M. Bulanowska - praca magisterska

SAVE OFFLINE

Wydział� Fizyki i Informatyki Stosowanej

Praca magisterska

Małgorzata Bulanowska kierunek studiów: fizyka medyczna specjalność: dozymetria i elektronika w medycynie

Odpowiedź komórek na promieniowanie X i protony z wykorzystaniem dwóch wersji metody PCC

Opiekun: dr Justyna Miszczyk

Kraków, 24 lutego 2018

2 Oświadczam, świadoma odpowiedzialności karnej za poświadczenie nieprawdy, że niniejszą pracę dyplomową wykonałam osobiście i samodzielnie i nie korzystałam ze źródeł innych niż wymienione w pracy.

................................................................. (czytelny podpis)

3 Kraków, 24 lutego 2018 Tematyka pracy magisterskiej i praktyki dyplomowej Małgorzaty Bulanowskiej, studentki V roku studiów kierunku fizyka medyczna, specjalności dozymetria i elektronika w medycynie Temat pracy magisterskiej: Odpowiedź komórek na promieniowanie X i protony z wykorzystaniem dwóch wersji metody PCC Opiekun pracy: Recenzenci pracy: Miejsce praktyki dyplomowej:

dr Justyna Miszczyk IFJ PAN, Kraków

Program pracy magisterskiej i praktyki dyplomowej 1. Omówienie realizacji pracy magisterskiej z opiekunem. 2. Zebranie i opracowanie literatury dotyczącej tematu pracy. 3. Praktyka dyplomowa: — uczestnictwo w szkoleniu BHP, — zapoznanie się z obsługą zaawansowanego mikroskopu optycznego i właściwego oprogramowania, — uczestnictwo w szkoleniu z rozpoznawania komórek na preparatach PCC, przypisywania im właściwych faz cyklu komórkowego oraz zliczania ilości elementów na zdjęciu, — rozpoczęcie zbierania oraz analizy zdjęć w kierunku związanym z tematem pracy magisterskiej, — sporządzenie sprawozdania z praktyki. 4. Kontynuacja zbierania i analizy zdjęć związanych z tematem pracy magisterskiej. 5. Zebranie i opracowanie wyników analizy zdjęć. 6. Analiza wyników obliczeń numerycznych, ich omówienie i zatwierdzenie przez opiekuna. 7. Opracowanie redakcyjne pracy. Termin oddania w dziekanacie:

.............................................................. (podpis kierownika katedry)

.............................................................. (podpis opiekuna)

Spis treści Spis skrótów i oznaczeń . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

Wstęp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9

1.1.

Promieniowanie jonizujące . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

9

1.1.1. Zastosowania . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

10

Oddziaływanie promieniowania jonizującego na organizmy żywe . . . . . . . . . . .

11

1.2.1. Symptomy napromienienia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

14

Dozymetria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15

1.3.1. Definicje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

15

1.3.2. Dozymetria biologiczna

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

17

1.4.

Limfocyty krwi obwodowej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18

1.5.

Cykl komórkowy

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21

1.6.

Metoda PCC

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

22

1.6.1. PCC indukowana chemicznie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23

1.6.2. PCC indukowana fuzją komórek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

23

Rozdział 2. Cel badań . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

25

Rozdział 3. Materiały i metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26

1.2. 1.3.

3.1.

Materiał badawczy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

26

3.2.

Napromienianie materiału biologicznego . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

27

3.2.1. Promieniowanie X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

27

3.2.2. Protony . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

28

Preparatyka próbek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30

3.3.1. Wersja PCC-chem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30

3.3.2. Wersja PCC-CHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31

Wybrany biomarker . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31

3.4.1. Definicje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

31

3.4.2. Opis systemu zbierania i analizy obrazów . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

Opracowanie statystyczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

33

3.5.1. Niepewności pomiarowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

3.5.2. Zastosowane oprogramowanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

Rozdział 4. Rezultaty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

35

3.3.

3.4.

3.5.

4.1.

Analiza rezultatów pod kątem poprawności statystycznej . . . . . . . . . . . . . . .

35

4.2.

Dawca I (kod 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37

4.2.1. PCC-chem - promieniowanie X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37

4.2.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

37

Dawca II (kod 2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38

4.3.1. PCC-chem - promieniowanie X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38

4.3.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39

Dawca III (kod 5) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39

4.4.1. PCC-chem - promieniowanie X . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

39

4.3.

4.4.

6

Spis treści 4.4.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

40

4.5.

Dane uśrednione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

41

4.6.

Porównanie działania promieniowania X i protonowego . . . . . . . . . . . . . . . .

43

4.6.1. Wartości nPCC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

43

4.6.2. Liczebności komórek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44

4.7.

PCC w wyniku fuzji z komórkami CHO

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44

4.8.

Doświadczenia z analizy obrazów . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

46

Rozdział 5. Dyskusja wyników . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47

5.1.

Obserwacje wstępne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47

5.2.

PCC-chem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47

5.2.1. nPCC(D) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

47

5.2.2. Liczebności kategorii komórek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

48

PCC-CHO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49

Rozdział 6. Podsumowanie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

50

Bibliografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51

Dodatek A. Zastosowane procedury biologiczne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

54

Dodatek B. Cyfrowa analiza zdjęć . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

56

Dodatek C. Tabele wyników . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

58

C.1. Tabele nPCC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

58

C.2. Tabele liczebności histogramów . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

61

Spis rysunków . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

64

Spis tabel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

65

5.3.

Spis skrótów i oznaczeń — CBMN - test mikrojądrowy, ang. Cytokinesis Block Micronucleus Assay — CHO - linia komórkowa wyprowadzona z komórek jajnika chomika chińskiego, ang. Chinese Hamster Ovary — CT - tomografia komputerowa, ang. Computed Tomography — DNA - kwas deoksyrybonukleinowy — DCA - test dicentryków, ang. Dicentric (and ring) Chromosome Aberration Assay — DSB - dwuniciowe uszkodzenia DNA, ang. Double Strand Breaks — FISH - fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, ang. Fluorescence in situ Hybridization — HRR - homologiczna rekombinacja, metoda naprawy DNA, ang. Homologous Recombination Repair — IAEA - Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej z siedzibą w Wiedniu, ang. International Atomic Energy Agency — LET - liniowy współczynnik transferu energii, ang. Linear Energy Transfer — n - liczba nadmiarowych elementów w pojedynczej metafazie, — N - liczba elementów w prawidłowej metafazie, N = 46 — NHEJ - niehomologiczne łączenie końców, metoda naprawy DNA, ang. Non-Homologous End Joining — nPCC - suma nadmiarowych elementów ze zliczonych komórek, nP CC = Σ100 i=1 ni , — PET - pozytronowa tomografia emisyjna, ang. Positron Emission Tomography — PCC - test przedwczesnej kondensacji chromatyny (chromosomów), ang. Premature Chromatin (Chromosome) Condensation — PCC-chem - test PCC, wersja z przedwczesną kondensacją chromatyny indukowaną chemicznie — PCC-CHO - test PCC, wersja z przedwczesną kondensacją chromatyny indukowaną fuzją z komórkami CHO — RBE - relatywna efektywność biologiczna, ang. Relative Biological Effectiveness — SMC - klasa protein odpowiedzialnych za strukturę chromosomów, ang. Structural Maintenance of Chromosomes — SPECT - tomografia emisyjna pojedynczych fotonów, ang. Single-Photon Emission Computed Tomography — SSB - jednoniciowe uszkodzenie DNA, ang. Single Strand Breaks

Wstęp

W ostatnich latach promieniowanie jonizujące znalazło szerokie zastosowania w medycynie: od diagnostyki po terapię schorzeń, zwłaszcza nowotworów [1]. Jednakże stosowane w leczeniu dawki promieniowania są znacząco wyższe od dawek środowiskowych [2, 3], co powoduje wzrost istotności radiowrażliwości osobniczej pacjenta na tle populacji, zarówno ze względu na skuteczność leczenia, jak i potencjalnych późniejszych powikłań po terapii [3]. Spośród nowych metod terapii promieniowaniem jonizującym, szerokim zainteresowaniem cechuje się promieniowanie protonowe ze względu na swoje właściwości fizyczne [4]. Skierowanie na terapię protonową najczęściej otrzymują pacjenci ze struniakami, chrzęstniakomięsakami, czerniakami gałki ocznej, nowotworami centralnego układu nerwowego oraz głowy i szyi, a także pacjenci pediatryczni [4]. Jedynie dozymetria biologiczna jest wstanie odpowiedzieć na pytanie o reakcję organizmu na otrzymaną dawkę promieniowania. Obecnie Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej akceptuje cztery metody cytogenetyczne, spośród których metoda przedwczesnej kondensacji chromatyny (PCC) jest szczególnie wartościowa w sytuacjach, gdy wynik testu jest potrzebny w jak najkrótszym czasie (część procedur na bazie PCC umożliwia uzyskanie wyniku w czasie krótszym niż 3 dni, w tym PCC wywołana fuzją z komórkami jajnika chomika chińskiego, w przeciwieństwie do innych metod dozymetrii biologicznej) oraz dla wyjątkowo wysokich dawek, nawet do 20-30 Gy [5].

1. Wprowadzenie teoretyczne 1.1. Promieniowanie jonizujące Promieniowanie można zdefiniować jako transport energii przez fale elektromagnetyczne lub cząstki [6]. Ze względu na jego zdolność do jonizowania materii można je podzielić na promieniowanie jonizujące i niejonizujące [6, 7]. Energia kwantu promieniowania jonizującego przekracza potencjał jonizacyjny atomów, przez co jonizuje je pośrednio bądź bezpośrednio. Jonizacja bezpośrednia polega na bezpośrednich oddziaływaniach kulombowskich pomiędzy cząstką promieniowania a elektronami walencyjnymi atomu, co prowadzi do oderwania co najmniej jednego elektronu od atomu. Do tego rodzaju promieniowania należą cząstki naładowane: alfa, beta, protony oraz fragmenty jąder. Promieniowanie jonizujące pośrednio deponuje energię w materii w dwustopniowym procesie. Najpierw obojętna cząstka wytwarza cząstkę zjonizowaną, która następnie oddziałuje z reszta materii przez oddziaływania kulombowskie. Do promieniowania jonizującego pośrednio należy ultrafiolet, promieniowanie X, promieniowanie gamma oraz neutrony [6–8]. Promieniowanie X, zwane też promieniowaniem charakterystycznym [9], jest emitowane przez atom, w którym na wewnętrznych powłokach elektronowych powstała wakancja. W takim przypadku wakancja jest zapełniana przez elektron z jednej z powłok położonych wyżej energetycznie wraz z emisją kwantu promieniowania elektromagnetycznego o energii równej różnicy pomiędzy obydwoma tymi poziomami [6–9]. Innym rodzajem jonizującego promieniowania elektromagnetycznego może być bremsstrahlung, określany również jako promieniowanie hamowania. Powstaje, gdy lekkie, naładowane cząstki (elektrony, pozytrony) są hamowane przez interakcje z innymi naładowanymi cząstkami, najczęściej jądrami atomowymi, a energia kinetyczna, którą tracą jest przekształcana w promieniowanie elektromagnetyczne o widmie ciągłym [6–9]. Promieniowanie γ jest również promieniowaniem elektromagnetycznym, lecz w procesie powstawania towarzyszy rozpadowi promieniotwórczemu. Gdy dochodzi do reakcji jądrowej bądź spontanicznego rozpadu promieniotwórczego, produktem może być jądro w stanie wzbudzonym. Takie jądro może przejść do bardziej stabilnego stanu przez emisją kwantu γ [6, 7, 9]. Promieniowanie γ (anihilacyjne) jest także emitowane w procesie anihilacji pozytonu z elektronem [7]. W przeważającej większości przypadków powstają wtedy dwa przeciwnie skierowane kwanty γ o energii 0,511 MeV [6, 9]. Promieniowanie jonizujące jest powszechnie wykorzystywane w medycynie, najszerzej promieniowanie fotonowe: X i γ, lecz również β, β + (w pozytronowej tomografii emisyjnej, PET) i α [1, 6, 7]. W ostatnich latach obserwuje się rozwój zainteresowania teleradioterapią z użyciem wiązek jonowych, tzn. jąder pierwiastków lekkich, w tym wodoru, czyli protonów [10]. Dzieje się tak ze względu na szereg szczególnych właściwości, jakimi takie promieniowanie dysponuje, a które dają mu przewagę nad fotonami w teleradioterapii.

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

10

Po pierwsze, posiadają charakterystyczny rozkład dawki wraz z głębokością - po przebyciu pewnej odległości w materiale dawka deponowana przez wiązkę gwałtownie wzrasta, a następnie zanika. Jest to tzw. pik Bragga, którego położenie zależy odwrotnie proporcjonalnie od energii cząstek[10, 11]. Po drugie, protony są typem promieniowania o wyższym liniowym współczynniku przenoszenia energii od fotonów. Liniowy współczynnik przenoszenia energii (LET, ang. linear energy transfer) jest miarą pozwalającą na określenie siły wpływu danego rodzaju promieniowania na materię przez jej jonizację [12]. Definiuje on utratę energii przez promieniowanie wzdłuż jego toru. [10] Wraz ze wzrostem LET zmienia się również dystrybucja zmian indukowanych w chromosomach komórek wzdłuż toru cząstki. Jeśli promieniowanie ma niski LET, to aberracje chromosomowe występują losowo w komórkach wzdłuż toru cząstki i podlegają rozkładowi Poissona. Inaczej jest w przypadku promieniowania o wysokim LET. Dla takiego promieniowania liczba torów cząstek jest znacznie niższa niż dla takiej samej dawki promieniowania o niskim LET, a uszkodzenia są rozdystrybuowane pakietami. W takim wypadku zarówno liczba nieuszkodzonych komórek, jak i tych z wieloma aberracjami jest wyższa niż to wynika z rozkładu Poissona [5]. Do rodzajów promieniowania o niskim LET należą promieniowanie X, γ i β, a o wysokim np. promieniowanie α [12] oraz wiązki jonowe.

1.1.1. Zastosowania Od czasu jego odkrycia, promieniowanie jonizujące znalazło wiele zastosowań. Aktualnie jest ono wykorzystywane do sterylizacji żywności i sprzętu medycznego, w detektorach dymu czy przy prześwietlaniu bagażu na lotniskach lub w innych obiektach wymagających podwyższonych norm bezpieczeństwa. Sztandarowym użyciem promieniowania jest generacja energii elektrycznej w elektrowniach atomowych. Ponadto znajduje ono zastosowanie w przemyśle, m. in. przy produkcji części materiałów polimerowych lub przy kontroli jakości uzyskanych produktów[13, 14]. Przykłady użycia promieniowania jonizującego można znaleźć również w wielu innych sferach życia, jak np. w medycynie. W przypadku zastosowań medycznych promieniowania wyróżniane są ich trzy główne kategorie: radiologia diagnostyczna (w tym zabiegi interwencyjne kierowane obrazem, ang. image-guided interventional procedures), medycyna nuklearna oraz radioterapia [1]. Radioterapia jest metodą leczenia chorób, zwykle nowotworów, z wykorzystaniem promieniowania jonizującego[1, 7]. Teleradioterapia wykorzystuje w tym celu źródło promieniowania pozostające poza ciałem pacjenta, np. bomby kobaltowe lub akceleratory liniowe, natomiast brachyterapia stosuje źródła metaliczne albo zamknięte pozostające w bezpośrednim kontakcie z tkankami [1, 7]. Mówiąc o medycynie nuklearnej mamy na myśli procedury, podczas których do organizmu pacjenta wprowadza się radionuklid w formie źródła otwartego, zwykle jako radiofarmaceutyk [1, 6]. Zwykle z medycyny nuklearnej korzysta się w celu uzyskania obrazów diagnostycznych, np. za pomocą gammakamer (badanie SPECT) lub badania z użyciem pozytronowej spektroskopii emisyjnej (PET), jednakże istnieje grupa schorzeń, w których leczeniu również

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

11

się ją wykorzystuje, np. nadczynność tarczycy, rak tarczycy, stany zapalne stawów, czy leczenie bólu przy przerzutach nowotworów do kości[6, 7]. Istnieje również wyraźny trend w kierunku rozszerzania zastosowań terapeutycznych medycyny nuklearnej. W końcu termin radiologia diagnostyczna zwykle odnosi się do obrazów ciała uzyskiwanych za pomocą promieniowania X i ich analizy. Pośród technik zaliczanych do radiologii diagnostycznej można spotkać zwyczajne zdjęcia rentgenowskie, mammografię, fluoroskopię i tomografię komputerową (CT) [1, 8].

