Chemia medyczna - I. Żak

SAVE OFFLINE

PRZEDMOWA Podręcznik Chemia medyczna przeznaczony jest przede wszystkim dla studentów Akademii Medycznych, jako pomoc dydaktyczna podczas realizacji programu nauczania z chemii na I roku studiów i stanowi teoretyczne uzupełnienie do ćwiczeń zawartych w Praktikum z chemii medycznej. W podręczniku przedstawiono wybrane wiadomości z chemii ogólnej, analitycznej, instrumentalnej oraz organicznej. Początkowe rozdziały w zwięzły i nowy sposób przypominają studentom wybrane wiadomości z programu dydaktycznego szkoły średniej, które są niezbędne podczas realizacji nauczania chemii na I roku medycyny. Materiał ten dotyczy wiązań chemicznych, roztworów wodnych wraz ze sposobami wyraŜania ich stęŜeń, reakcji w roztworach wodnych oraz właściwości roztworów buforowych. Część z tych wiadomości przedstawiono w formie zadań z rozwiązaniami, które stanowią wzorcowe przykłady pozwalające na ostateczne opanowanie podstawowych obliczeń chemicznych. W tym teŜ celu zamieszczono na końcu podręcznika szczegółowy układ okresowy i zestaw tabel z wybranymi parametrami fizykochemicznymi (rozdział 22). Przedstawione w podręczniku informacje, dotyczące zagadnień równowagi wodno-elektrolitowej, składników bionieorganicznych oraz równowagi kwasowo-zasadowej płynów ustrojowych niezbędne są do poznania i zrozumienia chemicznych podstaw mechanizmów homeostazy w roztworach wodnych ustroju. Wiadomości te stanowią dla studenta medycyny podstawowy zakres nowej wiedzy chemicznej, którą będzie dalej pogłębiać podczas studiów. Dalszą część stanowi chemia organiczna. Ogólne podstawy z tego zakresu studenci zdobyli w szkole średniej i sprawdzili swą wiedzę podczas egzaminów wstępnych na studia medyczne. Na tej podstawie zakładam, Ŝe studenci I roku medycyny mają wiadomości z chemii organicznej programu dydaktycznego szkoły średniej, które są niezbędne do dalszej realizacji nauczania chemii na studiach. W celu przypomnienia wiadomości, na końcu podręcznika zestawiono w tabelach najwaŜniejsze grupy funkcyjne (rozdział 22). Podstawowym zakresem nowej wiedzy chemicznej dla medyka, którą będzie dalej zgłębiać podczas studiów jest przede wszystkim chemia organiczna realizowana na przykładach związków występujących w modelowym organizmie Ŝywym, jakim jest człowiek. Podczas mojej wieloletniej pracy dydaktycznej w Śląskiej Akademii Medycznej mogłam obserwować kłopoty studentów z przyswojeniem niełatwych zagadnień przewidzianych programem nauczania chemii, dotyczących struktury, wła7

ściwości i funkcji podstawowych związków organicznych obecnych w organizmie Ŝywym. Sądzę, Ŝe mogło to wynikać zarówno z niedostatecznego przygotowania przez szkołę średnią w tym zakresie, jak i konieczności szukania wymaganej wiedzy w kilku róŜnych podręcznikach chemii organicznej i biochemii. Dlatego zagadnieniom tym poświęciłam niemal dwie trzecie podręcznika, sądząc, Ŝe ułatwią studentom medycyny pokonanie trudności związanych ze zdobywaniem wiedzy chemicznej na modelu organizmu Ŝywego. Kolejne rozdziały obejmują wiadomości poświęcone scharakteryzowaniu struktury, właściwości i funkcji biologicznej węglowodanów, lipidów z pochodnymi i ikozanoidami, oraz dotyczące aminokwasów, peptydów, polipeptydów wraz z białkami i modyfikacjami aminokwasów w białkach. Dalej omówiono porfiryny i ich pochodne, a następnie zasady azotowe, nukleotydy i kwasy nukleinowe wraz z przykładowymi czynnikami modyfikującymi DNA. W przystępny sposób starano się przedstawić chemiczne modyfikacje, jakim mogą ulegać łańcuchy boczne aminokwasów w białkach oraz mechanizm działania czynników zmieniających strukturę kwasów nukleinowych. Zawarta w podręczniku wiedza o strukturze makrocząsteczek, zaleŜności funkcji molekuł od jej struktury, o wzajemnych oddziaływaniach między cząsteczkami i in. jest niezbędna dla dalszego zrozumienia i poznania m.in. struktury błon komórkowych, mechanizmów przemian w biochemii, podstawowych zasad fizjologii, farmakologii, pozwala wyjaśnić chemiczny charakter mechanizmu przekazywania sygnałów między komórkami, podstawę róŜnic w okresie półtrwania glikoprotein w krąŜeniu. Ponadto sądzę, Ŝe student z pomocą tego podręcznika łatwiej moŜe zrozumieć m.in. nieenzymatyczną glikację, czyli modyfikację występującą np. w cukrzycy i odróŜnić ją od posttranslacyjnego procesu enzymatycznego, odpowiedzialnego za glikozylację białek. Osoby zainteresowane i dociekliwe, które pragną poszerzyć wiadomości odsyłam do zacytowanej, łatwo dostępnej literatury źródłowej i uzupełniającej (rozdział 23). Podręcznik Chemia medyczna, choć został napisany dla studentów medycyny, moŜe być takŜe przydatny dla studentów stomatologii, fizjoterapii, farmacji, analityki medycznej, weterynarii i innych kierunków przyrodniczych. Sądzę, Ŝe ksiąŜka ta moŜe zarazem stanowić pomoc dydaktyczną dla nauczycieli szkół średnich, prowadzących zajęcia fakultatywne o profilu biologiczno-chemicznym, przygotowujących uczniów do olimpiad z chemii lub biologii i wszystkich innych zainteresowanych wiedzą o strukturze i właściwościach biocząsteczek, spełniających waŜne funkcje biologiczne tylko w określonych warunkach środowiska, Ŝywego organizmu. Podręcznik Chemii medycznej jest pierwszym wydaniem na polskim rynku wydawniczym, dlatego będę szczególnie wdzięczna Czytelnikom za wszelkie rzeczowe uwagi, które postaram się uwzględnić w następnym wydaniu. Katowice, 30. 11. 2001 r. 8

Iwona śak

1.

