS), principais sacarídeos a serem metabolizados por Dekkera bruxellensis. Os dois meios não foram suplementados com nitrogênio, a fim de avaliar sua capacidade fermentativa e simulando ao máximo uma condição industrial. Na primeira hora foi detectada a produção de etanol (1,09 g.L-1) para o meio com BC e 1,46 g.L-1 para o meio de BS) durante o consumo lento da celobiose e assimilação rápida da glicose, como mostra as Figuras 6 e 7.
Figura 6. Aspecto fermentativo de D. bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, sem suplementação com nitrogênio.Os valores representam a média de duplicatas.
136
Figura 7. Aspecto fermentativo de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de sorgo sacarino, sem suplementação com nitrogênio. Os valores representam a média de duplicatas. Não foi observada a produção significativa de ácido acético, uma característica muito comum em fermentações de açúcares por D. bruxellensis em condições de aerobiose restrita. Além disso, a não suplementação do meio com uma fonte metabolizável de nitrogênio não afetou a capacidade de conversão de açúcares em etanol pela D. bruxellensis, uma vez que esta levedura possui como característica a habilidade do uso de formas de nitrogênio (nitrato) que não são utilizadas Saccharomyces cerevisiae, o que lhe confere vantagem adaptativa em meios industriais (Barros Pitta et al., 2011). Os rendimentos de fermentação por D. bruxellensis GDB 248 em função do consumo de glicose acumulado com celobiose para o BC e BS foram respectivamente de aproximadamente 65% e 74,4%, baseados na produção de etanol e CO2. A partir dos dados obtidos em frascos de Erlenmeyer e tendo como objetivo confirmar a capacidade fermentativa da celobiose por D. bruxellensis em seu rendimento em função da produtividade volumétrica de etanol e eficiência de conversão
137 de açúcares (glicose e celobiose) em etanol, foi realizado um “scale-up” em reator de bancada utilizando o BioFlo®110 (volume de 1000 mL), New Brunswick ScientificCo., empregando condições semelhantes às aplicadas aos ensaios em frascos, alterando apenas a carga de biomassa lignocelulósica de bagaço de cana-de-açúcar para 5% (m/v), no objetivo de aumentar a quantidade de açúcar fermentescível ao final da hidrólise enzimática. A fermentação foi conduzida por 24h, e os pontos coletados nos tempos 0, 1, 4, 8, 13 e 24h a fim de estabelecer uma cinética de fermentação no reator. Após 24 h de fermentação, a concentração de etanol atingiu 9,5 g.L-1, com produtividade volumétrica de 0,40 g.L-1.h-1 e rendimento em função da glicose e celobiose de 0,37 g.g1
. Resultados semelhantes foram observados ao fermentar bagaço de cana-de-açúcar,
deslignificado com NaOH e hidrolisado com celulases (30 FPU.gbagaço-1 e 20 CBU.gbagaço-1), utilizando Saccharomyces cerevisiae com rendimentos de conversão de glicose em etanol de 0,35 g.g-1 (Santos et al., 2010). Além do rendimento de conversão de glicose e celobiose em etanol, também foi quantificado o rendimento de fermentação em função do consumo de glicose, da celobiose e também do consumo de xilose para o BC, que foi de 0,32 g.g-1, baseado na produção de etanol (Figura 8). Comparado com outras leveduras reportadas na literatura como Spathaspora passalidarum (0,32 g.g-1 – Souza, 2014), Candida shehatae HM 52.2 (0,28 g.g-1 – Chandel et al., 2013), e Escherichia coli FBR5 (0,46 g.g-1- Saha e Cota, 2006), a levedura Dekkera bruxellensis apresentou elevado potencial para aplicação em fermentações industriais para produção de etanol de segunda geração.
138
Figura 8. Cinética de fermentação de Dekkera bruxellensis GDB 248 em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar em reator de bancada. Os valores representam a média de duplicatas.