1.2. Oddziaływanie promieniowania jonizującego na organizmy żywe Niewątpliwym jest, że promieniowanie jonizujące nie jest obojętne dla materiału biologicznego. Z upływem czasu badania dowiodły, że promieniowanie może mieć wpływ zarówno na napromieniony organizm, jak i jego potomstwo, również u człowieka. Skutki oddziaływania promieniowania na osobę napromienioną są somatyczne i mogą mieć zarówno charakter deterministyczny, jak i stochastyczny, natomiast te obserwowane u potomków są dziedziczne lub genetyczne i mają jedynie charakter stochastyczny [7, 8]. Deterministyczne efekty promieniowania pojawiają się po przekroczeniu pewnej dawki progowej. Ich nasilenie narasta wraz ze wzrostem zaabsorbowanej dawki. Mogą się pojawić już po kilku godzinach lub dniach od napromienienia (skutki wczesne) albo dopiero po upłynięciu miesięcy, a nawet lat od napromienienia (skutki późne)[6–8]. Natomiast skutki stochastyczne dawki progowej nie posiadają i mają charakter probabilistyczny, przy czym prawdopodobieństwo wystąpienia efektu rośnie z dawką, lecz już stopień jego nasilenia jest od dawki niezależny[7, 8]. Są to przede wszystkim nowotwory i uszkodzenia genetyczne, a uwidaczniają się po miesiącach/latach od ekspozycji [8]. Skutki biologiczne powstające w wyniku oddziaływania promieniowania jonizującego z organizmem, wynikają z uszkodzeń wywołanych w komórkach przez przechodzącą przez tkankę cząstkę. Podczas przejścia przez materię, promieniowanie deponuje w niej swoją energię powodując jonizację molekuł, co prowadzi do zerwania wiązań chemicznych i powstania wysokoreaktywnych wolnych rodników. Promieniowanie może uszkodzić bezpośrednio ważne dla funkcjonowania komórki makromolekuły, np. DNA, lub wywołać radiolizę wody, w wyniku której powstają rodniki niszczące strukturę cząsteczek[5–7]. Śmierć komórek spowodowana przez promieniowanie jonizujące następuje przede wszystkim w wyniku uszkodzeń DNA, przy czym komórka uznawana jest za martwą nie tylko w przypadku, gdy dojdzie do jej fizycznego zniszczenia przez proces nekrozy lub apoptozy, ale też gdy na skutek katastrofy mitotycznej zostanie uniemożliwiony jej podział lub dojdzie do przedwczesnego starzenia komórki (tzn. komórka będzie wciąż metabolicznie aktywna, lecz niezdolna do podziału)[6, 15]. Podstawowym narzędziem służącym do oceny toksyczności promieniowania lub radiowrażliwości komórek jest krzywa przeżywalności komórek (krzywa dawka-skutek). Na rysunku 1.1 pokazano przykład takiej krzywej.

12

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

Rysunek 1.1: Przykład krzywych przeżywalności komórek dla dwóch rodzajów promieniowania: o niskim i wysokim LET. Rysunek pochodzi z [7, 8].

Za żywą uznaje się taką komórkę, która jest w stanie przejść 5-6 podziałów i utworzyć kolonię złożoną z co najmniej 50 komórek[8]. Krzywe przeżywalności wykreśla się na wykresach zależności frakcji przeżywających komórek od dawki promieniowania ze skalą logarytmiczno-liniową[7, 8]. Najpopularniejszym aktualnie używanym modelem opisującym przeżywalność komórek poddanych działaniu promieniowania jest model liniowo-kwadratowy: S = e−(αD+βD

2)

(1.1)

Model ten zakłada istnienie 2 typów uszkodzeń komórek. Pierwszy, liniowo zależny od dawki i reprezentowany przez stałą α, zakłada, że uszkodzenia DNA wywołane są wzdłuż toru jednej cząstki. Oznacza to duże szanse na naprawę genomu przed interakcją z kolejną cząstką przy wystarczającej ilości czasu i niskich dawkach. Drugi, opisywany przez stałą β i zależny od dawki w kwadracie, zakłada jednoczesne przechodzenie przez komórkę wielu cząstek promieniowania, co prowadzi do zwiększonego prawdopodobieństwa zaistnienia błędów w naprawie DNA i śmierci komórki[8]. Jednakże bez względu na ostateczny los komórki, pierwotną przyczyną wszystkich konsekwencji napromienienia są uszkodzenia na poziomie molekularnym, ze szczególnym uwzględnieniem materiału genetycznego. Uszkodzenia DNA mogą być bardzo zróżnicowane. Od miejsc apurynowych/apirymidynowych, przez uszkodzenia pojedynczych zasad, miejsc na nici DNA z wielokrotnymi uszkodzeniami zasad, przez sieciowanie wewnątrz nici lub z otaczającymi ją proteinami, aż po przerwanie pojedynczej (SSB, ang. single strand break) lub podwójnej nici DNA (DSB, ang. double strand break) [5, 8] przy czym

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

13

za najpoważniejsze z punktu widzenia przeżywalności komórki uznawane są dwuniciowe przerwania cząsteczki DNA (DSB)[16]. Samo wystąpienie uszkodzeń DNA nie determinuje jeszcze śmierci komórki. Dysponuje ona różnorakimi mechanizmami naprawy materiału genetycznego, które dla DSB można sprowadzić do dwóch podstawowych ścieżek: homologicznej rekombinacji (HRR, ang. homologous recombination repair) i niehomologicznego łączenia końców (NHEJ, ang. non-homologous end joining) [5, 8, 17]. Rekombinacja homologiczna bazuje na naprawie uszkodzeń korzystając z homologicznej sekwencji DNA jako wzorca, co minimalizuje ilość błędów powstających w procesie naprawy, lecz jest ograniczone koniecznością istnienia w jądrze takiej sekwencji, tzn. jest możliwe w fazach późnej S i G2 cyklu komórkowego. W przypadku mechanizmu NHEJ komórka działa bez dostępnej matrycy i łączy obecne fragmenty nici DNA. Inne rodzaje uszkodzeń mają swoje mechanizmy naprawy [8, 17]. Takie mechanizmy są zorganizowane w ścieżki koordynujące rozpoznawanie uszkodzeń genomu i przekaz sygnałów wiodących do zatrzymania postępu komórki przez cykl komórkowy za pomocą punktów kontrolnych [17] (G1 /S, G2 /M oraz wrzeciona podziałowego) [18] dopóki materiał genetyczny nie zostanie naprawiony. Takie odpowiedzi komórkowe mają przede wszystkim na celu zapobiegnięcie przekazania materiału DNA zawierającego błędy komórkom potomnym i ich ewentualnej transformacji w komórki nowotworowe. Co ciekawe, w zależności od tego, w której fazie cyklu komórki znajdowały się w momencie naświetlenia, inne typy uszkodzeń chromosomowych są dominujące, np. w przypadku napromienienia komórek ssaków w fazie G0 /G1 widoczne są przede wszystkim aberracje chromosomowe, a przy naświetleniu komórek w fazie G2 obserwowane są głównie przerwania chromatyd [17]. Wciąż nie istnieje jednolita wykładnia tłumacząca te rozbieżności, a zwłaszcza w jaki sposób z submikronowych DSB i innych defektów nici DNA powstają różne rodzaje chromosomowych uszkodzeń w zależności od fazy cyklu komórkowego, jak również z czego wynikają różnice w radiowrażliwości pomiędzy fazami cyklu komórkowego [16, 19]. Należy przy tym zauważyć, że jedynie niewielki procent pierwotnych uszkodzeń DNA prowadzi do powstania aberracji chromosomowych. Źródła takiej sytuacji upatruje się w jednoczesnym współistnieniu procesu naprawy DNA oraz dynamiki chromatyny i zmiany konformacji chromosomów w trakcie cyklu. Najprawdopodobniejszym jest scenariusz, w którym dwa ww. procesy są niekompatybilne. Przy uszkodzeniu nici DNA otaczająca ją chromatyna niekoniecznie musi ulec zniszczeniu. Jej struktura może się rozwinąć, co ma na celu ułatwienie dostępu enzymom naprawczym do nici DNA. Jeśli jednocześnie dojdzie do globalnej zmiany konformacji chromatyny, np. przy przejściu z jednej fazy cyklu komórkowego w kolejną, chromatyna może znaleźć się w stanie termodynamicznie niestabilnym, związanym ze stresem mechanicznym, a w konsekwencji istnieje prawdopodobieństwo przerwania ciągłości chromatyny i wynikającego z tego załamania się struktury chromatyd lub chromosomów. Natomiast w przypadku, gdy aparat komórkowy otrzyma wystarczającą ilość czasu, aby dokonać napraw DNA przed zmianami konformacji chromatyny, nić DNA zostanie poprawnie naprawiona lub powstaną mutacje na poziomie molekularnym, jak wymiany czy delecje [16].

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

14

Zasady ochrony radiologicznej Człowiek, i inne organizmy żywe, przez cały czas swojego życia jest poddawany działaniu promienia jonizującego pochodzącego z naturalnych źródeł: promieniowania kosmicznego i od radioizotopów wchodzących w skład skorupy ziemskiej [2]. Jednakże w związku z działalnością człowieka pojawiły się nowe zagrożenia związane z narażeniem na napromienienie promieniowaniem jonizującym. Są one związane z wyzwoleniem do środowiska materiału radioaktywnego wyprodukowanego przez człowieka lub z wykorzystania paliw i materiałów zawierających naturalnie występujące radionuklidy. Szczególnie narażone na napromienienie są osoby mające w pracy zawodowej styczność z promieniowaniem jonizującym, np. przy obsłudze źródeł promieniowania, instalacji reaktorów jądrowych, czy, co bywa nieoczywiste, przy wydobyciu i przetwarzaniu kopalin [2]. Wiedzą powszechną jest potencjalna szkodliwość promieniowania jonizującego. Skutkuje to potrzebą optymalizacji w ochronie radiologicznej, czego wyrazem jest stosowanie zasady ALARA ( As Low As Reasonably Achievable), która mówi, że pracę z promieniowaniem jonizującym należy organizować w taki sposób, aby zminimalizować otrzymywane dawki z uwzględnieniem czynników technicznych, ekonomicznych i społecznych. Zyski ze stosowania promieniowania muszą być większe od strat [20]. Ochroną radiologiczną kierują trzy czynniki: maksymalizacji odległości osoby od źródła promieniowania, minimalizacji czasu spędzanego w pobliżu źródła oraz stosowania osłon osłabiających promieniowanie. Dodatkowo podczas pracy ze źródłami otwartymi należy stosować przepisy bezpieczeństwa mające na celu zapobiegnięciu wchłonięcia radioizotopu do organizmu [20]. 1.2.1. Symptomy napromienienia Wraz z wykorzystaniem przez człowieka promieniowania jonizującego pojawia się ryzyko wystąpienia wypadków radiacyjnych, tzn. wypadków związanych z niekontrolowaną emisją promieniowania jonizującego lub materiału radioaktywnego do środowiska [21]. W następstwie wypadku radiacyjnego może dojść do narażenia osób na duże, a nawet potencjalnie śmiertelne dawki promieniowania. W takim wypadku należy podzielić pacjentów na kategorie pod względem stopnia obrażeń, czyli triage’u (czyt. triaż, z franc. triage: segregowanie, sortowanie) Wytyczne do triage’u osób napromienionych zawiera tabela 1.1. Ogólnoustrojowe objawy napromienienia mogą być ostre, występujące od kilku godzin do dni od napromienienia, lub opóźnione, mogące pojawić się po kilku miesiącach, a nawet wielu latach. Do ogólnoustrojowych wczesnych symptomów zalicza się nudności i wymioty, bóle głowy, gorączkę, trachykardię, zmęczenie i osłabienie, bóle brzucha, bóle ślinianek i rumień [22].

15

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

Tabela 1.1: Wskazówki do triage’u pacjentów z podejrzeniem urazów radiacyjnych. Tabela opracowana na podstawie [21]. Symptomy kliniczne

Dawka [Gy]

WBE

LE

WBE

LE

brak wymiotów

brak wczesnego

30

niż 1 h po ekspo-

skórze i/lub błonach

dobrze wyposażonym

zycji i/lub inne

śluzowych w ciągu

oddziale hematolo-

ciężkie symptomy,

6 h od ekspozycji

gicznym lub chirur-

np. hipotensja

hospitalizacja na

gicznym z przekazaniem do specjalistycznego centrum leczenia radiopatologii

*WBE - ang. whole body exposure, ekspozycja na całe ciało **LE - ang. local exposure, ekspozycja miejscowa

1.3. Dozymetria

1.3.1. Definicje

Dawka W celu ilościowego opisu oddziaływania promieniowania na materię zdefiniowano pojęcie dawki. W zależności od wykorzystania możemy mieć do czynienia z różnymi rodzajami dawek [20]. Najstarszą jest definicja dawki ekspozycyjnej X. Jest to stosunek sumy ładunków jednego znaku powstałych pod wpływem promieniowania w elemencie objętości powietrza

16

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

dQ do masy tego elementu dm.[20] dQ dm C [x] = 1 kg X=

(1.2) (1.3)

Najczęściej stosowaną jest dawka pochłonięta (D), czyli średnia energia tracona przez promieniowanie podczas przejścia przez ośrodek dE na jednostkę masy tego ośrodka dm, co można opisać wzorem[20]: D= [D] = 1

dE dm

J = 1Gy kg

(1.4) (1.5)

Pojęcie to można stosować do jakiegokolwiek materiału, lecz okazuje się nie wystarczać do opisu narażenia na promieniowanie materii biologicznej. Przy napromienianiu tkanek na efekt końcowy ma wpływ szereg czynników spośród których jednym z najważniejszych jest rodzaj stosowanego promieniowania. Wielkością, która uwzględnia ten czynnik jest dawka równoważna (HT ). Według definicji jest to dawka pochłonięta w tkance lub narządzie (D) zmodyfikowana przez uwzględnienie rodzaju i energii promieniowania za pomocą współczynnika nazywanego czynnikiem wagowym promieniowania wR [20] HT = wR D [HT ] = 1

J = 1Sv kg

(1.6) (1.7)

Dawka równoważna jest przydatnym pojęciem, nie uwzględnia jednak zróżnicowania radiowrażliwości pomiędzy tkankami i organami, które należy wziąć pod uwagę w przypadku napromienienia organizmu. W tym celu zdefiniowano dawkę skuteczną (efektywną) E jako sumę dawek równoważnych pochodzących od zewnętrznego i wewnętrznego narażenia, wyznaczaną z uwzględnieniem odpowiednich czynników wagowych (wT ) tkanek i narządów [20]. E=

∑

wT,i Hi

(1.8)

J = 1Sv kg

(1.9)

i

[HT ] = 1

Rodzaje dawek wymienione w tym rozdziale odnoszą się do sytuacji napromienienia źródłem zewnętrznym bądź zamkniętym. W przypadku przeniknięcia izotopu promieniotwórczego do organizmu stosuje się obciążającą dawkę równoważną HT (τ ) lub skuteczną (efektywną) dawkę obciążającą E(τ ), nie mają one jednak zastosowania w niniejszej pracy [20]. Względna efektywność biologiczna Do określenia siły oddziaływania danego rodzaju promieniowania o określonej energii na materiał biologiczny służy względna efektywność biologiczna (RBE, ang. relative biological effectiveness), definiowana jako: RBE =