ATOMY, CZĄSTECZKI, WIĄZANIA CHEMICZNE Iwona śak

STRUKTURA ATOMOWA I WIĄZANIA CHEMICZNE Atomy składają się z dodatnio naładowanego jądra atomowego oraz z otaczających go ujemnie naładowanych elektronów. Praktycznie cała masa atomu skupia się w jądrze, zawierającym elektrycznie obojętne neutrony i dodatnio naładowane protony. Elektrony o niewielkiej masie krąŜą w odległości około 10-10 m, czyli 100 pikometrów (pm) lub 1 angstrema od jądra atomowego. Liczbę protonów obecnych w jądrze atomowym określa liczba atomowa, która ma tę samą wartość dla wszystkich atomów tego samego pierwiastka, np. 1 dla H; 6 dla C, 7 dla N, 8 dla O, 11 dla Na. Sumę protonów i neutronów określa liczba masowa. Atomy danego pierwiastka mogą mieć róŜne liczby masowe, w zaleŜności od zawartości neutronów w jądrze. Masa atomowa pierwiastka to wartość średnia liczb masowych wielu atomów pierwiastka. Fakt, Ŝe masa atomowa stanowi wartość średnią, wyjaśnia, dlaczego zazwyczaj nie jest liczbą całkowitą. Według teorii Schrödingera, ruch elektronu wokół jądra moŜna opisać matematycznie jako równanie falowe, którego rozwiązanie, oznaczone grecką literą psi Ψ, nosi nazwę funkcji falowej lub orbitalu. Orbital jako funkcja falowa opisuje obszar wokół jądra atomu, w którym istnieje największe prawdopodobieństwo znalezienia elektronu, maksymalnie dwóch. Istnieją 4 róŜne orbitale atomowe (oznaczone jako s, p, d, f) o róŜnych kształtach, mianowicie o kulistym orbitale s, hantli wszystkie trzy orbitale p, liścia koniczyny cztery orbitale d, piąty orbital d ma kształt obwarzanka. Orbital s ma charakter bezkierunkowy, natomiast pozostałe mają kierunkowy rozkład ładunku. Orbitale znajdują się w poszczególnych powłokach elektronowych. Pojemność powłoki najbliŜszej jądra, czyli pierwszej, ograniczona jest do 2 elektronów, drugiej do 8, trzeciej do 18, czwartej do 32 elektronów. Powłoka, im dalej leŜy od jądra, tym jej elektrony mają większą energię.

9

Na pierwszej powłoce elektronowej znajdują się maksymalnie dwa elektrony o najniŜszej energii, które zajmują pojedynczy orbital 1s. Bogatsze, z punktu widzenia energetycznego, dwa elektrony naleŜą do powłoki elektronowej drugiej i zajmują większy orbital 2s. Sześć pozostałych elektronów tej powłoki wykazuje jeszcze większą energię, znajdują się one na trzech orbitalach 2p. Orbitale te mają jednakową względem siebie energię, ale są odmiennie zorientowane w przestrzeni, praktycznie kaŜdy z nich jest prostopadły do dwóch pozostałych. WyŜsze energetycznie elektrony (maksymalnie 18) powłoki trzeciej umiejscowione są na jednym orbitalu 3s, trzech orbitalach 3p i pięciu orbitalach d. Konfigurację elektronową stanu podstawowego atomu, czyli układ o najniŜszej energii, przedstawia się poprzez opis orbitali zajętych przez elektrony, kierując się następującymi zasadami: ⇒ orbital mogą zajmować maksymalnie dwa elektrony, które zgodnie z zakazem Pauliego, muszą mieć przeciwny spin; dwie odmienne orientacje spinu określa się strzałkami, jako ↑ (w górę) i ↓ (w dół); ⇒ w pierwszej kolejności wypełniane są orbitale o niŜszej energii,wg zapisu:

1s→ →2s→ →2p→ →3s→ →3p→ →4s→ →3d→ →4p→ →5s→ →4d→ →5p→ →6s→ →4f→ →5d→ →6p; ⇒ dostępne nie zapełnione orbitale o jednakowej energii, np. orbitale p, zajmowane są kolejno przez pojedyncze elektrony ze spinami skierowanymi w tę samą stronę, aŜ wszystkie zostaną zajęte (reguła Hunda); przykładowy opis konfiguracji elektronowej w stanie podstawowym i w stanie wzbudzonym atomów ilustruje tabela 1. Liczba pojedynczo obsadzonych orbitali ma odzwierciedlać liczbę wiązań kowalencyjnych, jakie moŜe utworzyć atom. Analizując pierwiastki naleŜące do kolejnych grup układu okresowego, łatwo zauwaŜyć, Ŝe w stanie podstawowym atomu liczba niesparowanych elektronów walencyjnych berylowców, borowców i węglowców nie zawsze jest zgodna z ich wartościowością. Koncepcja stanów wzbudzonych atomów pozwala wyjaśnić tę pozorną niezgodność zmianą konfiguracji elektronowej. W atomie w stanie wzbudzonym (na skutek zbliŜenia się atomu zdolnego do utworzenia wiązania chemicznego) pojawiają się dodatkowe niesparowane elektrony walencyjne, w wyniku przejścia z zapełnionego niŜszego podpoziomu na wolny podpoziom wyŜszy. Istnienie atomu w stanie wzbudzonym jest ograniczone tylko do atomów związanych w cząsteczce, wolne atomy w stanie wzbudzonym nie istnieją. Stan wzbudzenia zmienia konfigurację elektronów walencyjnych w atomach berylu, boru i węgla (tab. 1), sprawiając, Ŝe liczba niesparowanych elektronów odzwierciedla wartościowości tych pierwiastków w związkach chemicznych.

10

Tabela 1. Konfiguracje elektronowe atomów w stanie podstawowym oraz w stanie wzbudzonym Konfiguracja elektronowa przykładowych atomów Pierwiastek

Liczba atomowa

Konfiguracja w stanie podstawowym wzbudzonym

Wodór

1

1s

Beryl

4

2p 2s 1s

Bor

5

2p 2s 1s

6

2p 2s 1s bez zmiany

Azot

7

2p 2s 1s

8

2p 2s 1s

bez zmiany

Tlen

3s 2p 2s 1s

bez zmiany

Węgiel

Sód

11

bez zmiany

Atomy, które posiadają jeden, dwa lub trzy elektony walencyjne mogą tworzyć odpowiadającą im liczbę wiązań kowalencyjnych, natomiast atomy z czterema lub więcej elektronami na powłoce walencyjnej mogą tworzyć tyle wiązań, ile potrzebują elektronów do zapełnienia orbitali s i p swych powłok walencyjnych dla utworzenia oktetu. Przykładowo, beryl tworzy dwa wiązania, bor trzy, węgiel czte11