139 4. CONCLUSÕES Os resultados apresentados sustentam a viabilidade técnica da utilização do H2O2 em meio alcalino em temperatura ambiente e reduzido tempo de reação para pré-tratar biomassas de alta disponibilidade na Região Nordeste do Brasil. Foi possível obter altas eficiências de hidrólise enzimática utilizando apenas preparações comerciais de celulases, sem complementação com β-glicosidades, o que pode diminuir os custos de processo de hidrólise. Análises de ultraestrutura com técnicas de FT-IR, DRX e MEVEDS corroboraram as análises químicas de caracterização da biomassa que indicaram alterações significativas nas frações de lignina e hemicelulose dos bagaços de cana-deaçúcar e sorgo sacarino. Além disso, os resultados confirmaram a capacidade de utilização da levedura D. bruxellensis para fermentar hidrolisados lignocelulósicos.
140 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BANERJEE, G.; CAR, S.; SCOTT-CRAIG, J.; HODGE, D.B.; WALTON, J.D. Alkaline peroxide pretreatment of corn stover: effects of biomass, peroxide, and enzyme loading and composition on yields of glucose and xylose. Biotechnology for Biofuels, v.4, p.1-15, 2011. BARROS PITA, W.; LEITE, F. C.;SOUZA LIBERAL, A. T.; SIMÕES, D. A.; MORAIS JR, M. A. The ability to use nitrate confers advantage to Dekkera bruxellensis over S. cerevisiae and can explain its adaptation to industrial fermentation processes, Antonie van Leeuwenhoek, v. 100, p. 99-107, 2011. BASSO, L. C.; AMORIN, H.V.; OLIVEIRA, A.J.; LOPES, M.L.Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS yeast research, v. 8, p. 1155-1163, 2008. BLOMQVIST, J.; EBERHARD, T.; SCHUNER, J.; PASSOTH, V. Fermentation characteristics of Dekkera bruxellensis strains, Applied microbiology and biotechnology, v. 87, p. 1487-1497, 2010. BLOMQVIST, J.; SOUTH, E.; TIUKOVA, I.; MOMENI, M. H.; HANSSON, H.; STAHILBERG, J.; HORN, S. J.; SCHURER, J.; PASSOTH, V. Fermentation of lignocellulosic hydrolysate by the alternative industrial ethanol yeast Dekkera bruxellensis. Letters in applied microbiology, v. 53, p. 73-78, 2011. CAO, W.; SUN, C.; LIU, R.; YIN, R.; WU, X. Comparison of the effects of five pretreatment methods on enhancing the enzymatic digestibility and ethanol production from sweet sorghum bagasse. Bioresource Technology, v.111, p.215-221, 2012. CHANDEL, A. K.; ANTUNES, F. F. A.; ANJOS, V.; BEL, M. J. V.; RODRIGUES, L. M.; SING, O. V.; ROSA, C. A.; PAGNOCCA, F. C.; SILVA, S. S. Ultra-structural mapping of sugarcane bagasse after oxalic acid fiber expansion (OAFEX) and ethanol production by Candida shehatae and Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology for biofuels, v. 6, p. 4, 2013. CONAB, C. N. D. A.-. Acompanhamento da safra brasileira: cana-de-açúcar, terceiro levantamento, dezembro/2012-Companhia Nacional de Abastecimento. Brasília, p. Safra 2012/2013, 2014. DE SOUZA LIBERAL, A. T. et al. The yeast Dekkera bruxellensis genome contains two orthologs of the ARO10 gene encoding for phenylpyruvate decarboxylase. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 28, p. 2473-2478, 2012. DE SOUZA LIBERAL, A.; SILVA-FILHO, E.A.; MORAIS, J.O.; SIMÕES, D.A.; MORAES, M.A. Contaminant yeast detection in industrial ethanol fermentation must by rDNA PCR. Letters in applied microbiology, v. 40, p. 19-23, 2005.