DX DY

(1.10)

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

17

gdzie DX to dawka promieniowania X o energii z zakresu 200-250 keV dająca efekt Z, a DY to dawka zadanego promieniowania dająca ten sam biologiczny efekt Z [5, 10]. 1.3.2. Dozymetria biologiczna O ile dozymetria fizyczna posiada wiele zalet, to jednak nie jest ona wstanie zastąpić całkowicie dozymetrii biologicznej. Jest tak, gdyż tylko dozymetria biologiczna dostarcza bezpośrednio informacji o wpływie promieniowania na organizmy żywe, a także bywa jedynym źródłem wiedzy o dawce pochłoniętej przez materię biologiczną w przypadku, gdy w danej sytuacji nie zastosowano dozymetrii fizycznej. Dozymetrię biologiczną można zdefiniować jako ocenę pochłoniętej dawki promieniowania, lub uszkodzeń organizmu przez to promieniowanie spowodowanych, za pomocą symptomów klinicznych, włączając w to biomarkery: hematologiczne, żołądkowo-jelitowe, naczyniowo-mózgowe oraz skórne [22]. Podstawowym wyzwaniem leżącym przed dozymetrią biologiczną jest precyzyjne oszacowanie dawki zaabsorbowanej przez człowieka, pomimo dużych rozbieżności pomiędzy występowaniem i nasileniem symptomów wśród pacjentów napromienionych zbliżoną dawką całkowitą. Wynika to z rozkładu dawki zaabsorbowanej przez tkanki, np. działaniu promieniowania mogła zostać poddana jedynie część ciała, rodzaju promieniowania czy skłonności osobniczych organizmu. Testy cytogenetyczne Szczególne znaczenie dla dozymetrii biologicznej mają testy cytogenetyczne. Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej (ang. International Atomic Energy Agency, IAEA) uznaje cztery rodzaje testów za mogące służyć do oceny dawki pochłoniętej przez pacjenta. Te testy to: 1. test chromosomów dicentrycznych, 2. analiza translokacji, 3. przedwczesna kondensacja chromatyny oraz 4. test mikrojądrowy [5, 22] . W testach cytogenetycznych pomiar dawki odbywa się przez porównanie poziomu odpowiedniego biomarkera z właściwą krzywą kalibracyjną dawka-skutek. Wielkość uzyskana w taki sposób obrazuje dawkę otrzymaną przez limfocyty, którą można uogólnić na całe ciało dzięki mobilności limfocytów w ciele człowieka [5]. Podstawowe różnice pomiędzy ww. testami obrazuje tabela 1.2.

18

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

Tabela 1.2: Podsumowanie charakterystyk biodozymetrycznych testów cytogenetycznych. Tabela opracowana na podstawie [5, 22]. Typ

Rodzaj

Typowe

Zakres

Częściowa

Zastoso-

testu

zliczanych

schematy

dawek

ekspozy-

wanie

aberracji

ekspozycji

cja ciała

w triage’u

dicentryki

jednorazowa

0.1 – 5 Gy

tak

tak

(i ringi)

lub przedłużona, 0.2 – 20 Gy

tak

tak

0.25 – 4 Gy

–

–

0.3 – 4 Gy

–

tak

DCA

niedawna PCC

fragmenty nad-

jednorazowa,

miarowe (oraz

niedawna

dicentryki i ringi) FISH

CBMN

dicentryki

jednorazowa

(i ringi),

lub przedłużona,

translokacje

dawna

mikrojądra

jednorazowa

i/lub mostki nu-

lub przedłużona,

kleoplazmatyczne

niedawna

1.4. Limfocyty krwi obwodowej Limfocyty krwi obwodowej są komórkami obecnymi w krwi człowieka. Obserwowane pod mikroskopem posiadają średnicę około 6 µm i objętość rzędu 100 µm3 . Dwa podstawowe typy limfocytów to limfocyty T i B, których obydwa rodzaje są wytwarzane m.in. w tarczycy z komórek macierzystych pochodzących ze szpiku. Zarówno komórki T, jak i B posiadają różne podtypy spełniające różnorodne funkcje w organizmie, i posiadające w związku z tym odpowiednie czasy życia. Całkowita liczba limfocytów w organizmie zdrowego, młodego człowieka jest szacowana na 500 · 109 , jednakże tylko około 2% tej puli jest obecna w krwi obwodowej. Dodatkowo, na ilość limfocytów w krwi obwodowej wpływają takie czynniki jak: wiek, przynależność etniczna, stan zdrowia, czy czynniki środowiskowe. Dlatego za normę u zdrowego dorosłego przyjmuje się 1, 5–4 · 109 na litr. Reszta limfocytów, czyli około 98% jest rozprzestrzeniona w tkankach organizmu, lecz jak się szacuje ok. 80% z nich jest w stanie krążyć pomiędzy krwiobiegiem a tkankami. Średni czas przebywania limfocytów krwi wynosi ok, ½ godziny, a całkowity czas recyrkulacji wynosi 12 godzin. Wynika z tego, że ślad po uszkodzeniach radiacyjnych będzie obecny w krwi obwodowej nawet jeśli napromieniona zostanie jedynie część ciała.Jedynie 0,2% limfocytów znajduje się w cyklu komórkowym, co oznacza, że prawie wszystkie są w fazie G0 . Po pobraniu jest je stosunkowo łatwo pobudzić do podziału za pomocą PHA. Wynika z tego, że w momencie napromienienia komórki znajdują się w tej samej fazie cyklu, a po stymulacji ich cykle komórkowe są w dużym stopniu zsynchronizowane, na czym bazują omawiane metody cytogenetyczne [5].

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

19

Analiza chromosomów dicentrycznych

Test dicentryków jest podstawowym i najszerzej używanym testem cytogenetycznym. Opiera się na analizie częstości występowania chromosomów dicentrycznych w napromienionych limfocytach krwi człowieka. Dodatkowym biomarkerem, który może być stosowany w ocenie dawki jest częstość występowania chromosomów kolistych, czyli ringów (z ang. ring - pierścień). W celu wykonana testu konieczne jest wykonanie hodowli limfocytów trwającej 48 godzin w temperaturze 37o C w atmosferze 5% CO2 . Przeprowadzenie procedury jest możliwe zarówno z pełnej krwi jak i z izolowanych limfocytów. W celu zatrzymania komórek w metafazie, przed zakończeniem hodowli, typowo na 2 lub 3 godziny przed końcem, jest dodawany kolcemid. Po zakończeniu hodowli, komórki muszą zostać poddane utrwaleniu. Należy je odwirować oraz usunąć supernatant i zastąpić go roztworem hipotonicznym oraz pozostawić na okres rzędu 5-10 min. Następnie ponownie poddać wirowaniu, usunąć roztwór, a peletę rozprowadzić w 5-10 ml roztworu utrwalającego. Jest to roztwór kwasu octowego w metanolu, w proporcjach 1 do 3. W takim stanie komórki mogą zostać zamrożone lub nałożone na szkiełka laboratoryjne. Komórki należy nakładać z roztworu utrwalającego, w ilości 1 – 2 kropli na szkiełko, a preparaty powinny być pozostawione do wyschnięcia. Tak przygotowane preparaty mogą być barwione barwnikiem Giemsy bądź znacznikami fluorescencyjnymi. Po wybarwieniu można przejść do analizy przygotowanego materiału. Do analizy wybierane są komórki w metafazie oraz tzw. kompletne, czyli np. z 46 centromerami [5]. Jeżeli w komórce można znaleźć fragmenty acentryczne, powinno być możliwe odnalezienie obiektów zawierających centromer, np. chromosom dicentryczny i fragment acentryczny. Do oceny dawki pochłoniętej, laboratorium musi dysponować odpowiednią krzywą kalibracyjną do odpowiedniego rodzaju promieniowania. Ze względu na fakt, że udowodniono różnicę w odpowiedzi komórek na promieniowanie X i gamma, zwłaszcza w obszarze niskich dawek, tj. 0,5 Gy, zaleca się powiadanie osobnych krzywych dla obydwu rodzajów promieniowania. Dla promieniowania X np. z zakresu 200 – 250 keV oraz dla 60 Co lub 137 Cs [5]. Do otrzymania statystycznie wiarygodnego wyniku, konieczna jest odpowiednia liczba zdarzeń. Naturalnie, dicentryki występują w bardzo niewielkiej ilości komórek, rzędu 0,5 – 1 na 1000 komórek. Wiąże się z tym zarówno słabość, jak i zaleta metody analizy dicentryków. Z jednej strony, do rzetelnej oceny dawki, konieczne jest przeanalizowanie dużej liczby komórek, typowo około 500, co skutkuje dużymi nakładami pracy do oceny dawki pochłoniętej dla 1 pacjenta. W przypadku dużych dawek pochłoniętych, gdy mamy do czynienia z obniżeniem liczebności limfocytów, a liczba aberracji na 1 komórkę jest wysoka, można poprzestać na analizie nawet kilkudziesięciu komórek. Z drugiej jednak strony, tak niewielkie naturalne występowanie dicentryków, umożliwia oszacowanie bardzo niskich dawek, sama zatem metoda charakteryzuje się dużą czułością. Dla przykładu, dolny limit wykrywalności dawki promieniowania o niskim LET, waha się w okolicach 0,1-0,2 Gy [5].

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

20

Analiza translokacji - Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ Zarówno analiza dicentryków, jak test mikrojądrowy wykorzystują niestabilne uszkodzenia DNA, które powodują usunięcie komórki z puli limfocytów krwi obwodowej wraz z odnawianiem się komórek. Prowadzi to do ograniczenia stosowania tych metod jedynie do krótkotrwałych i niedawnych ekspozycji na promieniowanie. W przypadku ekspozycji przedłużonych bądź tych, które miały miejsce w odległym czasie, konieczna jest analiza dłużej utrzymujących się uszkodzeń, takich jak np. stabilnych translokacji. Metodą służącą do obserwacji translokacji jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH). Technika ta wykorzystuje sondy fluorescencyjne zawierające sekwencje DNA, w celu rozpoznawania określonej części genomu oraz zabarwienia jej za pomocą odpowiednich barwników fluorescencyjnych. Technika ta pozwala na wykorzystanie więcej niż jednego barwika jednocześnie w celu analizy różnych fragmentów DNA. Procedury pobierania krwi, hodowli limfocytów i utrwalania komórek są analogiczne, do tych, przedstawionych dla analizy dicentryków. Pomimo, że translokacje są aberracjami stabilnymi, do dobrej praktyki laboratoryjnej należy także analiza metafaz M1 , tzn. przy pierwszym podziale mitotycznym. Powodem tego jest utrata komórek podczas pierwszej mitozy, zawierających jednocześnie translokacje i aberracje niestabilne, co mogłoby powodować zafałszowanie średniej częstości występowania translokacji. Ponadto, w niektórych wypadkach konieczna jest jednoczesna analiza translokacji jak i dicentryków pochodzących od tego samego dawcy [5]. Zazwyczaj, dla celów dozymetrii biologicznej jedynie część genomu jest wybarwiana, np. trzy pary chromosomów, przez co konieczna jest analiza większej ilości metafaz niż w przypadku analizy dicentryków. Test mikrojądrowy Test mikrojądrowy podobnie jak analiza dicentryków jest powiązany z niestabilnymi uszkodzeniami chromosomów. Acentryczne fragmenty chromosomów oraz chromosomy, które nie są w stanie oddziaływać z wrzecionem są wykluczane z jądra komórki potomnej, tworząc w anafazie mikrojądro. Analiza częstości występowania mikrojąder jest możliwa w przypadku blokady podziału cytoplazmy, prowadzącej do powstania komórek dwujądrzastych. W przypadku takich komórek wiadomo, że doszło do podziału jądra, a ewentualna obecność mikrojądra, świadczy o uszkodzeniach komórki pierwotnej. Hodowla limfocytów na potrzeby testu mikrojądrowego jest zbliżona do metody stosowanej zarówno do analizy dicentryków, jak i FISH, jednakże w 24 lub 44 godzinie należy dodać cytochalasynę-B, kolcemid nie jest stosowany, czas hodowli wynosi 72 godziny, a utrwalanie jest zmodyfikowane w taki sposób, aby zachować cytoplazmę komórek. Komórki wybarwia się barwnikiem Giemsy lub barwnikami fluorescencyjnymi. Typową liczbą analizowanych komórek w tej metodzie jest 1000, a najbardziej popularnymi biomarkerami jest liczba mikrojąder w komórkach dwujądrzastych lub zawierających mostki nukleoplazmatyczne. Występują znaczne rozbieżności w występowaniu liczby mikrojąder u nienapromienionych dawców w zależności od czynników środowiskowych, wieku oraz płci. Różnice

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

21

wynoszą od 0 do 40 na 1 tys. komórek dwujądrzastych, przez co szacuje się, że metoda ta powinna być stosowana dopiero przy ekspozycjach przekraczających 0,2 - 0,3 Gy. Ostatnią z metod dozymetrii cytogenetycznej jest PCC, lecz zostanie ona omówiona w rozdziale 1.6.

1.5. Cykl komórkowy Wszystkie proliferujące komórki w ciele człowieka znajdują się w cyklu komórkowym, który składa się z dwóch podstawowych faz: 1. interfazy, w czasie której dochodzi do podwojenia materiału genetycznego oraz 2. mitozy, w której komórka pierwotna dzieli się na komórki potomne. Zarówno interfazę (1) jak i mitozę (2) można podzielić na fazy składowe. W przypadku tej pierwszej są to: faza G1 , faza S oraz faza G2 , a w przypadku drugiej: profaza, metafaza, anafaza i telofaza. Naturalnie, w organizmie człowieka komórki danej tkanki nie są zsynchronizowane względem siebie w cyklu komórkowym, a także długość trwania poszczególnych faz cyklu jest określona jedynie w przybliżeniu. Jest to ważne z punktu widzenia biodozymetrii cytogenetycznej, gdyż jak wykazano, radiowrażliwość komórek na promieniowanie zmienia się wraz z fazą cyklu, w której komórka się znajduje. Różnice w podatności na promieniowanie komórki w różnych stadiach jej cyklu, jest przypisywane zmianom morfologii DNA w trakcie jej życia. W fazie G1 materiał genetyczny odziedziczony po komórce rodzicielskiej jest dekondensowany, w fazie S (gdy dochodzi do replikacji DNA) jest on najbardziej rozproszony, w fazie G2 natomiast, zapoczątkowywana jest ponowna kondensacja chromosomów, która kończy się w metafazie, kiedy to materiał genetyczny jest dzielony pomiędzy dwie komórki potomne. Kondensacja DNA jest procesem tak ważnym, jak i skomplikowanym, co można wywieść z faktu, że każde jądro komórkowe zawiera nici DNA o łącznej długości niemal 2 metrów skompresowane do chromosomów o sumarycznej długości rzędu 200 µm [23]. Kondensacja DNA jest uzależniona od aktywności protein z rodziny SMC (ang. Structural Maintenance of Chromosomes). Ich kompleksy są odpowiedzialne za min. oddziaływania pomiędzy chromatydami, kondensację chromosomów, naprawę DNA czy epigenetyczne wyciszanie ekspresji genów [23]. Spośród białek tworzonych przez proteiny SMC na szczególną uwagę zasługują kondensyna I i kondensyna II. Kondensyna I odpowiada za wzdłużne upakowanie materiału DNA, a kondensyna II za skracanie osiowe chromatyd, natomiast od równowagi pomiędzy ich stężeniami zależy powodzenie procesu kondensacji chromatyny oraz utrzymanie kształtu chromosomów. Stężenia kondensyn I i II są regulowane niezależnie w trakcie cyklu komórkowego. Kondensyna I jest obecna w cytoplazmie od momentu gdy komórka wchodzi w interfazę, aż do czasu kiedy niemal opuszcza profazę, dociera do chromosomów dopiero po pęknięciu błony jądra komórkowego. W przeciwieństwie do niej kondensyna II jest obecna w jądrze komórkowym już w interfazie. Istnieje również trzecia klasa kondensyn, skutki jej działania nie są jednak dobrze poznane, lecz są związane z naprawą DNA [23].