ry, azot trzy, a tlen dwa wiązania kowalencyjne. Atom boru (np. w cząsteczce BF3) nie moŜe utworzyć trwałej struktury oktetu, natomiast atomy pierwiastków, które dysponują orbitalami d i inne, np. SF6, mogą nie spełniać reguły oktetu, poniewaŜ na powłoce walencyjnej mają więcej elektronów. Elektronami niewiąŜącymi, które noszą równieŜ nazwę wolnej pary elektronowej, są sparowane elektrony walencyjne nie zaangaŜowane w tworzeniu wiązań kowalencyjnych. Przykładami z tabeli 1 mogą być atom azotu (np. w cząsteczce amoniaku), którego dwa elektrony walencyjne tworzą wolną parę elektronową (2s), oraz atom tlenu (np. w cząsteczce wody), który ma dwie pary wolnych elektronów (2s, 2p). Atomy łączą się ze sobą, poniewaŜ wytworzona cząsteczka jest bardziej trwała, ma mniejszą energię niŜ poszczególne, pojedyncze atomy. W stanie naturalnym niemal wszystkie pierwiastki chemiczne istnieją w postaci cząsteczkowej. Dotychczas nie stworzono uniwersalnej teorii wiązania chemicznego, która tłumaczyłaby jednolicie całą róŜnorodność i złoŜoność wszystkich struktur cząsteczkowych. Opracowano wiele teorii i metod wyjaśniających róŜnorodne cechy i właściwości wiązania chemicznego. Najstarszą jest elektronowa teoria wiązania chemicznego, stworzona przez Lewisa na początku XX wieku. Powszechnie znana, poniewaŜ jest przedmiotem nauczania chemii, zarówno na poziomie podstawowym, jak i średnim, dlatego w podręczniku chemii medycznej moŜna zrezygnować ze szczegółowego jej omawiania. Teoria elektronowa wiązania chemicznego opiera się na konfiguracji oktetowej (czasami dubletowej) elektronów walencyjnych (charakterystycznej dla gazów szlachetnych). Wynika z obserwacji, Ŝe wiele pierwiastków głównych grup układu okresowego ma skłonność do przyjmowania konfiguracji elektronowej gazu szlachetnego w związkach chemicznych, co powiązane jest z ich właściwościami chemicznymi. Teoria ta wyjaśniła charakter elektrostatyczny wiązania jonowego, nie tłumaczy jednak istoty kaŜdego wiązania atomowego. Przykładowo, nie tłumaczy, dlaczego wiązania kowalencyjne mają określone kierunki w przestrzeni. Niewątpliwą jej zaletą jest fakt, Ŝe na podstawie jednolitego kryterium (oktetu lub dubletu) opisała róŜne typy wiązań i ich liczby w związkach chemicznych. Podstawy nowoczesnej teorii wiązań chemicznych tkwią w mechanice kwantowej (falowej), dziedzinie wiedzy odznaczającej się wysokim stopniem abstrakcji i złoŜoności opisów matematycznych. Wnikliwe jej poznanie wymagałoby osobnych studiów. Wnioski wynikające z tej wiedzy są na ogół powszechnie zrozumiałe. Pojęcia mające korzenie w mechanice kwantowej stały się niezbędne w chemii, z niektórych korzysta się juŜ na podstawowym poziomie nauczania tego przedmiotu. Kwantowymi teoriami wiązania chemicznego, które wyjaśniają zarówno charakter i energię wiązań w cząsteczce oraz geometrię cząsteczek, są teoria wią12

zań walencyjnych i teoria orbitali molekularnych (cząsteczkowych). W wielu punktach są podobne, lecz w róŜny sposób tłumaczą te same zjawiska. Teoria wiązań walencyjnych opisuje wiązanie kowalencyjne jako rezultat nałoŜenia się na siebie dwóch orbitali atomowych z niesparowanym elektronem o spinach przeciwnych, przy czym kaŜdy orbital pochodzi od innego atomu. Sparowane w ten sposób ze sobą dwa elektrony w nałoŜonych orbitalach są przyciągane do jąder obydwu atomów, poniewaŜ są uwspólnione przez obydwa atomy i dzięki temu atomy te są połączone. KaŜdy z połączonych ze sobą atomów zatrzymuje swoje własne orbitale atomowe. Siła wiązania atomowego zaleŜy od stopnia nałoŜenia się orbitali i jest tym większa, im bardziej orbitale zachodzą na siebie. Teoria orbitali molekularnych (cząsteczkowych) opisuje tworzenie wiązań atomowych jako rezultat matematycznej kombinacji orbitali atomowych (funkcji falowych), prowadzący do określenia energii i kształtu orbitali cząsteczkowych. Według tej teorii, tworzenie wiązania atomowego jest skutkiem powstania orbitali molekularnych (cząsteczkowych). Powstawanie orbitali molekularnych jest skutkiem kombinacji dwóch lub większej liczby orbitali atomowych. Liczba utworzonych orbitali molekularnych jest taka sama, jak liczba orbitali atomowych, z których kombinacje te powstały. Orbitale molekularne nazywane są tak, ze względu na ich przynaleŜność do całej cząsteczki, a nie do konkretnego atomu. Orbital molekularny opisuje tę część przestrzeni w cząsteczce, w której najprawdopodobniej znajdują się elektrony, charakteryzuje zatem cząsteczkę jako całość, a nie pojedynczy atom. Orbitale molekularne mają charakterystyczny kształt, wymiar i poziom energetyczny. Orbital cząsteczkowy, którego energia jest niŜsza od energii orbitali atomowych, z których został utworzony, jest orbitalem wiąŜącym, tak jak np. w orbitalu H2, mającym kształt jajka. Natomiast orbital molekularny, który ma energię wyŜszą niŜ orbitale atomowe, z których został utworzony, jest orbitalem antywiąŜącym. W orbitalu tym elektrony nie mogą znaleźć się w środkowym obszarze między jądrami atomowymi, gdzie występuje węzeł funkcji falowej, dlatego nie mogą przyczynić się do utworzenia wiązania. Zatem nakładanie się dwóch orbitali atomowych daje dwa orbitale molekularne, wiąŜący i antywiąŜący. Cząsteczki w stanach podstawowych mają obsadzone elektronami tylko orbitale wiąŜące. Orbitale antywiąŜące są obsadzone elektronami tylko w stanach wzbudzonych cząsteczek.

Hybrydyzacja Hybrydyzacja orbitali jest procesem ich wymieszania i wyrównania podczas tworzenia cząsteczki, prowadzącym do wytworzenia nowych, jednakowych

13

i ukierunkowanych w przestrzeni orbitali atomowych z kombinacji orbitali s i p lub s, p i d. Orbitale zhybrydyzowane, nazywane równieŜ hybrydami, są równocenne, lecz są inaczej ukierunkowane w przestrzeni niŜ orbitale atomowe. Wynika to z faktu, Ŝe dwie pętle orbitali p mają przeciwne znaki algebraiczne (+ i -), jedna z nich jest addytywna (dodaje się) z orbitalem s, natomiast druga pętla p jest substratywna (odejmuje się). W wyniku hybrydyzacji zmienia się symetria orbitali, jedno ramię zwiększa się kosztem drugiego. Zmiana symetrii orbitali zhybrydyzowanych sprawia, Ŝe znacznie lepiej nakładają się z orbitalem drugiego atomu podczas tworzenia wiązania, dzięki czemu hybrydy tworzą silniejsze wiązanie niŜ czynią to niezhybrydyzowane orbitale s i p. Ukierunkowanie orbitali zhybrydyzowanych w przestrzeni, warunkujące kształt cząsteczki, zaleŜy od liczby elektronów walencyjnych oraz liczby orbitali atomowych uczestniczących w mieszaniu i tworzeniu hybrydy.