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144 CONSIDERAÇÕES FINAIS A região Nordeste do Brasil é uma área com histórico na produção de açúcar e etanol, principalmente na região litorânea conhecida como zona da mata. Neste ambiente, os estados do Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco e Alagoas produzem cana-de-açúcar com tecnologia madura e bem estabelecida. No entanto, com o aumento da demanda em nível mundial e nacional na produção de etanol, novas expansões na produção deste biocombustível são inevitáveis. Uma estratégia para tal expansão é o uso de culturas energéticas semelhantes à cana-de-açúcar que possam integrar o sistema de cultivo ou expandir para novas áreas onde a cana não apresenta bom rendimento. Uma cultura capaz de satisfazer tais requisitos é o sorgo sacarino. A biomassa de sorgo sacarino tem potencial para aumentar a produção de etanol na região Nordeste do Brasil, tanto como matéria-prima complementar a cana-de-açúcar como em área de reduzida disponibilidade de água. Estimativas para a cultivar mais estudada, IPA 467, indicaram potencial de produção de aproximadamente 6730 L.ha-1 a partir das frações caldo, grãos e bagaço. Para um espectro amplo de cultivares a produção de etanol a partir do caldo teve influência do tipo de cultivar e do local de cultivo com médias de produção entre 680 a 3120 L.ha-1. Além do caldo, a fração lignocelulósica do bagaço deve ser vista como uma fonte promissora de açúcares fermentescíveis, mas que requer uma etapa de prétratamento e hidrólise enzimática. Neste contexto, o pré-tratamento com H2O2 demonstrou potencial de aplicabilidade como processo de baixo gasto energético com eficiências de hidrólise enzimática satisfatória para bagaço de sorgo sacarino e cana-deaçúcar. Além da etapa de pré-tratamento e hidrólise enzimática, parte fundamental da viabilidade do processo é a fermentação dos hidrolisados enzimáticos, que neste estudo apresentou o potencial de uso de uma levedura que geralmente está associada com a contaminação das dornas de fermentação de caldo de cana em destilarias, Dekkera bruxellensis, mas que apresentou boa fermentabilidade de hidrolisados com mistura de celobiose e glicose.
145
Anexo I: Artigo Publicado, “Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil”
146 Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil
Emmanuel D. Dutra1*, Adauto Gomes Barbosa Neto5, Rafael Barros de Souza3,4, Marcos Antonio de Morais Junior2,3,4, Jose Nildo Tabosa6 and Rômulo Simões Cezar Menezes1
1
Biomass
2
Interdepartmental Research Group in Metabolic Engineering, Department of Genetics,
Energy
Research
Group,
Department
of
Nuclear
Energy
and
Federal University of Pernambuco. Av. Moraes Rego, 1235, 50670-901, Recife, PE, Brazil. 3
Laboratory of Bioprocessing, CETENE. Av. Prof. Luiz Freire, 01. 50740-540, Recife,
PE, Brazil. 4
Genetech – Research, Development and Consulting in Biotechnology, Av. Moraes
Rego,1235, 50670-901, Recife, PE, Brazil 5
Agronomic Institute of Pernambuco. Av.General San Martin,1371, 50761-000, Recife,
PE, Brazil
*Corresponding author
Tel: 55 – 83 – 21267983 Fax: 55- 83 – 21267983
[email protected]
147 Ethanol production from the stem juice of different sweet sorghum cultivars in the state of Pernambuco, Northeast of Brazil
Abstract
The decline in the use of fossil fuels in the future is evidenced by the availability of its reserves and related environmental issues. Biofuels are presented as a renewable alternative to fossil fuel production, including ethanol. However, ethanol production demands the use of agricultural land and other natural resources, with emphasis on water. The purpose of this study was to evaluate the potential of eight sweet sorghum cultivars in order to expand the ethanol production to areas with limited supply of water, not suitable for sugarcane without irrigation. The samples of cultivars produced by breeding programs in the state of Pernambuco, Brazil, were analyzed for fermentation by industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, at 33°C, under static conditions for a period of 6 hours. All assessed parameters showed some statistically significant differences among cultivars (p < 0.01), especially ethanol concentration (P) and the volumetric productivities (Qp) in the following order: Willey (P = 64.77 ± 4.4 g l-1 and Qp= 10.79 ± 0.74 g l-1h-1), Wray (P = 59.10 ± 1.7 g l-1 and Qp = 9.85 ± 0.28 g l-1h-1) and BR 506 (P = 59.07 ± 1.3 g l-1 and Qp = 9.84 ± 0.21). The highest potentials for ethanol yield per hectare were observed for the cultivars SF 15 (3142.51 ± 428.47 l ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 l ha-1). Therefore, the cultivar BR 506 seems to be very promising as an energy crop to be produced in areas with environmental conditions similar to Pernambuco.