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

22

Drugą ważną klasą białek pochodzących od SMC są kohezyny odpowiadające za łączenie chromatyd siostrzanych. Podobnie jak w przypadku kondensyn, stężenia kohezyn zmieniają się wraz z fazą cyklu komórkowego. Kohezyny są zawsze związane z chromatydami. Ich stężenia zaczynają maleć, gdy komórka wchodzi w metafazę, a ich obecność jest niewykrywalna gdy komórka wkracza w anafazę co pomaga w rozdzieleniu chromatyd siostrzanych w okolicy centromeru [23]. Kondensyny i kohezyny pełnią wiele funkcji w komórce, niezależnie od ich wpływu na cykl komórkowy, są ważne dla organizacji genomu w interfazie, ekspresji genów oraz w mejozie [23]. Do ważnych protein dla procesu przejścia komórki przez fazy cyklu należą cykliny oraz surwiwiny (ang. survivins). Poszczególne cykliny, poprzez interakcję z kinazami cyklinozależnymi, odpowiadają za przejścia pomiędzy poszczególnymi fazami cyklu komórkowego, natomiast surwiwiny należą do grupy protein będących inhibitorami apoptozy. W prawidłowych komórkach są one obecne w fazie G2 /M oraz niewykrywalne podczas reszty interfazy[23].

1.6. Metoda PCC PCC, czyli przedwczesna kondensacja chromatyny jest metodą cytogenetyczną służącą do oceny szkodliwego wpływu na organizm genotoksycznego czynnika chemicznego lub promieniowania jonizującego w przypadku niedawnej ekspozycji [5, 24]. W niniejszej pracy metoda ta jest używana w kontekście promieniowania X i protonowego. Do innych zastosowań PCC można zaliczyć wczesną detekcję niektórych chorób genetycznych, analizę cyklu komórkowego, czy badania nad dynamiką kondensacji chromatyny i mechanizmami naprawy DNA. PCC można wykonać na dwa główne sposoby: 1. przez indukcję chemiczną, 2. przez fuzję z komórkami mitotycznymi. Istotą tej metody jest analiza morfologii skondensowanej chromatyny na różnych etapach cyklu komórkowego. W naturalnie przebiegającym cyklu komórkowym ze skondensowaną chromatyną mamy do czynienia dopiero w metafazie. Natomiast przy zastosowaniu metody PCC, pod wpływem czynników indukujących kondensację, chromatyna przybiera różne formy, charakterystyczne dla poszczególnych faz cyklu [23]. W fazie G1 widoczne są pojedyncze chromatydy w liczbie 46 dla zdrowych komórek człowieka, w fazie S widać rozproszony materiał genetyczny, a w fazie G2 obserwujemy pojedyncze chromatydy w ilości podwojonej w stosunku do fazy G1 , które w miarę postępu cyklu układają się w pary, aż przy wkroczeniu w fazę M tworzą chromosomy. W metodzie PCC można stosować dwa podstawowe biomarkery: — częstość występowania nadmiarowych fragmentów, zazwyczaj wykorzystywana przy niższych dawkach, oraz

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

23

Rysunek 1.2: Przykłady obrazów chromatyny typowych dla odpowiednich faz cyklu komórkowego pozyskanych z użyciem metody PCC-chem. Rysunek zaczerpnięty z [25].

— częstość występowania ringów, bardziej użyteczna przy wysokich i bardzo wysokich dawkach. 1.6.1. PCC indukowana chemicznie Jedną z najpopularniejszych metod indukowania przedwczesnej kondensacji chromatyny w komórkach jest wprowadzenie do medium związku chemicznego, np. kalikuliny A, który jest inhibitorem fosfataz seryny/treoniny typów 1 i 2A. Dezaktywacja tych fosfataz skutkuje wystąpieniem PCC we wszystkich fazach cyklu komórkowego. Zaletą tej metody jest to, że w komórkach w fazie G2 nie ma wyraźnie widocznych centromerów dzięki czemu łatwo je odróżnić od komórek w metafazie. Nie ma ona jednakże zastosowania w przypadku komórek pozostających w stanie spoczynku, np. limfocytów G0 . Takie komórki trzeba najpierw sprowokować do podziału [24]. Na rysunku 1.2 pokazano przykładowe metafazy indukowane za pomocą metody PCC-chem o wyglądzie charakterystycznym dla poszczególnych faz cyklu komórkowego. 1.6.2. PCC indukowana fuzją komórek Istotą tej metody jest indukcja PCC w komórkach w interfazie za pomocą naturalnie występujących protein wywołujących kondensację chromatyny pochodzących od komórek znajdujących się w metafazie. Osiąga się to za pomocą fuzji dwóch komórek wywołanej przez wirus Sendai lub inny czynnik wywołujący fuzje np. glikol polietynelowy. Rezultaty uzyskiwane za pomocą obydwu z ww. czynników są porównywalne, jednakże postępowanie z wirusami może być problematyczne. Ponadto, nie wszystkie typy komórek są jednakowo

Rozdział 1. Wprowadzenie teoretyczne

24

podatne na wirusy, np. wysoką odpornością charakteryzują się limfocyty. Na bazie PEG powstał stosunkowo prosty i powtarzalny protokół indukcji PCC wykorzystujący fuzje komórek limfocytów człowieka z komórkami CHO w fazie mitozy, opublikowany po raz pierwszy przez Panteliasa i Maillie [24]. Podstawową zaletą tej metody jest brak konieczności hodowli komórkowej limfocytów, co znacząco skraca oczekiwanie na wynik, a także pozwala na obserwację uszkodzeń DNA przed naprawą przez mechanizmy komórkowe. Dla celów dozymetrii biologicznej w tej metodzie analizowane są komórki w fazie G1 w celu łatwego odróżnienia chromosomów człowieka od tych pochodzących z CHO [5]. Preparaty w obydwu tych metodach mogą być wybarwiane standardowo za pomocą barwnika Giemsy lub z użyciem sond fluorescencyjnych [5].

2. Cel badań Celem niniejszej pracy było porównanie odpowiedzi limfocytów na promieniowanie otrzymywanych za pomocą dwóch wersji metody PCC dla trzech dawców (1, 2 i 5). Zamierzano to uzyskać przez: – po pierwsze, przez otrzymanie krzywych dawka–skutek dla metody PCC-chem dla promieniowania X i protonowego. Na podstawie opracowanych modeli oraz ewentualnie uzyskanych innych danych należało porównać uzyskane wyniki otrzymywanych za pomocą metody PCC-chem dla promieniowania X i protonowego. –po drugie, przez próbę uzyskania, w przypadku zebrania wystarczających danych, uproszczonych krzywych dawka–skutek dla metody PCC-CHO i promieniowania protonowego. W przypadku, gdyby było to niemożliwe, należało podjąć próbę oceny jakości przygotowanych preparatów i potencjału metody przy stosowaniu jej do protonów. Dodatkowo, jako że w czasie wykonywania niniejszej pracy magisterskiej do laboratorium był wprowadzany nowy system automatycznego zbierania i analizy obrazów, do zadań magistrantki zaliczono opracowanie jednolitej procedury analizy obrazów z wykorzystaniem systemu MetaSystems.

3. Materiały i metody Część badawczą niniejszej pracy magisterskiej zrealizowano w laboratorium cytogenetyki klasycznej i molekularnej znajdującym się w Zakładzie Fizyki Doświadczalnej Układów Złożonych Instytutu Fizyki Jądrowej im. Henryka Niewodniczańskiego Polskiej Akademii Nauk w Krakowie.

3.1. Materiał badawczy Eksperymenty badawcze zrealizowane w ramach projektu „Opracowanie i optymalizacja metody PCC dla potrzeb stosowania na stanowisku radioterapii protonowej Centrum Cyklotronowego Bronowice”, nr rej. 2013/09/D/NZ7/00324, konkurs Sonata Narodowego Centrum Nauki, zakwalifikowanego do realizacji na lata 2014-2017, zostały wykonane na pełnej krwi obwodowej oraz izolowanych limfocytach grupy 10 dawców. Na potrzeby niniejszej pracy, ze względu na czasochłonność pomiarów i preparatyki, do analizy wybrano tylko dawców 1, 2 i 5. Krew wykorzystana w niniejszej pracy została pobrana na podstawie zgody Komisji Bioetycznej przy Okręgowej Izbie Lekarskiej w Krakowie, nr 124/KBL/OIL/2013 z dnia 27 listopada 2013 r., pod tytułem ”Ocena biologicznie skutecznej dawki pochłoniętej wiązki protonowej w komórkach człowieka na potrzeby terapii hadronowej w Centrum Cyklotronowym Bronowice IFJ PAN”. Przed pobraniem krwi dawcy - wolontariusze, wypełnili ankiety dotyczące ich stanu zdrowia i stylu życia, które zostały przygotowane we współpracy z Katedrą Epidemiologii i Medycyny Zapobiegawczej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. Kwestionariusz ten został zamieszczony w pracy magisterskiej mgr Iwony Możdżeń [26] Tabela 3.1: Dawcy i wybrane dotyczące ich informacje, wyciąg z ankiet. Kod dawcy

1

2

5

kobieta

kobieta

mężczyzna

42

51

59

tak*

tak*

tak*

Palenie papierosów

nie

nie

nie

Dieta

nie

nie

tak**

Sport

nie

nie

nie

Nowotwory w rodzinie

tak

tak

tak

Płeć Wiek (lata) Narażenie na promieniowanie

*brak zakwalifikowania do klasy B pracowników narażonych na promieniowanie *dieta związana z chorobami układu krążenia Krew od dawców została pobrana przez wyspecjalizowaną firmę ”DIAGNOSTYKA” Sp. z o.o. do probówek z heparynianem litu, czynnikiem działającym przeciwkrzepliwie, a następnie podzielona na części do naświetlania i zakładania hodowli komórkowych.

27

Rozdział 3. Materiały i metody

W ramach pracy magisterskiej wykorzystano preparaty wykonane z krwi pochodzącej od 3 dawców o kodach 1, 2 i 5. W tabeli 3.1 przedstawiono wybrane informacje o tychże dawcach.

3.2. Napromienianie materiału biologicznego Materiał badawczy został podzielony na próbki oraz opisany kodami. W ramach projektu wykonywane były eksperymenty, przy których próbki otrzymywały dawki do 20 Gy, lecz w niniejszej pracy magisterskiej skupiono się na zakresie dawek 0 - 4 Gy, przy czym dawka 0 Gy dla każdego dawcy jest dawką kontrolną identyczną dla promieniowania X i protonowego. Dawki, jakie otrzymały próbki, wynosiły kolejno: 0,3; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 i 4,0 Gy. 3.2.1. Promieniowanie X Materiał badawczy był naświetlany promieniowaniem X przy użyciu aparatu X-ray z lampą MCN 323 firmy Philips w Zakładzie Fizyki Doświadczalnej Układów Złożonych IFJ PAN. Rysunek 3.1 pokazuje wykorzystane stanowisko do naświetlania. Lampa rentgenowska pracowała pod napięciem 250 kV przy natężeniu prądu anodowego równym 10 mA z filtrem o grubości 2,5 mm. Odległość pomiędzy lampą a napromienianymi próbkami wynosiła 21 cm. Moc dawki w tym układzie eksperymentalnym wynosiła 2 Gy/min. Dozymetria Przed naświetleniem próbek przeprowadzono dozymetrię w układzie eksperymentalnym. Do określenia mocy dawki służyła cylindryczna komora jonizacyjna PTW 31010-5678 o objętości czynnej 0,125 cm3 podłączonej do elektrometru UNIDOS nr 4. Pomiary dozymetryczne były wykonywane przy współpracy z Samodzielną Pracownią Radioterapii Protonowej oraz Akredytowanym Laboratorium Dozymetrii Indywidualnej i Środowiskowej IFJ PAN. Pomiary dozymetryczne przeprowadzono według tych samych procedur co naświetlanie materiału biologicznego. Komorę jonizacyjną włożono do probówki typu Eppendorf wypełnionej wodą i ustawiono w taki sposób, aby punkt referencyjny komory znajdował się w osi wiązki promieniowania. Obliczenia dawki przeprowadzono według wytycznych zamieszczonych w protokole dozymetrycznym TRS-398. Wzór na dawkę pochłoniętą w fantomie można zapisać jako: Dw = kT p · kQ · MD ,

(3.1)

gdzie MD to wartość dawki odczytana z elektrometru w grey’ach. Za wartość współczynnika korelacji uwzględniającego ciśnienie i temperaturę kT p przyjęto 1,025, a kQ uznano za równe 1,03. Dla komory cylindrycznej z elektrometrem przyjęto do obliczeń współczynnik kalibracyjny NDw = 3, 033 · 108 Gy/C. W tabeli 3.2 przedstawiono uzyskane wyniki pomiarów.

28

Rozdział 3. Materiały i metody

Rysunek 3.1: Zdjęcie stanowiska do napromieniania próbek promieniowaniem X. Fot. Kamila Rawojć [27]

Tabela 3.2: Zebrane wyniki pomiarów dozymetrycznych. Zadana

Katalog

MU na elek-

Czas napro-

Dw

Moc dawki

dawka [Gy]

z wynikami

trometrze

mieniania [s]

[Gy]

[Gy/s]

0,3

16_48_48

0,273

3,5

0,288

0,082

5

17_57_22

4,762

61,0

5,027

0,082

10

20_07_52

9,524

40,8

10,055

0,246

W tabeli 3.3 skonfrontowano przewidywane wartości dawki otrzymanej przez próbkę i mocy dawki z rzeczywistymi wartościami dawki pochłoniętej przez materiał biologiczny.

3.2.2. Protony Do naświetlania materiału biologicznego wykorzystano cyklotron Proteus C-235 belgijskiej firmy Ion Beam Applications, znajdujący się w Centrum Cyklotronowym Bronowice IFJ PAN w Krakowie, emitujący protony o energii 60 MeV. Próbki napromieniano na stanowisku radioterapii protonowej nowotworów oka. Materiał biologiczny umieszczono w probówkach typu Eppendorf i wkładano je kolejno do przymocowanego do fotela terapeutycznego dedykowanego fantomu wykonanego z polimetakrylanu metylu (PMMA). Ponadto do przedniej ściany fantomu przymocowano dwie płyty z tworzywa sztucznego (PMMA 10 i LUCITE 20) stanowiące model warstwy wody o grubości 13,78 mm. Ma-

29

Rozdział 3. Materiały i metody

Tabela 3.3: Rezultaty naświetlania próbek z materiałem biologicznym. Promieniowanie X. Kod dawki

Zadana

Czas naświet-

Moc dawki

Otrzymana

dawka [Gy]

lania [s]

[Gy/min]

dawka [Gy]

2

0,3

10

2

0,3

3

0,5

16

2

0,5

4

0,75

23

2

0,75

5

1

31

2

1

6

1,5

46

2

1,5

7

2

61

2

2

8

2,5

76

2

2,5

9

3

91

2

3

10

4

121

2

4

teriał biologiczny znajdował się w całości w wiązce protonowej w izocentrum stanowiska do naświetlania. Przykład układu eksperymentalnego pokazano na rysunku 3.2. Dozymetria Pomiary dozymetryczne dla promieniowania protonowego zostały wykonane analogicznie, jak dla promieniowania X, które zostały opisane w podrozdziale 3.2.1. W tabeli 3.4 skonfrontowano przewidywane wartości dawki otrzymanej przez próbkę i mocy dawki z rzeczywistymi wartościami dawki pochłoniętej przez materiał biologiczny. Tabela 3.4: Rezultaty naświetlania próbek z materiałem biologicznym. Promieniowanie protonowe. Kod dawki

Zadana

Czas naświet-

Moc dawki

Otrzymana

dawka [Gy]

lania [s]

[Gy/min]

dawka [Gy]

2

0,3

3,53

0,094

0,331

3

0,5

5,22

0,099

0,514

4

0,75

8,15

0,094

0,764

5

1

12,43

0,082

1,017

6

1,5

19,9

0,077

1,512

7

2

23,68

0,081

1,907

8

2,5

31,22

0,08

2,503

9

3

24,98

0,12

3,002

10

4

33,52

0,119

3,992

Rozdział 3. Materiały i metody

30

Rysunek 3.2: Stanowisko do naświetlania materiału biologicznego w probówkach typu Eppendorf wiązką protonową z cyklotronu AIC-144, analogiczne do stanowiska cyklotronu Proteus. Fot. Kamila Rawojć [27]

3.3. Preparatyka próbek Krew pobraną od dawców podzielono w taki sposób, aby można ją było wykorzystać w kilku testach cytogenetycznych: DCA, CBMN i PCC w dwóch wersjach. W kolejnym kroku objętość krwi przeznaczoną dla każdego testu podzielono na trzy grupy: a) grupę kontrolną, b) przeznaczoną do napromienienia promieniowaniem X i c) do napromieniania protonami. Następnie krew z każdej z grup rozdysponowano i naświetlono odpowiednimi dawkami promieniowania. Na rysunku 3.3 przestawiono schemat podziału krwi od dawców. Po naświetleniu materiału biologicznego założono hodowle limfocytów zgodnie z wytycznymi dla testów, do których miały być użyte. Poszczególne etapy naświetlania, przygotowania limfocytów na potrzeby testów PCC i CBMN oraz analizy mikroskopowej były wykonywane przez członków zespołu projektu Narodowego Centrum Nauki, konkurs SONATA, nr: DEC-2013/09/D/NZ7/00324. Pełne wersje procedur przygotowania limfocytów dla potrzeb PCC zostały zamieszczone w aneksie A. Poniżej przedstawiono ich formy skrócone.