Hybrydy sp Wymieszanie orbitalu s z pojedynczym dostępnym orbitalem p doprowadza do powstania dwóch równocennych zhybrydyzowanych orbitali sp, które noszą nazwę hybryd sp. Oba orbitale sp są liniowe, zorientowane względem siebie pod kątem 180°. Cząsteczki, w których elektrony walencyjne atomu centralnego (tab. 1, beryl i inne) są zaangaŜowane w wiązania chemiczne i zawierają hybrydy sp, mają budowę liniową. Zgodnie z zasadą maksymalnego, wzajemnego unikania się elektronów, wytworzone dwa wiązania są maksymalnie oddalone od siebie i tworzą kąt 180°. Taka liniowa budowa jest charakterystyczna dla cząsteczek z atomem centralnym, naleŜącym do berylowców, np. BeCl2, MgCl2, lub do pierwiastków przejściowych, np. ZnCl2, HgCl2. Zhybrydyzowane orbitale sp wyjaśniają właściwości i strukturę wiązania potrójnego, najczęściej spotykanego w związkach węgla. Wiązanie to występuje między dwoma atomami węgla w alkinach, np. w cząsteczce acetylenu. W atomie węgla orbital 2s miesza się jedynie z pojedynczym orbitalem p, tworząc dwa równocenne zhybrydyzowane orbitale sp, a pozostałe dwa orbitale p nie ulegają hybrydyzacji. Po zbliŜeniu się do siebie dwóch atomów węgla, posiadających zhybrydyzowane orbitale sp następuje liniowe nakładanie na siebie po jednym takim orbitalu od kaŜdego atomu, prowadzące do wytworzenia silnego wiązania, które nazwano wiązaniem sigma (σ), typu sp-sp. Równocześnie, obecne w obu atomach orbitale py bocznie nakładają się na siebie, tworząc wiązanie nazwane wiązaniem pi (π), typu py-py, podobnie jak to czynią orbitale pz obu atomów węgla, które tworzą wiązanie π, typu pz-pz. Dlatego utworzenie wiązania potrójnego węgiel-węgiel jest 14

efektem uwspólnienia sześciu elektronów. Pozostałe orbitale sp kaŜdego atomu węgla tworzą wiązania sigma z atomem wodoru, doprowadzając tym samym do wytworzenia cząsteczki acetylenu. Dzięki hybrydyzacji sp acetylen jest cząsteczką liniową, z kątami między wiązaniami równymi 180°, długości wiązania między atomami węgla rzędu 1,20 Å oraz mocy około 835 kJ/mol. Wiązanie to jest najkrótsze i najsilniejsze ze wszystkich wiązań węgiel-węgiel.

Hybrydy sp2 Wymieszanie orbitalu s z dwoma dostępnymi orbitalami p doprowadza do powstania trzech równocennych zhybrydyzowanych orbitali sp2, które noszą nazwę hybryd sp2. Trzy orbitale sp2 leŜą w płaszczyźnie i zorientowane są względem siebie pod kątem 120°. Cząsteczki, w których elektrony walencyjne atomu centralnego (tab. 1, bor i inne) są zaangaŜowane w wiązania chemiczne i zawierają hybrydy sp2, są planarne (płaskie). Zgodnie z zasadą maksymalnego, wzajemnego unikania się elektronów, trzy wiązania utworzone z hybryd sp2, np. w trifluorku boru (BF3), tworzą płaską, trygonalną (trójkątną) strukturę o kątach między wiązaniami 120°. W cząsteczce tej kaŜdy atom fluoru wiąŜe się z orbitalem sp2 boru, jednak jeden orbital p boru pozostaje nie zapełniony. Zhybrydyzowane orbitale sp2 wyjaśniają właściwości i strukturę wiązania podwójnego, często spotykanego w związkach węgla. Wiązanie to występuje między dwoma atomami węgla w alkenach, np. w cząsteczce etylenu. W atomie węgla orbital 2s miesza się jedynie z dwoma orbitalami p, tworząc trzy równocenne hybrydy sp2 leŜące w płaszczyźnie pod kątem 120° względem siebie, a pozostały jeden orbital p, który nie uległ hybrydyzacji, jest prostopadły do płaszczyzny orbitalu sp2. Po zbliŜeniu się do siebie dwóch atomów węgla, posiadających zhybrydyzowane orbitale sp2, następuje liniowe nakładanie na siebie po jednym takim orbitalu od kaŜdego atomu, prowadzące do wytworzenia wiązania sigma (σ), typu sp2sp2. Równocześnie, obecne w obu atomach niezhybrydyzowane orbitale p bocznie nakładają się na siebie, tworząc wiązanie π typu p-p. Dlatego utworzenie wiązania podwójnego węgiel-węgiel jest efektem uwspólnienia czterech elektronów. Pozostałe dwie hybrydy sp2 z kaŜdego atomu węgla tworzą łącznie cztery wiązania sigma z czterema atomami wodoru, doprowadzając tym samym do wytworzenia cząsteczki etylenu. Dzięki hybrydyzacji sp2 etylen jest cząsteczką planarną i trygonalną, z kątami między wiązaniami, wynoszącymi średnio 120°. Długość wiązania między atomami węgla wynosi 1,33 Å, a jego moc 611 kJ/mol. Wiązanie podwójne między atomami węgla w etylenie jest dłuŜsze od wiązania potrójnego w acetylenie. 15