Keywords: Renewable Sources; Biofuels; Alcoholic fermentation; Energy Crops.
148 Introduction Many factors, like the emission of greenhouse gases and availability and easiness to access the current reserves, point out to a decline in the current consumption of fossil fuels. In this context, there has been an increase in the use of renewable energy sources, and among them, the sources based in bioenergy (energy in form of biomass), including the use of energy crops in order to produce biofuels like biodiesel and ethanol (Sanchés and Cardona 2008). The production of ethanol in the world is increasing every year. Ethanol can be produced from different biomass sources, such as starchy (corn and cereal grains), sucrose (sugarcane, sugar beet and sweet sorghum) and cellulosic crops (crop residues and wood) (Walker 2011). In Brazil, ethanol production derives mainly from the fermentation of the sucrose from sugarcane juice and/or molasses. Brazil produced nearly 24 billion liters of ethanol during the 2009-2010 crop season, a figure that is projected to reach 37 billion liters by 2012-2013 (Amorim et al. 2009). Nevertheless, ethanol production from sugarcane has limitations, mainly in areas with low rainfall precipitation. In the northeastern region of Brazil, only a narrow region along the coast of the Atlantic Ocean receives enough rainfall precipitation for the cultivation of sugarcane without irrigation. In the remaining areas, the adoption of new energy crops with better water use efficiency, like sweet sorghum, maybe a more sustainable solution to the expansion of ethanol production. Sorghum's potential for ethanol production has been widely reported, and its C4type photosynthetic metabolism makes appropriated for biomass production in conditions of high solar incidence and low water availability (Almodares and Hadi 2009; Vasilakoglou et al. 2011). Originally from Africa, it is now the fifth most cultivated cereal in the world for the use as forage, and most recently for energy
149 generation (Reddy et al. 2005), as complement in animal feeding and to produce fibers (Murray et al. 2008). Among other characteristics, efficient water usage (1/3 of water required for sugarcane and 1/2 of water required for corn) and the versatility of growing in different types of soil and climate. In general, sweet sorghum produces 2 ton ha-1 of grains and 50 ton ha-1 of stems, with a stem juice rich in sucrose, glucose and fructose (Wu et al. 2010). Ethanol production from fermentation of sorghum stem juice is about 3451 l ha-1 (Prasad et al. 2007). In the context of pursuing new feedstock for biofuel production, the purpose of this study was to evaluate ethanol production by fermentation of stem juice derived from different sweet sorghum cultivars in the municipality of Goiana, state of Pernambuco, Northeast region, Brazil.