3.3.1. Wersja PCC-chem W bieżącej pracy, w wersji PCC z kondensacją chromatyny indukowaną chemicznie, skorzystano z próbek sporządzonych z pełnej krwi obwodowej. Po naświetleniu dawką docelową z zakresu 0 - 4 Gy materiał biologiczny przeniesiono do naczynia z pożywką, a następnie inkubowano przez 46 h. Po 24 h do naczynia dodano 20 µl kolcemidu, a na 30 min przed końcem hodowli dodano 25 µl kalikuliny A.

31

Rozdział 3. Materiały i metody

Rysunek 3.3: Schemat podziału krwi pełnej pobranej od dawców w ramach projektu.

Do utrwalania komórek wykorzystano metodę wg Mozdaraniego przedstawioną w aneksie A oraz wybarwiono roztworem Giemsy [28]. 3.3.2. Wersja PCC-CHO Po naświetleniu dawką docelową z zakresu 0 - 4 Gy, z próbki pełnej krwi wyizolowano limfocyty. Limfocyty i mitotyczne komórki CHO wymieszano w medium hodowlanym z dodatkiem kolcemidu i odwirowano. Do osuszonej pelety wstrzyknięto roztwór glikolu polietylenowego, a następnie rozpuszczono w ok. 2 ml PBS i ponownie odwirowano. Komórki przeniesiono do kompletnego mediu hodowlanego i inkubowano przez ok. 1 h w 37o C.

3.4. Wybrany biomarker W teście PCC wykorzystanym biomarkerem oceny dawki pochłoniętej w niniejszej pracy była liczba nadmiarowych elementów (ang. excess fragments). 3.4.1. Definicje Prawidłowa liczba chromosomów u człowieka w komórce wynosi N = 46. W wyniku uszkodzeń DNA w komórkach mogą pojawić się fragmenty acentryczne. W takim wypadku liczba widocznych na zdjęciu elementów będzie wynosiła N = 46 + n, z czego wynika, że liczba nadmiarowych elementów w tej metafazie będzie wynosiła: n = N − 46

(3.2)

32

Rozdział 3. Materiały i metody

Do opracowania statystycznego wykorzystano dwa rodzaje biomarkerów: nPCC – suma liczby nadmiarowych elementów n w 100 analizowanych komórkach, liczba naturalna, biomarker zastosowany w celu ustalenia zależności dawka – skutek metody PCC-chem; nP CCr = nP CCi − nP CC0

(3.3)

gdzie: nPCCr to wskaźnik radiowrażliwości na bazie nPCC, a nPCC0 to wartość nPCC dla dawki 0 Gy. PCC500 CHO – procent fuzji komórek CHO i limfocytów człowieka, w których materiał genetyczny limfocytu znajduje się w fazie G1 , czyli potencjalnie nadającej się o analizy, przy czym liczba przeanalizowanych komórek to 500, zastosowana w przypadku metody PCC-CHO. 500 P CCCHO =

LMG1 · 100%, 500

(3.4)

gdzie wielkość LMG1 oznacza liczbę metafaz będących fuzją mitotycznej komórki chomika chińskiego i limfocytu człowieka, w których DNA człowieka znajduje się w fazie G1 , czyli ilość potencjalnie nadających się do analizy dawki metafaz. Natomiast 500 to liczba przeanalizowanych komórek. Dodatkowo metafazy otrzymane za pomocą metody PCC-chem zostały podzielone na trzy kategorie ze względu na ilość nadmiarowych elementów (stopień uszkodzenia DNA). 3.4.2. Opis systemu zbierania i analizy obrazów Do zbierania i analizy zdjęć wykorzystano system aplikacji niemieckiej firmy MetaSystems GmbH. Do wyszukiwania metafaz i wykonywania zdjęć służył program Metafer 4, natomiast analizę obrazów zrealizowano w programie Ikaros. Raporty z analizy wygenerowano przy pomocy aplikacji MetaClient. W związku z kontrowersjami związanymi z publikacją zdjęć edytowanych elektronicznie oraz wyników uzyskanych na ich podstawie [29, 30], dokładny opis procedury uzyskiwania zdjęć do obliczeń został zamieszczony w aneksie B. Wszystkie zdjęcia metafaz uzyskane w trakcie realizacji niniejszej pracy były edytowane zgodnie z ww. procedurą. W metodzie PCC-chem do analizy statystycznej zakwalifikowano komórki w fazach G2 i M o liczbie zliczonych chromosomów: 45,

traktowane jako komórki prawidłowe o liczbie elementów 46, n = 0,

46,

metafazy o liczbie fragmentów właściwej dla prawidłowych komórek, n = 0,

N > 46, metafazy zawierające elementy nadmiarowe, n > 0. W metodzie PCC-CHO przede wszystkim należało ocenić wydajność stosowanej procedury do indukcji fuzji, które następnie mogłyby służyć do oceny dawki. Analiza preparatów polegała na wybraniu pierwszych 500 odróżnialnych komórek. Następnie wśród

Rozdział 3. Materiały i metody

33

nich identyfikowano fuzje limfocytów z komórkami CHO, które spowodowały zainicjowanie kondensacji chromatyny w jądrach limfocytów człowieka. Do analizy zakwalifikowano te fuzje, które zawierały komórki człowieka w fazie G1 i na tej podstawie obliczono indeks 500 (patrz: równanie 3.4). P CCCHO

3.5. Opracowanie statystyczne W przypadku PCC-chem dążono do otrzymania krzywych obrazujących zależność pomiędzy dawką otrzymaną przez materiał biologiczny a jego odpowiedzią komórkową w formie ilości fragmentów nPCC.W związku z tym, dla każdego pacjenta (1, 2, 5) analiza danych przebiegała następująco: 1. dla każdego rodzaju promieniowania(X, p) i każdej dawki (0; 0,3; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4 Gy) wybrano 100 pierwszych zdjęć metafaz w fazie G2 /M, w których liczba zliczonych elementów wyniosła min. 45, 2. w przypadku wszystkich metafaz o liczbie policzonych elementów równej 45, potraktowano je jako prawidłowe komórki o 46 chromosomach, w których jeden z elementów nie został zliczony najprawdopodobniej ze względu na wzajemne ułożenie chromosomów, czyli N = 46, 3. dla każdego zdjęcia od liczby zliczonych elementów N odjęto liczbę elementów w prawidłowej metafazie i otrzymano liczbę nadmiarowych elementów na zdjęciu (n). Sumując liczbę n dla każdego eksperymentu (w zależności od dawcy, rodzaju promieniowania i dawki) otrzymano wartości nPCC, czyli liczbę nadmiarowych elementów w eksperymencie. 4. Sprawdzono otrzymane wyniki pod kątem obecności błędów grubych. 5. Aby uzyskać informacje o indywidualnej podatności dawcy na promieniowanie (radiowrażliwość), od wartości nPCC dla każdego punktu pomiarowego odjęto ilość nadmiarowych elementów dla dawki 0 Gy odpowiadającego dawcy i otrzymano nPCCr . 6. Wartości nPCCr po usunięciu błędów grubych zostały wykorzystane do wykonania krzywych dawka - skutek, do wartości eksperymentalnych dopasowano wielomiany drugiego stopnia. 7. Następnie, wydzielono trzy kategorie komórek: komórki nieuszkodzone (n = 0), komórki uszkodzone w niewielkim stopniu (n ∈< 1, 3 >) oraz komórki silnie uszkodzone (n > 4), każdą ze zliczonych metafaz przyporządkowano do jednej z ww. kategorii oraz dla każdego dawcy i rodzaju promieniowania sporządzono wykres obrazujący zmianę liczebności wspomnianych kategorii w zależności od dawki. Natomiast procedura otrzymywania preparatów za pomocą metody PCC-CHO, w przeciwieństwie do PCC-chem, w czasie pisania tej pracy była dopiero wprowadzana do laboratorium, a więc przede wszystkim należało ocenić jakość otrzymywanych preparatów. 500 . Do analizy zostały zaliczone jedynie komórki W tym celu zastosowano indeks P CCCHO

w całości widoczne na zdjęciach. Analiza stopnia fuzji w PCC-CHO została wykonana jedynie dla wybranych dawek

34

Rozdział 3. Materiały i metody

promieniowania protonowego. W niniejszej pracy analizowane były dawki 0, 2 oraz 4 Gy (kody dawek 1, 7 i 10). 3.5.1. Niepewności pomiarowe Analizowaną informacją pozyskiwaną z pojedynczego zdjęcia PCC-chem była liczba nadmiarowych elementów n. Jest to zmienna dyskretna, której rozkład jest charakteryzowany przez rozkład Poissona, z czego wynika, że: σ(n) =

√

(3.5)

n

Niepewność pomiarowa nPCC jest niepewnością złożoną. Ogólny wzór na niepewność złożoną przedstawia się następująco: v u∑ [ ]2 u ∂y t σ(xk ) , σ(y) = ∂xk

(3.6)

k

który w bieżącym przypadku przyjmuje formę: v u 100 [ ]2 u∑ ∂nP CC t σ(nP CC) = σ(ni ) . ∂ni

(3.7)

i=1

Z równania na nPCC: nP CC =

100 ∑

ni

(3.8)

i=1

wynika, że: ∂nP CC = 1, ∂ni

(3.9)

a to oraz σ(ni ) prowadzi do ostatecznej postaci wzoru na niepewność pomiarową nPCC: v u 100 u∑ σ(nP CC) = t ni (3.10) i=1

Niepewność pomiarową nPCCr obliczono ze wzoru 3.6 na niepewność złożoną, który w tym przypadku przybiera postać: σ(nP CCr ) =

√ σ 2 (nP CCi ) + σ 2 (nP CC0 )

(3.11)

3.5.2. Zastosowane oprogramowanie Obliczenia wartości biomarkerów nPCC dla poszczególnych dawców, dawek i rodzajów promieniowania oraz ich niepewności, liczebności kategorii dla histogramów oraz warto500 wykonano w programie LibreOffice Calc 5.0.5.2 (x64). Wszystkie ści indeksów P CCCHO

wykresy, a także dopasowania modeli dla wykresów nPCC(D) oraz ilości komórek nieuszkodzonych od dawki sporządzone zostały w programie SciDAVis 1.D013.

4. Rezultaty W ramach niniejszej pracy przeprowadzono dwa rodzaje eksperymentów: PCC indukowana chemicznie (PCC-chem) i PCC wywoływana przez fuzję z komórkami CHO (PCC-CHO). Preparaty uzyskane z tych eksperymentów analizowano w różny sposób ze względu na ich odmienne założenia.

4.1. Analiza rezultatów pod kątem poprawności statystycznej Na rysunku 4.1 przedstawiono przykładowe metafazy w fazie G2 /M uzyskane za pomocą metody PCC-chem.

(a)

(b)

(c)

(d)

Rysunek 4.1: Przykłady metafaz w fazie G2 /M uzyskanych metodą PCC-chem.

Na rysunkach 4.2a i 4.2b zebrano indeksy nPCC uzyskane od wszystkich dawców dla poszczególnych rodzajów promieniowania. Dla promieniowania protonowego zaobser-

36

Rozdział 4. Rezultaty

wowano dużą zmienność wyników pomiędzy dawcami, jednakże żaden z nich nie odbiega znacząco od pozostałych. Do danych dopasowano wstępną linię trendu o przebiegu: nP CC = (48, 8 ± 3, 3) + (53, 6 ± 4, 5) · D + (−8, 3 ± 1, 2) · D2

(4.1)

W przypadku promieniowania X sytuacja przedstawia się inaczej. Większość punktów układa się w wyraźną linię trendu, lecz dwa z nich są znacząco od reszty odseparowane.

(a) Wykres zależności nPCC(D) dla danych uzy-

(b) Wykres zależności nPCC(D) dla danych uzy-

skanych bezpośrednio dla promieniowania X.

skanych bezpośrednio dla promieniowania pro-

Model pierwotny uwzględnia wszystkie punkty

tonowego.

pomiarowe (linia przerywana). Model poprawiony został dopasowany z pominięciem punktów nie spełniających założeń testu 3σ (linia ciągła).

Rysunek 4.2: Graficzne przedstawienie pierwotnych danych (tzn. otrzymanych bezpośrednio z pomiarów, przed standaryzacją), uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla wszystkich dawców z podziałem na rodzaje promieniowania.

Aby ustalić, czy należy zakwalifikować je jako błędy grube, skorzystano z reguły trzech σ, która mówi, że jeśli zmienna ma rozkład normalny lub zbliżony do normalnego to 99, 7% obserwacji znajduje się w zakresie ±3σ od średniej. Co prawda liczba zliczeń charakteryzuje się rozkładem Poissona, lecz wraz ze wzrostem ilości zdarzeń dąży on do rozkładu normalnego. W celu zastosowania ww. reguły, wyznaczono ze wszystkich punktów wstępną linię trendu w postaci wielomianu drugiego stopnia: nP CC = (27, 9 ± 2, 8) + (30, 0 ± 4, 1) · D + (−0, 5 ± 1, 2) · D2

(4.2)

oraz obliczono wartości funkcji w punktach,w których wartości eksperymentalne znacząco odbiegają od przebiegu ww. funkcji, czyli dla dawek 1,5 Gy i 4 Gy. Dla każdej badanej dawki obliczono odchylenie standardowe wyników i wyliczono z nich średnią, którą uznano za σ. Następnie od wartości funkcji nPCC(D) w punktach 1,5 Gy i 4 Gy obliczono wartości przedziałów ±σ oraz porównano je z wartościami eksperymentalnymi. Punkty pomiarowe dla dawcy 2 i ww. dawek (kody: 2X/6 i 2X/10) nie mieszczą się w omawianych zakresach, uznano je za błędy grube i nie uwzględniono ich w analizie wyników. Po usunięciu tych

37

Rozdział 4. Rezultaty

punktów ponownie przeliczono model kwadratowy dla wszystkich dawców, który przedstawia się następująco: nP CC = (33, 1 ± 2, 9) + (14, 3 ± 4, 5) · D + (4, 5 ± 1, 3) · D2

(4.3)

4.2. Dawca I (kod 1) 4.2.1. PCC-chem - promieniowanie X Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania X wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione w formie numerycznej w tabeli C.1. Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.3a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (7, 2 ± 5, 8) + (11, 7 ± 8, 8) · D + (4, 3 ± 2, 4) · D2

(4.4)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.7 i na rysunku 4.3b.