Hybrydy sp3 Wymieszanie orbitalu s z trzema dostępnymi orbitalami p doprowadza do powstania czterech zhybrydyzowanych orbitali sp3, które noszą nazwę hybryd sp3. Cztery równocenne orbitale sp3 są przestrzennie ukierunkowane ku naroŜom regularnego czworościanu (tetraedru) i są niesymetryczne w stosunku do jądra atomu. Hybrydy sp3 są najczęściej występującymi orbitalami zhybrydyzowanymi atomu węgla, które tworzą pojedyncze wiązania w alkanach, np. w metanie. Atom węgla (tab. 1) ma cztery elektrony walencyjne, po jednym na dwóch rodzajach orbitali 2s i 2p, w wyniku hybrydyzacji tworzy cztery równocenne orbitale atomowe o geometrii tetraedrycznej. W wyniku nałoŜenia się tych czterech orbitali sp3 z orbitalami 1s czterech atomów wodoru powstaje cząsteczka metanu, w której kąt tetraedryczny (kąt między wiązaniami) wynosi dokładnie 109,5°. Zhybrydyzowane orbitale sp3 wyjaśniają właściwości i strukturę wiązania pojedynczego między dwoma atomami węgla, np. w cząsteczce etanu, jak równieŜ w wielu milionach innych związków organicznych. W etanie występuje jedno wiązanie węgiel-węgiel. Po zbliŜeniu się do siebie dwóch atomów węgla, które posiadają zhybrydyzowane orbitale sp3, następuje liniowe nakładanie na siebie po jednym takim orbitalu od kaŜdego atomu, z wytworzeniem wiązania σ, typu sp3-sp3. Wiązanie C-C ma długość 1,54 Å i moc 376 kJ/mol. Wszystkie kąty między wiązaniami w cząsteczce etanu są bliskie wartości kąta tetraedrycznego 109,5°. Hybrydyzacja sp3 nie jest ograniczona do związków węgla, moŜe dotyczyć innych atomów, np. atomu azotu w cząsteczce amoniaku lub atomu tlenu w wodzie. Atom azotu ma pięć elektronów walencyjnych, w tym jedną wolną parę elektronową (tab. 1), dla osiągnięcia oktetu elektronowego tworzy trzy wiązania kowalencyjne. Atom azotu ulega hybrydyzacji z wytworzeniem czterech orbitali sp3, wśród których trzy zajęte są pojedynczymi elektronami, a jeden przez wolną parę elektronową. Liniowe nałoŜenie trzech niezapełnionych orbitali sp3 z orbitalami 1s trzech atomów wodoru doprowadza do wytworzenia cząsteczki amoniaku. W cząsteczce amoniaku kąty między wiązaniami H-N-H wynoszą 107,3°, wartość ta jest bardzo bliska wartości kąta tetraedrycznego w metanie. Orbital z wolną parą elektronową hybrydy sp3 atomu azotu w amoniaku zajmuje tyle samo przestrzeni, ile wiązanie N-H i pełni istotną rolę w determinowaniu własności chemicznych amoniaku. Atom tlenu ma sześć elektronów walencyjnych, w tym dwie wolne pary elektronowe (tab. 1), dla osiągnięcia oktetu elektronowego tworzy dwa wiązania kowalencyjne. Atom tlenu ulega hybrydyzacji z wytworzeniem czterech orbitali sp3, wśród których dwa zajęte są pojedynczymi elektronami, a dwa przez wolne pary elektronowe. Liniowe nałoŜenie dwóch niezapełnionych orbitali sp3 z orbita16

lami 1s dwóch atomów wodoru doprowadza do wytworzenia cząsteczki wody. W cząsteczce wody kąty między wiązaniami H-O-H wynoszą 104,5°, wartość ta jest nieco mniejsza od wartości kąta tetraedrycznego w metanie. Zmniejszenie wartości kąta wynika przypuszczalnie z odpychającego oddziaływania między dwiema wolnymi parami elektronowymi, powodującego ściągnięcie (kompresję) kąta między atomami tlenu i wodoru.

TYPY WIĄZAŃ CHEMICZNYCH Podział wiązań na typy ma charakter formalny, w rzeczywistości między niektórymi typami brak wyraźnej granicy. Podstawowymi typami wiązań są: wiązania jonowe (elektrowalencyjne), atomowe, atomowe spolaryzowane, koordynacyjne, wodorowe oraz wiązania międzycząsteczkowe, czyli siły Van der Waalsa.

Wiązanie jonowe Wiązanie jonowe powstaje w wyniku przyciągania elektrostatycznego odmiennych ładunków. Występuje między dwoma jonami i wynika z przyciągania elektrostatycznego ich przeciwnych ładunków. Na ogół obecne jest w solach nieorganicznych. Typowe wiązanie jonowe tworzy się między pierwiastkiem (metalem) silnie elektrododatnim (naleŜącym do litowców), który oddaje elektron, a pierwiastkiem (niemetalem) silnie elektroujemnym (naleŜącym do fluorowców), przyjmującym elektron. Utworzona wiąŜąca para elektronowa jest niemal całkowicie przesunięta do atomu bardziej elektroujemnego, dzięki czemu atomy uczestniczące w tworzeniu wiązania jonowego osiągają konfigurację oktetową. Przykładowo, podczas tworzenia NaCl, atom sodu oddaje elektron, przechodząc w jon Na+, który osiągnął konfigurację neonu. Natomiast atom chloru przyjmuje elektron, przechodząc w jon Cl-, o konfiguracji argonu. Wytworzony NaCl określa się jako jonowe ciało stałe, posiadające wiązanie jonowe.

Wiązanie atomowe Wiązanie atomowe, czyli kowalencyjne (kowalentne), powstaje w wyniku uwspólnienia (sparowania) dwóch elektronów o spinie przeciwnym, po jednym od kaŜdego atomu. Atomy nie róŜniące się elektroujemnością lub róŜniące się minimalnie tworzą wiązanie atomowe, w którym wiąŜąca para elektronów rozmieszczona jest symetrycznie między dwoma jądrami atomowymi, zatem przyciągana jest przez oba jądra atomowe w jednakowym stopniu. Atomy uczestniczące w wiązaniu osią17

gają konfigurację gazu szlachetnego. Przykładowo, atomy w cząsteczce wodoru H2 osiągają konfigurację helu, a w cząsteczce chloru Cl2 konfigurację argonu. Wyjątek stanowią atomy pierwiastków metalicznych, nie wykazujące tendencji do tworzenia między sobą wiązań kowalencyjnych. Według teorii orbitali molekularnych, hel moŜe tworzyć cząsteczkę He2, która jest nietrwała, poniewaŜ na obu orbitalach: wiąŜącym i antywiąŜącym liczba elektronów jest jednakowa. Zgodnie z teorią wiązań walencyjnych atom helu nie moŜe utworzyć wiązania, poniewaŜ jego oba elektrony walencyjne są juŜ sparowane, dlatego cząsteczka helu nie powstaje. Sparowanie dwóch elektronów nie zawsze jest wystarczające do utworzenia oktetu, dlatego atomy mogą wykorzystać dwa lub trzy elektrony do uwspólnienia, tworząc wiązania wielokrotne, podwójne lub potrójne, jak np. w N2. Cząsteczki posiadające czyste wiązanie atomowe (H2, O2, N2, itp.) mają symetryczny rozkład ładunku, dlatego są cząsteczkami niepolarnymi. Wszystkie pojedyncze wiązania atomowe, które są skierowane wzdłuŜ prostej łączącej jądra dwóch atomów noszą nazwę wiązań sigma σ, tworzonych przez osiowe nałoŜenie orbitali atomowych. Istnieją trzy typy wiązań sigma. Wiązanie sigma typu s-s powstaje w wyniku nałoŜenia się dwóch orbitali s z niesparowanym elektronem, tak jak w cząsteczce H2. Wiązanie sigma typu p-p powstaje w wyniku liniowego nałoŜenia się dwóch orbitali p z niesparowanym elektronem, tak jak np. w cząsteczkach fluorowców F2, Cl2. Wiązanie sigma typu s-p powstaje w wyniku liniowego nałoŜenia się orbitali s i p z niesparowanymi elektronami, tak jak w cząsteczce HCl. Wiązanie to jest powszechne w związkach wodoru z pierwiastkami 15, 16 i 17 grupy układu okresowego. Wiązania sigma są najczęstsze, ale jak juŜ wcześniej powiedziano są teŜ wiązania innego typu, mianowicie wiązania pi (π), utworzone w wyniku bocznego nakładania się dwóch orbitali p lub d, które są skierowane prostopadle do płaszczyzny wiązania sigma, czyli płaszczyzny cząsteczki. Występują one w wielu związkach organicznych i nieorganicznych, wśród tych ostatnich obecne są np. w N2, O2, tlenkach węgla, azotu, fosforu.