Material and methods Sweet soghum biomass and juices The stems from eight sorghum cultivars were obtained from the Agronomic Institute of Pernambuco (IPA) after a field experiment to evaluate biomass production in the municipality of Goiana, state of Pernambuco, Northeast, Brazil. The region has a yearly precipitation mean around 1600 mm and average temperature of 25ºC. The evaluated cultivars were: IPA 467-4-2, Rio, Tale, Willey, Wray, BR 501, BR 506 and SF 15. The field experiment was carried out in a randomized complete block design. Plants were harvested during the grain maturation phase. Leaves and panicles were removed from the stems in order to have the juice extracted from fully clean stems in a simple sugarcane crusher system. First, the sorghum juices were evaluated for: (1) total
150 suspended solids as °BRIX values using a handheld refractometer (RT-30ATC, Instruterm); and (2) the concentration of total reducing sugars (TRS) by the 3,5dinitrosalicylic acid method (Miller 1959). After digestion with sulfuric acid and hydrogen peroxide, the following nutrient contents were determined (Thomas et al. 1967): total nitrogen (TN) by the Kjeldahl method; total phosphorus (TP) by the colorimetric method; and potassium (K) by flame photometry (Embrapa 1999). pH was determined using a Digimed potentiometer. Extracted juices were stored at -20 ºC in a freezer for subsequent fermentation assays. Fermentation experiment Fermentations were carried out in a single batch system in 500 ml Erlenmeyer flasks at 33 ºC and static conditions for 6 hours. All assays were conducted in triplicate, in a completely randomized design. A 100 ml volume of non-sterilized sorghum juice was added to the Erlenmeyer flasks and inoculated at 10 % w/v (108 cells ml-1) with pure industrial yeast Saccharomyces cerevisiae P1 strain (Silva-Filho et al. 2005) obtained directly from industrial process from Japungú distillery, Santa Rita, State of Paraíba, Brazil. The fermented juices were then centrifuged at 4200 x g for 10 minutes and the supernatant was collected and submitted to analytical analysis. Total reducing sugars were measured in the fermented juices using the DNS method (Miller 1959) and expressed in glucose equivalents. The amount of ethanol produced was quantified using gas chromatography coupled with a flame ionization detector under the following operational temperatures: 95 ºC for the column, 130º C for the injector and 160 ºC for the detector. Nitrogen (N2) was used as carrier gas. Cellular viability was determined in a Neubauer chamber using methylene blue staining. Physiological parameters
151 The following parameters were calculated during fermentation: volumetric ethanol productivity (QP); ethanol yield (YP/S), expressed as g of ethanol g-1 of consumed sugar; and sugar-to-ethanol conversion efficiency (SCE), using equations (1) and (2):
Where P is the ethanol concentration (g l-1), T is the fermentation time (h) and 0.51 is the maximum theoretical ethanol yield per gram of glucose consumed. The theoretical ethanol yield per hectare for each sweet sorghum cultivar using the results from total reducing sugars and sugar-to-ethanol conversion efficiency in accordance to the equation (3) proposed by Zhao et al. (2009) with modification on sugar-to-ethanol conversion efficiency that in the original equation is 85 %.
Where TRS is the percentage of total reducing sugar, fresh biomass is the fresh biomass production for sweet sorghum in Mg ha-1, 6.5 is the sugar-to-ethanol conversion, SCE is the sugar-to-ethanol conversion efficiency and 0.79 is the ethanol density in g ml-1. Statistical analysis The study used a completely randomized experimental design and all analytical assays were performed in triplicate. The results from °BRIX, TN, P and K content, starting TRS concentration, starting pH, volumetric ethanol productivity, ethanol yield, sugar-to-ethanol conversion efficiency and theoretical ethanol yield per hectare were submitted to variance analysis (ANOVA) and the means were compared by the Tukey test (α = 0.05) using the Software ASSISTAT (Silva and Azevedo 2002).