(a) Wykres zależności nPCCr (D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.3: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 1 i promieniowania X.

4.2.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania protonowego wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione w formie numerycznej w tabeli C.2.Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.4a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (14, 0 ± 6, 2) + (74, 8 ± 9, 3) · D + (−15, 2 ± 2, 4) · D2

(4.5)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.8 i na rysunku 4.4b.

38

Rozdział 4. Rezultaty

(a) Wykres zależności nPCCr (D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.4: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 1 i promieniowania protonowego.

4.3. Dawca II (kod 2)

4.3.1. PCC-chem - promieniowanie X Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania X wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione w formie numerycznej w tabeli C.3.Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.5a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (0, 3 ± 5, 5) + (36 ± 13) · D + (−0, 2 ± 4, 3) · D2

(4.6)

Na rysunku 4.5a pokazano również wyeliminowane punkty pomiarowe (dla dawek 1,5 i

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.5: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 2 i promieniowania X.

39

Rozdział 4. Rezultaty

4 Gy) oraz przebieg hipotetycznego modelu przy uwzględnieniu ww. punktów. Model ten jest opisany wzorem: nP CCr = (−10, 4 ± 5, 0) + (81, 1 ± 7, 9) · D + (−17, 2 ± 2, 0) · D2

(4.7)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.9 i na rysunku 4.5b. 4.3.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania protonowego wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione w formie numerycznej w tabeli C.4.Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.6a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (27, 7 ± 5, 7) + (52, 8 ± 8, 9) · D + (−6, 8 ± 2, 5) · D2

(4.8)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.10 i na rysunku 4.6b.

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.6: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 2 i promieniowania protonowego.

4.4. Dawca III (kod 5) 4.4.1. PCC-chem - promieniowanie X Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania X wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione

40

Rozdział 4. Rezultaty

w formie numerycznej w tabeli C.5.Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.6a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (12, 5 ± 5, 9) + (−1, 3 ± 8, 7) · D + (8, 4 ± 2, 4) · D2

(4.9)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.11 i na rysunku 4.7b.

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.7: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 5 i promieniowania X.

4.4.2. PCC-chem - promieniowanie protonowe Na podstawie zebranych danych obliczono wielkości nPCC dla użytych dawek promieniowania protonowego wraz z odpowiednimi niepewnościami. Wartości te zostały przedstawione w formie numerycznej w tabeli C.6.Następnie przeliczono je na wartości nPCCr zaprezentowane na rysunku 4.6a i dopasowano model liniowo-kwadratowy w postaci: nP CCr = (7, 5 ± 6, 0) + (36, 7 ± 9, 1) · D + (−3, 0 ± 2, 5) · D2

(4.10)

W kolejnym kroku, każdą z analizowanych metafaz przyporządkowano od odpowiedniej kategorii, zgodnie z wytycznymi opisanymi na początku tego rozdziału (rozdział 4). Liczebności utworzonych klas przedstawiono w tabeli C.12 i na rysunku 4.8b.

41

Rozdział 4. Rezultaty

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.8: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 5 i promieniowania protonowego.

4.5. Dane uśrednione W celu sprawdzenia odpowiedzi wszystkich badanych dawców otrzymane dane uśredniono. Na rysunku 4.9a przedstawiono zależność nPCCr (D), a na rysunku 4.9b procentowe zależności pomiędzy liczebnościami kategorii komórek w zależności od dawki dla promieniowania X. Na wykresach 4.10a i 4.10b pokazano analogiczne dane dla promieniowania protonowego.

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.9: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem - dane uśrednione dla promieniowania X.

Do danych uśrednionych dopasowano dwa rodzaje modeli: liniowy i liniowo-kwadratowy, a ich formuły wyglądają następująco: Promieniowanie X, model liniowy nP CCr = (−1, 3 ± 7, 4) + (30, 3 ± 4, 5) · D

(4.11)

42

Rozdział 4. Rezultaty

(a) Wykres zależności nPCC(D).

(b) Histogram liczebności kategorii metafaz w zależności od dawki promieniowania.

Rysunek 4.10: Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem - dane uśrednione dla promieniowania protonowego.

Promieniowanie X, model liniowo-kwadratowy nP CCr = (7, 7 ± 9, 6) + (11 ± 14) · D + (5, 5 ± 3, 7) · D2

(4.12)

Protony, model liniowy nP CCr = (31 ± 8, 5) + (25, 3 ± 4, 9) · D

(4.13)

Protony, model liniowo-kwadratowy nP CCr = (19 ± 10) + (57 ± 16) · D + (−8, 9 ± 4, 3) · D2

(4.14)

Dla każdego z powyższych modeli obliczono współczynnik determinacji R2 , wartość testu χ2 (który porównano z wartościami tablicowymi dla progu istotności α = 0, 05) oraz wartości zredukowanego χ2 , które zebrano w tabeli 4.1. Tabela 4.1: Wartości testów statystycznych dla modeli obliczonych na podstawie danych uśrednionych. Promieniowanie X p X p

Model liniowy liniowo-kwadratowy

R2

χ2

0.92

4.25

0.62

16.16

0.96

2.02

0.72

11.88

χ2tabl 14.07 12.59

χ2red 0.61 2.31 0.34 1.98

Dla obu rodzajów promieniowania model liniowo-kwadratowy charakteryzuje się wyższą (lepszą) wartością parametru R2 , różnice pojawiają się dopiero przy analizie wyników testu χ2 . Dla promieniowania X oba modele spełniają założenia testu dla α = 0, 05, ale wartość χ2red dla modelu liniowego jest bliższa 1, a więc to ten model powinien zostać wybrany do opisu danych. W przypadku promieniowania protonowego mamy do czynienia

43

Rozdział 4. Rezultaty

z inną sytuacją. Tutaj model liniowy nie spełnia założeń testu χ2 , a więc powinien zostać odrzucony. Dodatkowo, wartość χ2red dla modelu liniowo-kwadratowego jest korzystniejsza, co prowadzi do wyboru tego modelu jako preferowanego.

4.6. Porównanie działania promieniowania X i protonowego

4.6.1. Wartości nPCC W celu porównania wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla obu badanych rodzajów promieniowania, na wykresy widoczne na rysunku 4.11 naniesiono jednocześnie dane dla promieniowania X i protonów wraz z dopasowanymi do nich modelami. Pierwszą cechą, którą można zauważyć jest to, że dla niskich dawek (do ok. 3 Gy) niemal wszystkie punkty pomiarowe dla protonów mają wyższą wartość niż ich odpowiedniki dla promieniowania X. Tendencja ta zaczyna się odwracać w okolicy dawki 4 Gy. Ma to swoją konsekwencję w kształcie dopasowanych krzywych: dla promieniowania X krzywizny modeli są dodatnie (lub, jak w przypadku dawcy 2 w przybliżeniu równe zero), natomiast dla protonów są one ujemne. Drugą z cech różniących wyniki PCC-chem otrzymane dla obu rodzajów promieniowania jest rozrzut wyników uzyskanych dla takich samych dawek od różnych dawców. Średnie odchylenie standardowe wyników dla promieniowania X wynosi 9,9 fragmentu, a dla promieniowania protonowego 28,6 fragmentu, co znowu przekłada się na większą rozbieżność przebiegów dopasowanych modeli w przypadku protonów w porównaniu do promieniowania X. Sytuację tą obrazują rysunki 4.12a i 4.12b. Z kształtu krzywych dla promieniowania X można wnioskować, że osobnicze różnice radiowrażliwości w ogólnej populacji nie mają większego wpływu na wynik testu PCC-chem, a zróżnicowanie przebiegów modeli dla protonów wynika z charakteru promieniowania.

(a) Modele nPCCr dla danych uśrednionych.

(b) Porównanie histogramów liczebności komórek.

Rysunek 4.11: Porównanie danych i modeli nPCCr dla promieniowania X i protonowego.

44

Rozdział 4. Rezultaty

(a) Porównanie modelu otrzymanego na podsta-

(b) Porównanie modelu otrzymanego na podsta-

wie średnich wartości nPCCr oraz modeli po-

wie średnich wartości nPCCr oraz modeli po-

szczególnych dawców (1, 2 i 5) wraz z punktami

szczególnych dawców (1, 2 i 5) wraz z punktami

pomiarowymi dla promieniowania X.

pomiarowymi dla promieniowania protonowego.

Rysunek 4.12: Relacje pomiędzy uzyskanymi modelami a danymi pomiarowymi dla odpowiednich rodzajów promieniowania.

4.6.2. Liczebności komórek Interesujące są wyniki analizy liczebności komórek w zależności od stopnia ich uszkodzenia, a zwłaszcza ilości silnie uszkodzonych komórek. W przypadku promieniowania X ilość ww. komórek nie przekracza średnio 1% wszystkich komórek aż do dawki 1,5 Gy włącznie i dopiero od 2 Gy ich udział zaczyna gwałtownie rosnąć uzyskując poziom średnio 14,5% dla dawki 4 Gy. Odmiennie sprawa się ma z protonami - tutaj już przy dawce 0,3 Gy średnia liczebność silnie uszkodzonych komórek osiąga plateu na poziomie ok. 5-6% i dopiero przy dawce 3 Gy nieznacznie rośnie do 8% i osiąga 12% dla 4 Gy. Co interesujące, średnie odchylenia standardowe liczebności komórek pierwszych dwóch kategorii są porównywalne dla obu rodzajów promieniowania: dla promieniowania X wynoszą one 2,8%(5,6 komórki) dla komórek nieuszkodzonych i 4,3% (5,3 komórki) dla komórek lekko uszkodzonych, a dla protonów mają one wielkość odpowiednio 2,9% i 3,4% (5,4 i 4,2 komórki). Dopiero dla komórek silnie uszkodzonych różnica jest widoczna: 8,8% (1,0 komórka) dla promieniowania X versus 16,3% (3,3 komórki) dla protonów.

4.7. PCC w wyniku fuzji z komórkami CHO Po sporządzeniu preparatów zgodnie z metodologią PCC-CHO, oceniono wstępnie ich jakość pod mikroskopem optycznym. Pomimo obecności na szkiełkach znacznej ilości komórek, niewielka liczba metafaz klasyfikuje się do analizy, co skutkuje brakiem możliwości wykonania krzywych dawka - skutek. W związku z tym należało w mierzalny sposób ocenić jakość preparatów. Do tego celu wykorzystano indeks nPCC500 CHO , którego wartość, przy założeniu statystycznie równomiernego rozłożenia komórek na preparacie, informuje, jaki procent metafaz na szkiełku potencjalnie nadaje się do wykorzystania. Wartości ww.

45

Rozdział 4. Rezultaty

indeksu obliczono dla wszystkich dawców i trzech dawek: 0, 2 i 4 Gy. Uzyskane wartości zebrano w tabeli 4.2. Tabela 4.2: Wartości indeksu nPCC500 CHO otrzymane z analizowanych eksperymentów. Dawka [Gy]

nPCC500 CHO dawcy: 1

2

5

0

-*

3%

0,2%

2

0,2%

2%

0,4%

4 3,6% 0,6% 0,4% *brak danych, preparat nie nadawał się do analizy

Przykładowe zdjęcia uzyskanych metafaz za pomocą metody PCC-CHO umieszczono na rysunkach 4.13 i 4.14. Zostały one otrzymane przez fuzję z mitotycznymi komórkami CHO. Na zdjęciach 4.13 i 4.14b materiał genetyczny człowieka znajduje się w fazie G1 , co można poznać po obecności wydłużonych pojedynczych chromatyd, a na zdjęciu 4.14b jest on w fazie S – chromatyna człowieka jest rozdrobniona i nie można rozróżnić chromosomów. Jak można zauważyć, metafazy te są dobrej jakości.

(a)

(b)

Rysunek 4.13: Przykłady metafaz w fazie G1 uzyskanych metodą PCC-CHO.

46

Rozdział 4. Rezultaty

(a)

(b)

Rysunek 4.14: Przykłady metafaz w fazie S (a) i G1 (b) uzyskanych metodą PCC-CHO.

4.8. Doświadczenia z analizy obrazów W trakcie wykonywania pracy magisterskiej za pomocą programów pakietu MetaSystems przeskanowano kilkadziesiąt preparatów oraz przeanalizowano kilka tysięcy zdjęć. To doświadczenie pozwoliło na opracowanie jednolitej instrukcji analizy obrazów za pomocą ww. pakietu programów do stosowania w laboratorium. Instrukcja została załączona do niniejszej pracy w formie aneksu B.

5. Dyskusja wyników 5.1. Obserwacje wstępne W trakcie realizacji niniejszej pracy udało się osiągnąć zaplanowane cele. Analiza wyników uzyskanych z preparatów PCC-chem pozwoliła na wykreślenie krzywych dawka–skutek dla obu rodzajów promieniowania. Dodatkowo otrzymano informacje o tym, jak zmienia się ilość komórek przyporządkowanych do określonych kategorii na podstawie liczby fragmentów nadmiarowych w komórce tak dla promieniowania X, jak i protonowego. Co prawda, przy analizie preparatów PCC-CHO nie udało się uzyskać wystarczającej ilości zdjęć, aby wykreślić uproszczone krzywe dawka–skutek dla protonów, lecz ilość i jakość (zwłaszcza możliwość rozróżnienia elementów) obecnych metafaz limfocytów człowieka pozwala na przypuszczenie, iż możliwa jest optymalizacja ww. metody do zastosowania z promieniowaniem protonowym. W trakcie wykonywania pracy opracowano także procedurę wykorzystania systemu MetaSystems do jednolitej analizy zdjęć komórek w laboratorium do zastosowania dla metody PCC. Procedura ta została dołączona do niniejszej pracy w formie aneksu B.