Wiązanie kowalencyjne spolaryzowane RóŜnica elektroujemności między atomami jest zerowa w przypadku wiązania atomowego, w którym rozmieszczenie elektronów jest symetryczne. Maksymalna róŜnica elektroujemności między atomami występuje w wiązaniu jonowym. Między tymi skrajnymi wiązaniami znajduje się przewaŜająca większość wiązań chemicznych, w których elektrony są przyciągane przez jeden atom (bardziej elektroujemny) silniej niŜ przez drugi. Sprawia to, Ŝe rozdział elektronów w wiązaniu 18

jest niesymetryczny, co oznacza, Ŝe chmura elektronowa jest przesunięta w kierunku bardziej elektroujemnego z atomów tworzących wiązanie. Wiązania z niesymetrycznym rozdziałem elektronów nazywane są wiązaniami atomowymi spolaryzowanymi. Właściwością wynikającą z niesymetrycznego rozkładu elektronów w cząsteczce jest polarność. Przyjęto jako regułę ogólną, Ŝe wiązaniami atomowymi spolaryzowanymi są te, w których róŜnica elektroujemności między atomami ma wartość mniejszą niŜ dwie jednostki. Przy czym, im bardziej zbliŜone są elektroujemności atomów biorących udział w wiązaniu, tym większy jest udział wiązania atomowego. Jeśli róŜnica elektroujemności jest niewielka, tak jak np. między atomem wodoru i atomem węgla (∆=0,4), to polarność wiązania jest niska. Wiązania pomiędzy atomami, których elektroujemności róŜnią się o więcej niŜ 2 jednostki są w duŜym stopniu wiązaniami jonowymi. Wiązania między atomami róŜniącymi się elektroujemnością (∆ [G] + [C], ⇒ cząsteczki DNA, w których [A] + [T] < [G] + [C], ⇒ cząsteczki DNA, w których [A] + [T] = [G] + [C]. Cząsteczki DNA pierwszego typu są najbardziej powszechne, z reguły róŜnice między sumą AT a sumą GC okazują się stosunkowo niewielkie, przedstawicielami ich mogą być zarówno cząsteczki DNA pochodzące z wirusów (Polyoma), bakterii (Mycoplasma), droŜdŜy, muszek (Drosophila), jak i z organizmu człowieka. Przedstawicielem DNA trzeciego typu mogą być cząsteczki DNA wywodzące się z Echerichia coli. Rzadko występują cząsteczki DNA drugiego typu, obecne np. u Alcaligenes faecalis. Kwasy deoksyrybonukleinowe lub ich rejony mogą występować w trzech głównych formach przestrzennych (strukturach drugorzędowych) zwanych A, B i Z. Dominującą strukturą drugorzędową DNA jest forma B, będąca regularną prawoskrętną helisą, zgodną z modelem Watsona i Cricka. Oba antyrównoległe łańcuchy B-DNA zwijają się helikalnie wokół osi helisy, do której pary zasad azotowych układają się prostopadle.

328

B-DNA

A-DNA

Z-DNA

Schematyczne diagramy głównych form: A-, B-, Z-DNA. (wg [12], zmodyfikowane)

W centrum helisy DNA znajdują się zasady azotowe obu nici, których płaszczyzny ułoŜone są jedna nad drugą w formie charakterystycznych dwóch stosów, stabilizowanych warstwowo oddziaływaniami hydrofobowymi. Na zewnątrz helisy DNA umiejscowione są oba rdzenie fosfocukrowe, pomiędzy którymi przebiegają helikalnie dwie bruzdy (rowki): mała o szerokości 6 Å i duŜa o szerokości 12 Å .

rdzeń cukrowo-fosforanowy

329

Obecność bruzd sprawia, Ŝe moŜe mieć miejsce specyficzne rozpoznawanie, oddziaływanie lub wiązanie białek regulatorowych, np. kontrolujących ekspresję genów (poprzez ich moduły oddziaływujące bezpośrednio z DNA np. tzw. palce cynkowe lub typu helisa-zwrot-helisa, lub suwaka leucynowego) z określonymi (swoistymi) sekwencjami zasad azotowych, ukrytymi w centrum helisy, bez rozrywania dwupasmowej struktury DNA. Przez bruzdy te mogą równieŜ wsuwać się róŜne płaskie aromatyczne cząsteczki policykliczne, które wślizgują się między pary zasad azotowych ułoŜone w stosy, czyli ulegają procesowi interkalacji. Zgodnie z tym mechanizmem działa wiele związków rakotwórczych, a takŜe leków przeciwnowotworowych. W formie B helisy DNA występują reszty deoksyrybozy C2'-endo, wiązania glikozydowe o konformacji anty, 10 par zasad azotowych przypada na kaŜdy pełny skręt, który ma wysokość 34 Å, a średnica helisy wynosi 23,7 Å. W formie A prawoskrętnej helisy DNA występują reszty deoksyrybozy C3'-endo, wiązania glikozydowe o konformacji anty, 11 par zasad azotowych przypada na kaŜdy pełny skręt, który ma wysokość 25 Å, średnica helisy zaś wynosi 25,5 Å. W formie A pary zasad azotowych nachylone są do osi helisy pod kątem 20°, zatem nie są do niej prostopadłe, jak w formie B. Występuje praktycznie tylko jedna głęboka bruzda duŜa. W sekwencji formy Z helisy DNA występują przemiennie nukleotydy purynowe i pirymidynowe np. GC, AC. W tej formie DNA wszystkie nukleotydy purynowe mają wiązania glikozydowe konformacji syn, natomiast nukleotydy pirymidynowe zawierają wiązania glikozydowe konformacji anty. Obrót tych par zasad o 180° wokół wiązania N-glikozydowego powoduje, Ŝe Z-DNA jest helisą lewoskrętną. Sprawia to równieŜ, Ŝe obwodowe rdzenie fosfocukrowe tworzą wzór zygzakowaty i stąd wywodzi się nazwa tej formy Z-DNA. W formie Z-DNA pary zasad azotowych odchylone są od osi helisy o kąt 10°, zatem nie są do niej prostopadłe, jak w formie B. Forma Z jest najbardziej wydłuŜona spośród wszystkich trzech form DNA, na kaŜdy pełny skręt przypada 12 par zasad azotowych, skok helisy wynosi 45,6 Å, a średnica 18,4 Å. Forma ta ma tylko małą głęboką bruzdę, która jest wąska. Z-DNA wymaga wysokiego stęŜenia soli lub specyficznych kationów, poliamin (spermina, spermidyna) do stabilizacji i nie tworzy struktur nukleosomowych. Występowanie w obrębie DNA fragmentów o zróŜnicowanej strukturze sprawia, Ŝe długie łańcuchy polideoksyrybonukeinowe nie są sztywnymi helikalnymi zwojami cylindrycznymi, lecz tworzą liczne zagięcia, struktury, tzw. spinki do włosów lub superhelikalne skręty. RóŜnorodność strukturalna fragmentów DNA zwiększa jego zdolność do rozpoznawania i oddziaływania z innymi składnikami komórki. Większość sekwencji DNA eukariotycznego stanowi kompleks nukleoproteinowy, głównie w formie nukleosomów.