152
Results and discussion
Chemical composition of the juices The initial content of total reducing sugars and BRIX in the juices showed different concentrations for each cultivar. Juices from Willey, Wray and BR 506 strains had the highest °BRIX and TRS values (Table 1). The ethanol production from sweet sorghum juices in submerged fermentation is directly related to TRS concentrations; that is, up a certain level, juices with higher TRS and °BRIX concentrations result in higher ethanol concentrations by the yeast. TRS concentration above 270 g l -1 is supposed to be inhibitory and might induce oxidative stress under very high gravity fermentation (Thomas et al. 1996). °BRIX is a common analysis in sugar and ethanol producing companies, and allows direct field readings of the juices' sugar content. This variable indicates the concentration of soluble solids in the juice (in g 100 ml-1) that are possibly correlated to the content of total reducing sugars. Under the experimental conditions of this study, an increase in the °BRIX of the juices from distinct sweet sorghum cultivars resulted in a linear increase (R2=0.895) in the TRS content (Figure 1). Other studies on the fermentation of sweet sorghum juices also showed linear relations between TRS content and °BRIX (Guigou et al. 2011 - R2 = 0.960 and Tsuchihashi and Goto 2004 - R2 = 0.807). Besides, the measurements of sugar content, nutrient availability and medium pH is essential to monitor the feedstock quality in the fermentation process. The mineral
153 composition is very important for the alcoholic fermentation process, especially in the nutrition and fermentative metabolism of the yeast cells (Walker 2004). Among the analyzed minerals, potassium had the highest content in the level of 3742.9 mg l -1, the total nitrogen and phosphorus had an average of 681.2 mg l-1 and 47.4 mg l-1, respectively (Table 1). These contents are mostly influenced by soil type, crop management and by the ability of each cultivar to absorb nutrients from the soil. Potassium is the most abundant cation in yeast, constituting 1-2% of cell dry weight and acting as a major cofactor for enzymes involved in oxidative phosphorylation, protein biosynthesis and carbohydrate catabolism (Jones and Greenfield 1994). Nitrogen is important for yeast multiplication and also responsible for activation of conveyor systems sugars, increasing the entry of sugar into the cell (Lagunas et al. 1982). Phosphorus is essential for the energy metabolism and the synthesis of the nucleic acids. This element is considered essential for the absorption of carbohydrates, conversion of sugar into alcohol and ATP production in glycolysis so as respiratory chain (Amorim 1985; Vasconcelos 1987). Despite the importance of these elements in the fermentation there are no available studies that report the mineral composition of the feedstock used in the fuel ethanol production and even less about the synergistic effect of the minerals in the fermentative metabolism of the yeast. For this reason, more detailed studies are necessary to evaluate these effects. The pH is a very valuable parameter in the fermentation process, as it controls nutrient dissolution and assimilation, extracellular degrading enzymatic activity and also prevents the proliferation of contaminating microorganisms of the alcoholic fermentation (Lima et al. 2002). The juices of the eight evaluated cultivars showed an average initial pH of 5.04 (ranging from 4.60 to 5.41), which is adequate for fermentation with yeast (pH 5.0 - 6.5). Similar pH values were observed for Dale
154 cultivar (pH 5.4) (Dimple et al. 2010) and for sweet and foraging cultivars (pH 4.56) (Davila-Gomes et al. 2011). There was a reduction in the pH of all fermentations to pH around 3.94 (data not shown) that may be related to the production of organic acids in the sugar metabolism by yeast (Bai et al. 2008). Alcoholic fermentation of the juices and ethanol yield per hectare Higher ethanol concentrations obtained from the fermentation of Willey, Wray and BR 506 (Table 2) cultivars juices can be explained by the high starting content of TRS, as there was a linear correlation (R²=0.893) between the concentrations of starting total reducing sugars and ethanol (Figure 2). The average ethanol concentration for the fermentation of the juices was 50.06 g l-1 (from 30.6 to 64.7 g l-1), which is lower than the 89.5 g l-1 obtained by