5.2. PCC-chem 5.2.1. nPCC(D) W trakcie wykonywania niniejszej pracy magisterskiej z testu PCC-chem uzyskano sześć zestawów danych pozwalających na wykonanie krzywych dawka - skutek do których dopasowano modele liniowo-kwadratowe. Dla danych uśrednionych dodatkowo obliczono modele liniowe. W literaturze najczęściej spotyka się dopasowania dla testu PCC przede wszystkim w formie prostych regresji liniowej jak np. u Sullivana i in. [31], a niekiedy w formie krzywych kwadratowych, np. u Zafiropoulos i in. [32] oraz George’a i in. [33]. Jest to zależne m.in. od liczby punktów pomiarowych wpływających na statystykę, typu mierzonych uszkodzeń (czy jest to liczba nadmiarowych fragmentów, wymian, chromosomów kolistych, etc.), czy rodzaju stosowanego promieniowania. Dla danych uśrednionych dla promieniowania X, spośród przedstawionych dopasowań, lepszym ze statystycznego punktu widzenia jest model liniowy, pomimo dokładniejszego dopasowania modelu liniowo-kwadratowego, ze względu na korzystniejszą wartość zredukowanego testu χ2 wynikającą z mniejszej ilości parametrów omawianego modelu. Rezultaty uzyskane w niniejszej pracy magisterskiej potwierdzają dane opublikowane przez Balakrishnana et al., który korzystając z metody PCC-chem otrzymał zależność liniową dla promieniowania γ w zakresie dawek 0-25 Gy oraz biomarkerów liczby ringów, nadmiarowych fragmentów oraz dicentryków [34] oraz Panteliasa i Terzoudi, którzy stosowali PCC-CHO

48

Rozdział 5. Dyskusja wyników

i promieniowanie γ, a jako biomarker przyjęli liczbę nadmiarowych fragmentów z modelem liniowym do studiów nad mechanizmami powstawania aberracji chromosomowych [16]. Inaczej jednak ma się sytuacja w przypadku promieniowania protonowego. Tutaj otrzymany model liniowy nie spełnia założeń testu χ2 dla wybranego poziomu istotności ( α = 0, 05 ), w przeciwieństwie do modelu liniowo-kwadratowego. Ponadto wynik zredukowanego testu χ2 dla modelu liniowo-kwadratowego odnoszącego się do tego zestawu danych jest lepszy niż dla regresji liniowej. Wynika z tego, że dla ww. przypadku model liniowo-kwadratowy lepiej opisuje zależność pomiędzy liczbą nadmiarowych elementów a dawką. Najbardziej prawdopodobne są dwa źródła zaistniałej sytuacji: 1. modyfikacja kształtu dopasowania krzywej jest spowodowana śmiercią części uszkodzonych komórek, co prowadzi do zaniżenia odpowiedzi dla wysokich dawek (efekt wysycenia krzywej) [5], i/lub 2. w przypadku promieniowania protonowego dominują inne mechanizmy naprawy DNA niż dla promieniowania X, na co mogą wskazywać już opublikowane wyniki testu CBMN dawców 1-4 uzyskane w ramach projektu przez dr Miszczyk i in. [35]. Na podstawie wykonanego przeglądu literaturowego stwierdzono niewielką ilość doniesień w zakresie wykorzystania PCC do promieniowania protonowego. Matsubara i in. porównywał efekty stosowania promieniowania γ i protonów, jednak przy użyciu DCA [36], a George i in. używał PCC w połączeniu z FISH do studiowania wymian generowanych przez promieniowanie o wysokim LET (jądra tlenu, krzemu, żelaza, neonu i tytanu) [33]. 5.2.2. Liczebności kategorii komórek W trakcie przeprowadzania przeglądu literaturowego nie znaleziono publikacji odnoszących się do częstości występowania komórek o różnym stopniu uszkodzeń mierzonych liczbą nadmiarowych fragmentów w komórce przy wykorzystaniu testu PCC. Podczas analizy otrzymanych danych, każdą z metafaz przyporządkowano do jednej z trzech kategorii: komórek nieuszkodzonych (45 lub 46 fragmentów chromosomów na zdjęciu), komórek lekko uszkodzonych (pomiędzy 47 a 49 fragmentów) i komórek silnie uszkodzonych (min. 50 fragmentów na zdjęciu). Dzięki temu zauważono ważne tendencje w odpowiedzi komórek na protony w porównaniu do promieniowania X. Po pierwsze, dla bardzo niskich dawek udział silnie uszkodzonych komórek w ogólnej populacji jest znacząco wyższy dla protonów niż dla promieniowania X. Świadczy to o większej zdolności do generowania uszkodzeń DNA w pojedynczej komórce przez protony niż przez promieniowanie X i może być źródłem dużych wartości indeksu nPCCr dla niskich dawek promieniowania protonowego, a także dużych rozbieżności pomiędzy wynikami dla różnych dawców przy takiej samej dawace promieniowania. Dodatkowo, podwyższony udział komórek nieuszkodzonych i zmniejszony komórek silnie uszkodzonych dla wysokich dawek protonów w porównaniu do promieniowania X może wskazywać na śmierć części uszkodzonych komórek w trakcie hodowli, a co za tym idzie wysycenia krzywej modelu zależności nPCCr (D) [5].

Rozdział 5. Dyskusja wyników

49

5.3. PCC-CHO Metoda PCC-CHO jest aktualnie wykorzystywana w badaniach niemal tylko dla promieniowania X i γ. W trakcie badań literaturowych nie znaleziono artykułów odnoszących się do tej metody i promieniowania o wysokim LET. Opracowanie protokołu dla omawianej metody do użycia do szacowania dawki protonów należało do celów projektu, w ramach którego niniejsza praca została wykonana. W ramach ww. projektu 08.07.2016 r. odbył się warsztat ”International Workshop on Mechanisms of Cellular Injury by Protons”, w ramach którego do IFJ PAN przyjechał prof. Gabriel Pantelias i przeszkolił członków grupy badawczej Zakładu Fizyki Doświadczalnej Układów Złożonych IFJ PAN z wykonywania tej metody. Pomimo tego, w ramach niniejszej pracy magisterskiej nie udało się otrzymać wyników pozwalających na wykreślenie krzywych dawka – skutek. W przypadku zrealizowanych eksperymentów przeprowadzonych z użyciem metody PCC-CHO, w pierwszym rzędzie należy dokładnie przestudiować procedury, których wynikiem jest brak odpowiedniej ilości komórek, dla których zaszła fuzja i zidentyfikować źródło błędu. Po drugie, w związku z tym, że na żadnym z badanych szkiełek liczba potencjalnie nadających się do analizy metafaz nie przekroczyła 4%, trzeba dążyć do zwiększenia ilości fuzji CHO – limfocyt w stosunku do ilości pojedynczych komórek. Logicznym kierunkiem postępowania w tej sytuacji wydaje się dostosowanie stosunku ilości komórek CHO do limfocytów w trakcie fuzji, np. Mosesso i in. mieszał ww. komórki w stosunku 1:3 [37], a Terzoudi i in. używała stosunku 1:5[38]. Ravi i in. wymienia też inne czynniki mające wpływ na jakość preparatów, jak np. długość inkubacji w trakcie utrwalania komórek, czy wysokość, z którek roztwór komórek jest nakrapiany na szkiełko[39]. Trudności z uzyskaniem odpowiedniej wydajności metody PCC-CHO nie są zaskoczeniem, gdyż jest ona uznana za skomplikowaną technicznie i mało stabilną pod względem wydajności otrzymywania fuzji [28].

6. Podsumowanie PCC jest metodą cytogenetyczną stosowaną m.in. w dozymetrii biologicznej. W ramach niniejszej pracy przeanalizowano preparaty przygotowane za pomocą dwóch wersji metody PCC (PCC-chem i PCC-CHO) z wykorzystaniem dwóch rodzajów promieniowania jonizującego (promieniowania X i protonowego) i materiału biologicznego (limfocytów krwi obwodowej) pobranego od trzech dawców. Wyniki otrzymane dzięki metodzie PCC-chem pozwoliły na wykreślenie zależności dawka – skutek dla każdego z dawców i obu rodzajów promieniowania (z 10 punktów pomiarowych dla wszystkich dawców w przypadku protonów oraz dla dwóch dawców (1 i 5) w przypadku promieniowania X, a także z 8 punktów pomiarowych dla dawcy 2 i promieniowania X). Dla wyników uśrednionych określono typ modelu, według którego można opisywać zależność nPCCr od dawki w analizowanym zakresie dawek dla różnych rodzajów promieniowania. Dla promieniowania X jest to model liniowy, co zgadza się z dostępną literaturą, a dla promieniowania protonowego to model liniowo-kwadratowy. Zaobserwowano również różnice w oddziaływaniu obydwu rodzajów promieniowania na zebrany materiał biologiczny. Zebrane dane potwierdzają teorię, iż promieniowanie protonowe jest bardziej niszczące dla komórek niż promieniowanie X. Większość próbek sporządzonych z użyciem metody PCC-CHO była czytelna (można było rozpoznać komórki, fazę cyklu komórkowego i poszczególne chromosomy). Na szkiełkach znaleziono metafazy limfocytów człowieka w fazie G1 , lecz ich liczba była zbyt niska, aby pozwolić na szacowanie odpowiedzi komórkowej w relacji do zastosowanej dawki. Podsumowując, na przyszłość zaleca się dalszą pracę nad zoptymalizowaniem metody preparatyki w celu uzyskania wyższej liczby metafaz limfocytów człowieka.

Bibliografia 1. UNSCEAR. UNSCEAR Report 2008: Sources and Effects of Ionizing Radiation. Annex A: Medical Radiation Exposures isbn: 978-92-1-142274-0 (United Nations, New York, 2010). 2. UNSCEAR. UNSCEAR Report 2008: Sources and Effects of Ionizing Radiation. Annex B: Exposures of the Public and Workers from Various Sources of Radiation isbn: 978-92-1-142274-0 (United Nations, New York, 2010). 3. Miszczyk, J. w Zagadnienia aktualnie poruszane przez młodych naukowców 8 (CREATIVETIME, Kraków, 2016). isbn: 978-83-63058-62-3. 4. Patel, S. i in. Recommendations for the referral of patients for proton-beam therapy, an Alberta Health Services report: a model for Canada? Current Oncology 21, 251–262 (2014). 5. IAEA. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies (International Atomic Energy Agecy, Vienna, 2011). 6. IAEA. Nuclear Medicine Physics: A Handbook for Teachers and Students (red. Bailey, D. L., Humm, J. L., Todd-Pokropek, A. & van Aswegen, A.) 736 s. isbn: 9201438109 (International Atomic Energy Agency, Vienna, 10 mar. 2015). 7. IAEA. Radiation Oncology Physics: A Handbook for Teachers and Students (red. Podgorsak, E. B.) isbn: 92-0-107304-6 (International Atomic Energy Agency, Vienna, 2005). 8. IAEA. Diagnostic Radiology Physics (red. Christofides, S., Dance, D. R., Maidment, A. D. A., McLean, I. D. & Ng, K.-H.) 1 s. isbn: 978-92-0-131010-1 (International Atomic Energy Agency, Vienna, 4 list. 2014). 9. Dziunikowski, B. & Kalita, S. J. Ćwiczenia laboratoryjne z jądrowych metod pomiarowych (Wydawnictwa AGH, Kraków, 1995). 10.

Fokas, E., Kraft, G., An, H. & Engenhart-Cabillic, R. Ion beam radiobiology and cancer: Time to update ourselves. Biochimica et Biophysica Acta 1796, 216–229 (2009).

11.

Tavernier, S. w Experimental Techniques in Nuclear and Particle Physics 23–53 (Springer, 26 lut. 2010). isbn: 978-3-642-00828-3.

12.

IAEA. Practical Radiation Technical Manual: Health Effects and Medical Surveillance International Atomic Energy Agency (Vienna, 2004).

13.

NPL. Industrial/chemical applications of ionising radiation Data dostępu: 26.07.2017. National Physical Laboratory. http : / / www . npl . co . uk / science - technology / radiation-dosimetry/sectors/industrial-chemical-applications-of-ionisingradiation.

14.

CNSTI. Data dostępu: 26.07.2017. Center for Nuclear Science i Technology Information. http://www.nuclearconnect.org/know-nuclear/applications.

BIBLIOGRAFIA

15.

52

Stępień, A., Izdebska, M. & Grzanka, A. Rodzaje śmierci komórki. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 61, 420–428 (2007).

16.

Pantelias, G. E. & Terzoudi, G. I. Functional cell-cycle chromatin conformation changes in the presence of DNA damage result into chromatoid breaks: A new insight in the formation of radiation-induced chromosomal aberrations based on the direct observation of interphase chromatin. Mutation Research 701, 27–37 (kw. 2010).

17.

Terzoudi, G. I., Hatzi, V. I., Donta-Bakoyianni, C. & Pantelias, G. E. Chromatin dynamics during cell cycle mediate conversion of DNA damage into chromatid breaks and affect formation of chromosomal aberrations: Biological and clinical significance. Mutation Research 711, 174–186 (2011).

18.

Boundless. Regulation of the Cell Cycle at Internal Checkpoints Retrieved 26072017. Boundless Biology Boundless. https://www.boundless.com/biology/textbooks/ boundless-biology-textbook/cell-reproduction-10/control-of-the-cellcycle- 89/regulation- of- the- cell- cycle- at- internal- checkpoints- 39811625/.

19.

Terzoudi, G. L. & Pantelias, G. E. Conversion of DNA damage into chromosome damage in response to cell cycle regulation of chromatin condensation after irradiation. Mutagenesis 12, 271–276 (1997).

20.

Gostkowska, B. Ochrona radiologiczna. Wielkości, jednostki i obliczenia. Poradnik dla inspektorów ochrony radiologicznej. (Centralne Laboratorium Ochrony Radiologicznej, Warszawa, 2011).

21.

IAEA. Diagnosis and Treatment of Radiation Injuries (Safety Report, Iaea Comprehensive No Inis Ser. Series, 8000) isbn: 92-0-100498-2 (International Atomic Energy Agency, Vienna, 1998).

22.

Blakely, W. F. w Medical Consequences of Radiological and Nuclear Weapons (red. Mickelson, A. B.) 101–126 (Office of The Surgeon General United States Army i Borden Institute, Falls Church, Virginia; Fort Detrick, Maryland, 2012).

23.

Ravi, M., Nivedita, K. & Pai, G. M. Chromatin condensation dynamics and implications of induced premature chromosome condensation. Biochimie 95, 124–133 (2013).

24.

Hatzi, V. I. i in. The Use of Premature Chromosome Condensation to Study the Influence of Environmental Factors on Human Genetic Material in Interphase Cells. The Scientific World Journal 6, 1174–1190. issn: 1537-744X (2006).

25.

Miura, T. i in. A novel parameter, cell-cycle progression index, for radiation dose absorbed estimation in the premature chromosome condensation assay. Radiation Protection Dosimetry 159. doi:10.1093/rpd/ncu126 (kw. 2014).

26.

Możdżeń, I. Porównanie odpowiedzi limfocytów dla różnych biomarkerów w testach PCC i MN w odpowiedzi na promieniowanie X (250 keV) i 60 MeV protony prac. mag. (Uniwersytet Jagielloński, Kraków, 2016).

27.

Rawojć, K. Opracowanie i optymalizacja testu mikrojądrowego prac. mag. (Uniwersytet Jagielloński w Krakowie, Kraków, 2013).

BIBLIOGRAFIA

28.

53

Hosseini, S. & Mozdarani, H. Induction of Premature Chromosome Condensation (PCC) by Calyculin A for biodosimetry. Iranian Journal of Radiation Research 2, 1–6 (2004).

29.

Nature. Not picture-perfect. Nature 439, 891–892 (2006).

30.

Rossner, M. & Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology 166, 11–15 (2004).

31.

Sullivan, J. M. i in. Assessment of Biodosimetry Methods for a Mass-Casualty Radiological Incident: Medical Response and Management Considerations. Health Phys. doi:10.1097/HP.0b013e31829cf221 (2013).

32.

Zafiropoulos, D., Facco, E. & Sarchiapone, L. Biological dosimetry of ionizing radiation: Evaluation of the dose with cytogenetic methodologies by the construction of calibration curves. International Journal of Modern Physics: Conference Series 44. doi:10.1142/s2010194516602398 (wrz. 2016).

33.

George, K. A., Hada, M., Chappell, L. & Cucinottac, F. A. Biological Effectiveness of Accelerated Particles for the Induction of Chromosome Damage: Track Structure Effects. Radiation Research 180, 25–33 (2013).

34.

Balakrishnan, S., Shirsath, K., Bhat, N. & Anjaria, K. Biodosimetry for high dose accidental exposures by drug induced premature chromosome condensation (PCC) assay. Mutation Research 699, 11–16 (2010).

35.

Miszczyk, J. i in. Response of human lymphocytes to proton radiation of 60 MeV compared to 250 kV X-rays by the cytokinesis-block micronucleus assay. Radiotherapy and Oncology 115, 128–134 (2015).

36.

Matsubara, S. i in. Chromosome Aberration Frequencies Produced by a 70-MeV Proton Beam. Radiation Research 123, 182–191 (1990).

37.

Mosesso, P. i in. Relationship between chromatin structure, DNA damage and repair following X-irradiation of human lymphocytes. Mutation Research 701, 86–91 (2010).

38.

Terzoudi, G. I., Singh, S. K., Pantelias, G. E. & Iliakis, G. Premature chromosome condensation reveals DNA-PK independent pathways of chromosome break repair. International Journal of Oncology 33, 871–879 (2008).

39.

Ravi, M. i in. Optimizing Premature Chromosome Condensation (PCC) of Human Lymphocytes by Somatic Cell Hybridization to Study Primary DNA Damages. International Journal of Human Genetics 7, 319–323 (2007).

40.