330

Rdzeń nukleosomu stanowi oktamer złoŜony z ośmiu histonów, mianowicie H2A, H2B, H3 i H4, z których kaŜdego jest po dwa. Oktamer owinięty jest lewoskrętnie przez łańcuch 146 par zasad azotowych, stanowiący 1,75 skrętu helisy DNA. Poszczególne nukleosomy połączone są fragmentem DNA, zwanym łącznikiem, zawierającym od 40 do 80 par zasad. Histon H1 znajduje się poza oktamerem, moŜe zewnętrznie „ochraniać” krótkie fragmenty DNA nukleosomu w miejscach, od których zaczynają się łączniki. Histony neutralizują wzajemne odpychania ujemnych ładunków obecnych na rdzeniach cukrowo-fosforanowych. Ponadto, umoŜliwiają ciasne upakowywanie nici DNA do róŜnych form skondensowanej heterochromatyny, aŜ do chromosomu, który jest maksymalnie skondensowaną formą DNA. Rozwinięcie tych struktur ma miejsce wówczas, gdy DNA uczestniczy w replikacji lub transkrypcji. Właściwa organizacja nukleosomów i innych kompleksów białkowych z DNA wymaga działania równieŜ białek „opiekuńczych”, tzw. chaperonów (fonetycznie: czaperonów).

Kwasy rybonukleinowe Cząsteczki kwasów rybonukleinowych są znacznie mniejsze od cząsteczek DNA, ich masa cząsteczkowa osiąga 35 000 daltonów. Wszystkie cząsteczki RNA są formami jednoniciowymi, niektóre mogą tworzyć rejony dwuniciowe, stabilizowane wiązaniami wodorowymi między komplementarnymi zasadami azotowymi. Rejony dwuniciowe w obrębie pojedynczej nici polinukleotydowej powstają między sekwencjami komplementarnymi, które są rozmieszczone w róŜnych rejonach liniowej struktury pierwszorzędowej, oddziałują ze sobą parami i są stabilizowane wiązaniami wodorowymi. Oddziaływania te sprawiają, Ŝe pojawiają się „sparowane” rejony dwuniciowe w obrębie pojedynczej nici polinukleotydowej. Rejony sparowane nadają określoną strukturę przestrzenną cząsteczce. RNA zamiast deoksyrybozy zawiera rybozę, a zamiast tyminy uracyl. WyróŜnia się trzy główne typy RNA, z których kaŜdy spełnia odmienne funkcje, są to: informacyjny RNA (mRNA), transportujący RNA (tRNA) i rybosomalny RNA (rRNA). Wszystkie wymienione typy kwasów rybonukleinowych eukariotycznych są produktami róŜnorodnych modyfikacji chemicznych, które mają miejsce po transkrypcji i składają się na proces określany mianem „dojrzewania” RNA, któremu podlega większość pierwotnych transkryptów (bezpośrednich produktów transkrypcji). Proces dojrzewania RNA obejmuje następujące zmiany: 1) usuwanie pewnych sekwencji nukleotydowych przez endonukleazy, rybozymy i egzonukleazy; 2) dodawanie nukleotydów do końca 5' i 3' pierwotnego transkryptu lub produktu jego rozcięcia; 3) chemiczne modyfikacje (głównie metylacje) niektórych nukleotydów w obrębie zasad azotowych lub reszt monocukrowych. Kwasy rybo-

331

nukleinowe oddziałują z białkami, tworząc kompleksy rybonukleoproteinowe (RNP).

mRNA Informacyjny RNA słuŜy jako matryca w syntezie białka. W komórce jest tyle specyficznych rodzajów cząsteczek mRNA, ile komórka syntetyzuje rodzajów łańcuchów polipeptydowych. Informacyjne RNA stanowią około 5% wszystkich kwasów rybonukleinowych w komórce. „Dojrzałe” cząsteczki mRNA mają podobny plan budowy w komórkach eukariotycznych. czapeczka

sekwencja kodująca

ogon poli(A)

P~P-N7CH3G

N6CH3A

N6CH3A

AAAA.....AAAAAA

Schematyczny plan budowy eukariotycznego mRNA

W budowie większości eukariotycznych mRNA charakterystyczne jest występowanie trzech stałych elementów, mianowicie czapeczki (ang. cap) znajdującej się na końcu 5', specyficznej sekwencji kodującej i „ogona poli(A)”, który występuje na końcu 3'. Czapeczkę stanowi reszta N7-metyloguanozyny o odwróconej orientacji (w porównaniu z typowymi wiązaniami 3'5'-fosfodiestrowymi), która połączona jest mostkiem 5'-5'-trifosforanowym, najczęściej z N6-metyloadenozyną. Ta szczególna chemiczna modyfikacja powstaje kotranskrypcyjnie, zanim syntetyzowany RNA osiągnie długość 20–30 nukleotydów. Dwa pierwsze nukleotydy za czapeczką mogą być metylowane, zarówno w pozycji atomu azotu zasady azotowej (zwykle jest to N6 adeniny), jak i w pozycji C2' rybozy. Funkcja czapeczki polega na ochronie pre-mRNA oraz mRNA przed działaniem 5'-egzonukleaz, ponadto uczestniczy w procesie dojrzewania mRNA (np. w splicingu), w transporcie mRNA z jądra do cytoplazmy i translacji. Sekwencja kodująca (czyli rejon ulegający translacji) jest specyficzna dla kaŜdego rodzaju mRNA, tym samym odmienne rodzaje mRNA róŜnią się sekwencją kodującą. Sekwencja kodująca mRNA jest komplementarna do sekwencji eksonów pojedynczej nici matrycowej DNA, przy czym U jest komplementarna do A w nici DNA. Tym samym sekwencja kodująca mRNA stanowi kopię eksonów nici kodującej DNA, jednak w mRNA występuje U wszędzie tam, gdzie w kodującej nici DNA występuje T.