Laopaiboon et al. (2007) by fermenting the juice of the Keller sweet sorghum variety. This difference can be explained by the higher concentration of soluble solids, the nutrient supplementation and the higher fermentation time (average of 48h) of that report. The highest Qp values were observed for Willey, Wray and BR 506 cultivars (Table 2). Qp is directly related to ethanol concentration and fermentation time, representing a very important kinetic parameter for the viability of commercial alcoholic fermentation. In this sense, the mean volumetric productivity of 8.34 g l-1h-1 is above near values reported for sweet sorghum juice fermentation (Khongsay et al. 2010 - 1.92 g l-1 h-1 and Ratnavathi et al. 2010- 1.16 g l-1h-1). This difference can be explained by the longer fermentation times seen in the referenced studies (36 and 60 h, respectively). Another important kinetic parameter of the fermentation process is the ability of yeasts to produce ethanol from the available sugar and can be expressed as the sugar
155 conversion efficiency (SCE). The results for SCE showed differences between cultivars (Table 3) and the better results obtained for IPA 467 and BR 501 cultivars may be related to lower ethanol content seen in the fermentation of their juices, as ethanol may inhibit the fermentation process (Walker 2004). Mean values obtained for SCE in the experimental data set (90.2 %) are within the range of the main results found in scientific literature (68.6 – 94.1 %) (Wu et al. 2010; Guigou et al. 2011), evidencing the potential for fermentation of the evaluated cultivars. The total and viable cell concentrations were almost constant during all fermentations. In general terms, the values obtained for theoretical ethanol yield per hectare were low (mean = 1741.92), indicating that the cultivation practices under the assessed environmental conditions need to be improved, as well as the sugar-to-ethanol conversion efficiency. In a study conducted by Zaho et al. (2009) under another environmental condition and using distinct cultivars, with estimated mean value for two years of cultivation was 4.729 l ha-1. However, the highest theoretical ethanol yields for hectare (Table 3) were obtained for SF 15 (3142.51 ± 428.47 l ha-1) and BR 506 (2193.95 ± 383.58 l ha-1), both influenced by the high production of biomass by these cultivars. Conclusion The sweet sorghum stem juice showed potential for ethanol production in northeastern, Brazil. The cultivars SF 15 and BR 506 presented great potential for ethanol production per hectare and are promising for large-scale cultivation.
156 The authors acknowledge the financial support from CNPq (edital 46/2009, processo 551284/2010-2) and Facepe (edital 09/2010, processo APQ 07185-01/10). The Genetech company for the equipment used in the fermentation assays and the Japungú distillery (PB) for making industrial yeast biomass and the gas chromatograph available.
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161 Legend to Figures
Figure 1 Correlation between °BRIX and the content of total reducing sugars (TRS) for the juices of sweet sorghum cultivars
Figure 2 Correlation between total reducing sugars content (TRS) and ethanol concentration in the fermented juices from sweet sorghum cultivars
162 Table 1 Preliminary characterization of juices from distinct sweet sorghum cultivars obtained from a field experiment in Goiana, PE, Brazil Cultivar
°BRIX
TRS (g 100ml-1)
TN (mg l-1)
P (mg l-1)
K (mg l-1)
pH
IPA 467
13.0 ± 0.2 e1
10.59 ± 0.6 c
591.3 ± 70.4 c
54.4 ± 1.7 b
2808.7 ± 126.8 de
5.14 ± 0.01 c
Rio
12.7 ± 0.12 e
12.10 ± 0.7 bc
641.1 ± 52 bc
32.4 ± 1.1 f
4356 ± 425.5 b
4.73 ± 0.02 e
Tale
10.8 ± 0.2 f
10.47 ± 0.5 c
595.9 ± 36.5 c
48.5 ± 1.6 c
2390.7 ± 386 ef
5.26 ± 0.02 b
Willey
18.27 ± 0.12 a
17.28 ± 1.4 a
295.5 ± 62.2 d
37.2 ± 1.9 e
5729.2 ± 292.7 a
5.10 ± 0.02 c
Wray
16.3 ± 0.12 c
15.82 ± 0.4 a
737.9 ± 26.6 b
43.7 ± 0.9 d
3325.8 ± 111 cd
4.60 ± 0.02 f
BR 501
9.7 ± 0.12 g
6.39 ± 0.5 d
971.7 ± 50.5 a
24.5 ± 2.1 g
5879.6 ± 556.4 a
4.96 ± 0.02 d
BR 506
17.0 ± 0.2 b
16.48 ± 0.4 a
727.1 ± 15.8 bc
54.2 ± 0.6 b
3726.3 ± 200.5 bc
5.11 ± 0.01 c
SF 15
13.6 ± 0,2 d
13.34 ± 0.5 b
916.4 ± 54.4 a
84.2 ± 1.8 a
1726.6 ± 168.6 f
5.41 ± 0.02 a
Mean
13.9
12.81
681.2
47.4
3742.9
5.1
CV (%)
1.2
5.5
7.2
3.3
8.6
0.3
n=3 ± std. deviation 1: Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05); TRS – total reducing sugars; TN – total nitrogen.