Burkat, A. Opracowanie i optymalizacja metody PCC indukowanej chemicznie dla potrzeb stosowania na stanowisku radioterapii protonowej Centrum Cyklotronowego Bronowice prac. mag. (Akademia Gurniczo-Hutnicza im. St. Staszica w Krakowie, Kraków, 2015).

A. Zastosowane procedury biologiczne Procedura zakładania i utrwalania hodowli komórkowej dla potrzeb testu PCC-chem [40]: — zakładanie hodowli Po naświetleniu naświetlany lub nienaświetlany materiał biologiczny dodać do naczynia hodowlanego z pożywką (4,5 ml pożywki na 0,5 ml materiału biologicznego), a następnie inkubować w temperaturze 37o C przez 24 h. Po 24 h dodać 20 µl kolcemidu (Gibco), ponownie inkubować przez 22 h (opcjonalnie w zależności od wykonanej modyfikacji), 30 min przed zakończeniem hodowli dodać do każdej próbki 25 µl kalikuliny A (A Sigma - Aldrich, St. Louis, United States). — utrwalanie komórek – metoda wg Mozdaraniego [28]: 1. Przelać próbkę z butelki hodowlanej do 15 ml probówki typu Falcon. 2. Odwirować próbkę (1000 rpm, 5 min, 20o C). 3. Odsączyć supernatant, dodać 8 ml 75 mM roztworu KCl. 4. Inkubować w temperaturze 37o C przez 20 min. 5. Po 20 min inkubacji, dodać 5 ml utrwalacza Carnoya w temperaturze pokojowej. 6. Próbkę inkubować 10 min w temperaturze pokojowej. 7. Odwirować próbkę (1000 rpm, 5 min, 20o C). 8. Odciągnąć nadsącz do 1,5 ml. 9. Dodać 5 ml utrwalacza Carnoya w temperaturze pokojowej. 10. Odwirować próbkę (1000 rpm, 5 min, 20o C). 11. Proces utrwalania powtórzyć dwukrotnie (kroki 6 - 9). . Procedura izolowania limfocytów na potrzeby testu PCC-CHO: . Limfocyty człowieka wyizolować z próbek krwi obwodowej zawierających heparynę według lekko zmodyfikowanej metody histopaque z wykorzystaniem roztworu rozdzielającego, podążając za wytycznymi producenta (Sigma-Aldrich). Przed wirowaniem, warstwę pełnej krwi ułożyć w probówce na warstwie takiej samej ilości roztworu rozdzielającego. Wyizolowane limfocyty przenieść do medium hodowlanego (RPMI-1640) uzupełnionego o 10% FSB, 1% glutaminy i antybiotyki. . . Procedura fuzji limfocytów człowieka i komórek CHO: . Fuzja komórek jest osiągana za pomocą glikolu polietylenowego (PEG) jako czynnika indukującego fuzję. Mitotyczne komórki CHO zebrane z 75 cm2 naczynia hodowlanego można wykorzystać do 2-3 fuzji.

Dodatek A. Zastosowane procedury biologiczne

55

Limfocyty i mitotyczne komórki wymieszać w medium RPMI-1640, w braku obecności serum i z dodatkiem kolcemidu, w 15 ml okrągłodennych probówkach hodowlanych. Po odwirowaniu przy 1000 rpm przez 6 min, odlać supernatant bez uszkodzenia pelety komórek, trzymając probówki zawsze odwrócone na stojaku nad ręcznikiem papierowym w celu osuszenia pelety z nadmiaru cieczy. Trzymając probówkę w odwróconej pozycji do pelety wstrzyknąć mikropipetą 0,15 ml 50% r-ru glikolu polietylenowego(PEG 1500, Boehringer Mannheim) lub 45% r-ru PEG (p5402, Sigma–Aldrich). Natychmiast po tym probówkę odwrócić do właściwej pozycji i trzymano przez ok. 1 min. Następnie powoli dodać 1,5-2 ml PBS, delikatnie potrząsnąć probówką, a zawiesinę komórek odwirować przy 1000 rpm przez 6 min. Odlać supernatant, a peletę komórek delikatnie rozpuścić w 0,7 ml kompletnego medium hodowlanego RPMI-1640 z dodatkiem kolcemidu. W celu zoptymalizowania ilości fuzji przy niewielkiej ilości dostępnych limfocytów, użyć kompletnego medium hodowlanego dla limfocytów zawierającego PHA. Po 60-75 min. w 37o , fuzja komórek i wzbudzenie PCC jest zakończone, a komórki należy potraktować roztworem hipotonicznym KCl (0,075 M) i utrwalone r-rem metanolu i kwasu octowego lodowatego (3:1). . Procedura barwienia Giemsą [27]: 1. Zanurzyć preparaty w uzyskanym, przesączonym roztworze Giemsy na czas około 7 min. 2. Po upływie czasu, delikatnie wyciągnąć szkiełko podstawowe i sprawdzić gęstość preparatu pod mikroskopem. 3. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 12 godz.

B. Cyfrowa analiza zdjęć Procedura edycji zdjęć cyfrowych i zliczania widocznych fragmentów chromosomów w testach PCC-chem przy pomocy programu Ikaros firmy Metasystems GmbH. 1. Wyeksportować wybraną partię zdjęć z programu do skanowania preparatów i zbierania obrazów Metafer 4, w maksymalnej rozdzielczości i w formacie .mmi. 2. Otworzyć wybrane zdjęcie w programie Ikaros, upewnić się, że cały obszar zdjęcia jest widoczny w polu edycji obrazu programu. 3. Zdentyfikować fazę cyklu komórkowego, w której znajduje się komórka. Do dalszej analizy zakwalifikować jedynie metafazy w fazach: późnej G2 (chromatydy poszczególnych chromosomów ułożone są równolegle do siebie i mocno zbliżone) lub M (w chromosomie wytworzył się centromer pomiędzy chromatydami). W związku z częstymi problemami technicznymi związanymi z odróżnieniem od siebie obu ww. faz (zlane z sobą chromatydy na zdjęciach), analizowane komórki określa się jako znajdujące się w fazie G2 /M. 4. Zgrubnie ocenić możliwość analizy metafazy. Niekiedy, pomimo znajdowania się komórki w odpowiedniej fazie cyklu komórkowego, analiza metafazy nie jest możliwa. Najczęściej dzieje się tak w przypadku słabo skondensowanych i zlewających się chromosomów, metafaz w oczywisty sposób niekompletnych, czy też częściowo przesłoniętych innymi obiektami (artefaktami, etc.). 5. Zmaskować metafazę, tzn. usunąć ze zdjęcia obiekty uznane za niebędące fragmentami chromosomów należącymi do analizowanej metafazy. 6. Ustalić optymalny próg jasności dla obiektów na zdjęciu (ang. threshold) 7. (Krok opcjonalny.) W przypadku, gdy pomimo odpowiedniego ”wyprogowania” obrazu obiekty na zdjęciu są słabo rozróżnialne, można zastosować wyrównanie histogramu (ang. histogram equalisation)w celu poprawy kontrastu na obrazie. 8. Następnie należy przystąpić do zliczania elementów w trybie półautomatycznym lub ręcznym, zależnie od preferencji analizującego. W przypadku zastosowania trybu półautomatycznego koniecznie sprawdzić, czy algorytm programu wyłapał wszystkie elementy (np. przez przełączenie na tryb ręczny), gdyż ma on tendencję do pomijania fragmentów znacząco mniejszych od innych obecnych na obrazie. 9. Kolejny krok zleży od liczby zliczonych fragmentów: a) jeżeli liczba elementów na zdjęciu jest równa lub przekracza 45, należy wpisać liczbę ringów i fazę cyklu komórkowego metafazy w odpowiednie pola programu, zoptymalizować powiększenie metafazy i wyeksportować uzyskany obraz do formatu .jpg oraz zapisać zmiany w pliku, b) jeżeli liczba elementów na zdjęciu jest mniejsza od 45, zmian na zdjęciu nie zapisywać, metafazę można usunąć.

Dodatek B. Cyfrowa analiza zdjęć

57

10. Kroki od 2 od 9 należy wykonywać dla kolejnych zdjęć aż do uzyskania minimum 100 obrazów o liczbie elementów większej lub równej od 45.

C. Tabele wyników C.1. Tabele nPCC ....... Tabela C.1: Tabela wyników kodów 1X_1 – 1X_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

30

6,6

0,3

45

8,9

0,5

60

11

0,75

38

8,0

1

62

12

1,5

63

11

2

76

14

2,5

92

15

3

104

17

4

158

24

Tabela C.2: Tabela wyników kodów 1P_1 - 1P_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

30

6,6

0,3

79

19

0,5

89

17

0,75

86

12

1

136

17

1,5

173

59

2

95

15

2,5

113

16

3

149

16

4

107

18

59

Dodatek C. Tabele wyników

Tabela C.3: Tabela wyników kodów 2X_1 – 2X_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

21

5,6

0,3

30

8,0

0,5

44

8,1

0,75

50

11

1

53

9,1

1,5

152

26

2

86

15

2,5

116

19

3

124

23

4

51

11

Tabela C.4: Tabela wyników kodów 2P_1 – 2P_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

21

4,5

0,3

138

30

0,5

123

14

0,75

86

17

1

94

12

1,5

125

24

2

143

28

2,5

92

15

3

131

21

4

187

32

60

Dodatek C. Tabele wyników

Tabela C.5: Tabela wyników kodów 5X_1 – 5X_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

30

6,2

0,3

52

9,1

0,5

54

7,5

0,75

48

9,6

1

66

10

1,5

42

5,9

2

80

12

2,5

80

12

3

123

14

4

175

19

Tabela C.6: Tabela wyników kodów 5P_1 – 5P_10. Dawka [Gy]

nPCC

σ (nPCC)

0

21

4,5

0,3

138

30

0,5

123

14

0,75

86

17

1

94

12

1,5

125

24

2

143

28

2,5

92

15

3

131

21

4

187

32

61

Dodatek C. Tabele wyników

C.2. Tabele liczebności histogramów

Tabela C.7: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 1X_1 – 1X_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

76

23

1

0,3

70

28

2

0,5

60

35

5

0,75

72

25

3

1

66

27

7

1,5

59

38

3

2

57

37

6

2,5

52

36

12

3

52

32

16

4

37

40

23

Dawka [Gy]

Tabela C.8: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 1P_1 – 1P_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

76

23

1

0,3

65

28

7

0,5

56

35

9

0,75

63

26

11

1

50

37

13

1,5

62

24

14

2

52

34

14

2,5

49

33

18

3

40

32

28

4

53

32

15

Dawka [Gy]

62

Dodatek C. Tabele wyników

Tabela C.9: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 2X_1 – 2X_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

83

16

1

0,3

80

18

2

0,5

66

33

1

0,75

68

29

3

1

61

38

1

1,5

46

32

22

2

54

36

10

2,5

50

34

16

3

44

45

11

4

72

24

4

Dawka [Gy]

Tabela C.10: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 2P_1 – 2P_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

83

16

1

0,3

59

22

19

0,5

54

24

22

0,75

65

28

7

1

59

32

9

1,5

52

32

16

2

55

28

17

2,5

51

38

11

3

52

29

19

4

32

43

25

Dawka [Gy]

63

Dodatek C. Tabele wyników

Tabela C.11: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 5X_1 – 5X_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

79

19

2

0,3

66

31

3

0,5

67

27

6

0,75

71

24

5

1

57

39

4

1,5

67

32

1

2

66

25

9

2,5

57

35

8

3

32

53

15

4

24

48

28

Dawka [Gy]

Tabela C.12: Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 5P_1 – 5P_10 Liczba komórek

Liczba komórek

Liczba komórek

nieuszkodzonych

lekko uszkodzonych

mocno uszkodzonych

0

83

16

1

0,3

59

22

19

0,5

54

24

22

0,75

65

28

7

1

59

32

9

1,5

52

32

16

2

55

28

17

2,5

51

38

11

3

52

29

19

4

32

43

25

Dawka [Gy]

Spis rysunków 1.1

Przykład krzywych przeżywalności komórek dla dwóch rodzajów promieniowania: o niskim i wysokim LET. Rysunek pochodzi z [7, 8]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2

Przykłady obrazów chromatyny typowych dla odpowiednich faz cyklu komórkowego pozyskanych z użyciem metody PCC-chem. Rysunek zaczerpnięty z [25]. . . . . . . .

3.1

23

Zdjęcie stanowiska do napromieniania próbek promieniowaniem X. Fot. Kamila Rawojć [27] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.2

12

28

Stanowisko do naświetlania materiału biologicznego w probówkach typu Eppendorf wiązką protonową z cyklotronu AIC-144, analogiczne do stanowiska cyklotronu Proteus. Fot. Kamila Rawojć [27] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

30

3.3

Schemat podziału krwi pełnej pobranej od dawców w ramach projektu. . . . . . . . .

31

4.1

Przykłady metafaz w fazie G2 /M uzyskanych metodą PCC-chem. . . . . . . . . . . .

35

4.2

Graficzne przedstawienie pierwotnych danych (tzn. otrzymanych bezpośrednio z pomiarów, przed standaryzacją), uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla wszystkich dawców z podziałem na rodzaje promieniowania. . . . . . . . . . . . . . .

4.3

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 1 i promieniowania X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4 4.5

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla

4.6

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla

dawcy 2 i promieniowania X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . dawcy 2 i promieniowania protonowego. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

38 39 40

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 5 i promieniowania protonowego. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.9

38

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 5 i promieniowania X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.8

37

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem dla dawcy 1 i promieniowania protonowego. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.7

36

41

Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem - dane uśrednione dla promieniowania X. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

41

4.10 Graficzne przedstawienie wyników uzyskanych za pomocą metody PCC-chem - dane uśrednione dla promieniowania protonowego. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

42

4.11 Porównanie danych i modeli nPCCr dla promieniowania X i protonowego. . . . . . . .

43

4.12 Relacje pomiędzy uzyskanymi modelami a danymi pomiarowymi dla odpowiednich rodzajów promieniowania. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

44

4.13 Przykłady metafaz w fazie G1 uzyskanych metodą PCC-CHO. . . . . . . . . . . . . .

45

4.14 Przykłady metafaz w fazie S (a) i G1 (b) uzyskanych metodą PCC-CHO. . . . . . . .

46

Spis tabel 1.1

Wskazówki do triage’u pacjentów z podejrzeniem urazów radiacyjnych. Tabela opracowana na podstawie [21]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.2

15

Podsumowanie charakterystyk biodozymetrycznych testów cytogenetycznych. Tabela opracowana na podstawie [5, 22]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

18

3.1

Dawcy i wybrane dotyczące ich informacje, wyciąg z ankiet. . . . . . . . . . . . . . . .

26

3.2

Zebrane wyniki pomiarów dozymetrycznych. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

28

3.3

Rezultaty naświetlania próbek z materiałem biologicznym. Promieniowanie X. . . . .

29

3.4

Rezultaty naświetlania próbek z materiałem biologicznym. Promieniowanie protonowe.

29

4.1

Wartości testów statystycznych dla modeli obliczonych na podstawie danych uśrednionych. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . nPCC500 CHO

42

4.2

Wartości indeksu

otrzymane z analizowanych eksperymentów. . . . . . . .

45

C.1

Tabela wyników kodów 1X_1 – 1X_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

58

C.2

Tabela wyników kodów 1P_1 - 1P_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

58

C.3

Tabela wyników kodów 2X_1 – 2X_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

59

C.4

Tabela wyników kodów 2P_1 – 2P_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

59

C.5

Tabela wyników kodów 5X_1 – 5X_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

60

C.6

Tabela wyników kodów 5P_1 – 5P_10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

60

C.7

Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 1X_1 – 1X_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C.8

Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 1P_1 – 1P_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

C.9

61 61

Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 2X_1 – 2X_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

62

C.10 Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 2P_1 – 2P_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

62

C.11 Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 5X_1 – 5X_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

63

C.12 Tabela liczebności kategorii analizowanych metafaz dla kodów 5P_1 – 5P_10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

63