163 Table 2 Kinetic parameters in the static fermentation of the juices from different cultivars of sweet sorghum at 33 °C using industrial yeast (pure milk) obtained from the Japungú distillery, PB, Brazil Cultivar
P (g l-1)
Qp(g l-1h-1)
Yp/s
IPA 467
52.10 ± 0.7 cd*
8.68 ± 0.12 cd
0.49 ± 0.03 a
Rio
50.83 ± 3.6 cd
8.47 ± 0.59 cd
0.42 ± 0.04 bc
Tale
45.60 ± 2.3 d
7.60 ± 0.38 d
0.44 ± 0.02 abc
Willey
64.77 ± 4.4 a
10.79 ± 0.74 a
0.44 ± 0.01 abc
Wray
59.10 ± 1.7 ab
9.85 ± 0.28 ab
0.38 ± 0.02 c
BR 501
31.00 ± 0.4 e
5.16 ± 0.07 e
0.49 ± 0.04 a
BR 506
59.07 ± 1.3 ab
9.84 ± 0.21 ab
0.40 ± 0.01 c
SF 15
54.40 ± 0.4 bc
9.07 ± 0.06 bc
0.42 ± 0.02 de
Mean
52.10
8.68
0.43
CV (%)
4.42
4.42
5.83
* n=3 ± std. deviation. P: Ethanol concentration; Q p: Ethanol volumetric productivity; Yp/s: ethanol yield in grams per gram of sugar consumed: Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05).
164
Table 3 Theoretical ethanol yield per hectare for sweet sorghum cultivars grown in Goiana, PE Cultivar
Biomass yield (Mg
SCE
CEY
(%)
(l ha-1)
ha-1)
IPA 467
26.77 ± 9.88
97.17 ± 5.40 a
1917.29 ± 825.43 bc
Rio
11.97 ± 2.20
82.95 ± 7.53 bc
948.56 ± 121.84 cd
Tale
17.57 ± 2.39
86.57 ± 1.71 abc
1305.39 ± 174.76 bcd
Willey
13.72 ± 1.71
86.60 ± 2.03 abc
1681.21 ± 154.44 bcd
Wray
22.17 ± 2.67
74.05 ± 4.02 c
2065.54 ± 224 b
BR 501
13.56 ± 0.20
96.34 ± 7.78 ab
680.95 ± 16.30 d
BR 506
20.01 ± 2.88
79.38 ± 0.72 c
2193.95 ± 383.58 ab
SF 15
35.44 ± 4.98
81.67 ± 3.35 c
3142.51 ± 428.47 a
Mean
20.15
85.59
1741.92
CV (%)
-------
5.64
21.59
* n=3 ± std. deviation. SCE: sugar-to-ethanol conversion efficiency, CEY: Calculated ethanol yield, Calculated using the equation = TRS (%) x Fresh biomass (Mg ha -1) x 6.5 x SCE x (1/0.79). Means with the same letter are not significantly different (Tukey, p < 0.05).
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