332

HO OH C C HC H H CH O H2 N

5'

N

N

H2 C O

NH2 O P O

HN

N O

CH3

O O P O

O O P

N

N

5'

N

O CH2

N

O O HC H H CH 2' 3' C C

O

OCH 3 O

O

NH CH 2

N

O

P O

O

O HC H H CH 3' C C OH

Struktura chemiczna czapeczki mRNA i przyległych nukleotydów

W procesie dojrzewania sekwencja kodująca jest składana z eksonów premRNA, po wycięciu sekwencji interweniujących, zwanych intronami (niekodujących), które przerywają sekwencje kodujące zwane eksonami. Proces rozcinania pre-mRNA, wycinania intronów i składania eksonów nazywa się składaniem mRNA (ang. splicing). Reakcje te zachodzą w jądrze komórkowym i wymagają obecności w intronie sekwencji na końcu 5'-GU-3', a na końcu 3' sekwencji 5'-AG-3', poprzedzonej sekwencją bogatą w pochodne pirymidyny, zwaną traktem polipirymidynowym, przed którą ma znajdować się sekwencja rozgałęzienia. Podczas składania mRNA, w wyniku ataku grupy 2'-hydroksylowej z reszty nukleotydu adeninowego sekwencji rozgałęzienia na wiązanie z udziałem G z 5' końca, powstaje charakterystyczna cząsteczka o kształcie lassa oraz wolny ekson 1. Po czym następuje rozcięcie po reszcie G w sekwencji AG na końcu 3' intronu, w wyniku czego intron zostaje uwolniony w postaci lassa i zdegradowany, a dwie sekwencje eksonowe łączą się ze sobą. Podczas dojrzewania alternatywnego moŜe mieć miejsce przekształcanie pre-mRNA w więcej niŜ jeden rodzaj dojrzałego mRNA, dzięki róŜnym sposobom składania (tzw. alternatywne składanie). Alternatywne składanie mRNA wynika ze zróŜnicowanego uŜycia miejsc „splicingowych” 5' i 3', dzięki wykorzystaniu róŜnych promotorów, uŜyciu róŜnych miejsc poli(A) i ostatecznie z pozostawienia jednych, a usunięcia innych eksonów. 333

W wyniku alternatywnego składania z jednego pre-mRNA powstają odmienne sekwencje kodujące w mRNA dzięki róŜnym kombinacjom połączeń eksonów. Za alternatywne składanie mRNA odpowiedzialne są czynniki swoiste dla określonych typów komórek. Proces ten katalizowany jest przez kompleksy białek z małymi jądrowymi RNA (snRNP). Niezwykłą formą dojrzewania mRNA jest redagowanie RNA, w wyniku którego ulega zmianie sekwencja pierwotnego transkryptu. Przykładowo, podczas redagowania pre-mRNA apolipoproteiny-B w komórkach jelita u człowieka następuje pojedyncza zmiana zasady C na U, czego konsekwencją jest powstanie kodonu stop w mRNA i skrócenie sekwencji kodującej do 6666 nukleotydów z długości 14 500 nukleotydów, której produktem jest apolipoproteina B48 o wielkości 241 kDa. W komórkach wątroby pre-mRNA apolipoproteiny-B nie ulega redagowaniu, dlatego produktem sekwencji kodującej tego mRNA jest apolipoproteina B100 o wielkości 512 kDa. Ogon poli(A) to sekwencja 200–250 nukleotydów adeninowych, znajdująca się na końcu 3' mRNA. Ogon poli(A) tworzy się posttranskrypcyjnie (w procesie dojrzewania mRNA), w wyniku cięcia pre-mRNA, a następnie dodania łańcucha reszt nukleotydów adeninowych, dzięki obecności specyficznej sekwencji w DNA (tym samym w odpowiednim transkrypcie pre-mRNA), zwanej sygnałem poliadenylacji. Niektóre mRNA mają więcej niŜ jedno miejsce poliadenylacji, tzw. alternatywne miejsca poli(A), dzięki temu róŜne miejsca mogą być uŜyte w odmiennych warunkach, np. w róŜnych typach komórek, dając ostatecznie róŜne dojrzałe mRNA. Ogon poli(A) stabilizuje mRNA, umoŜliwia przyłączenie białek zabezpieczających ten kwas rybonukleinowy przed działaniem 3'-egzonukleaz. Ogon poli(A) moŜe pomagać w translacji mRNA.

tRNA Cząsteczki tRNA pełnią funkcje cząsteczek adaptorowych, które dostarczają aminokwasy do rybosomów, gdzie tworzone są wiązania peptydowe między aminokwasami w kolejności określonej przez mRNA. Transportujące RNA stanowią około 15% wszystkich kwasów rybonukleinowych w komórce. Istnieje przynajmniej jeden tRNA dla kaŜdego z dwudziestu aminokwasów (łącznie 61 tRNA). Cząsteczki tRNA są małe, jak na kwasy nukleinowe, ich liniowa sekwencja moŜe mieć długość od 60 do 95 nukleotydów, zazwyczaj 76. Na końcu 5' cząsteczki znajduje się monofosforan, zwykle przy guanozynie, a na końcu 3' stała trójnukleotydowa sekwencja 5'-CCA-3'. W sekwencji tej do grupy -OH przy C2' lub C3' rybozy nukleotydu adeninowego przyłącza się aminokwas wiązaniem estrowym. Sekwencja 5'-CCA-3 prokariotycznych tRNA jest zakodowana w genie, natomiast 334

u eukariota dodawana jest enzymatycznie podczas posttranskrypcyjnego procesu dojrzewania pre-tRNA. W strukturze pierwszorzędowej tRNA stwierdza się wiele zmodyfikowanych nukleozydów, które mogą stanowić nawet 20% wszystkich nukleotydów w cząsteczce. Zmodyfikowanymi nukleozydami, powszechnie występującymi w tRNA, są pseudorydyna, rybotymina, dihydrourydyna, inozyna, N6-izopentenyloadenozyna, 4-tiourydyna, wszystkie wprowadzane są posttranskrypcyjnie w procesie dojrzewania. W cząsteczce tRNA znajduje się 15 niezmiennych nukleotydów. Struktura pierwszorzędowa tRNA zawiera liczne, liniowo oddalone sekwencje komplementarne, umoŜliwiające powstawanie rejonów dwuniciowych, nadających określoną strukturę przestrzenną cząsteczce tRNA. Struktura drugorzędowa typu liścia koniczyny jest charakterystyczna dla wszystkich tRNA. W strukturze tej rejony komplementarne cząsteczki oddziałują ze sobą, tworząc cztery ramiona i trzy pętle. Ramiona zawierają sparowane nukleotydy (połączone wiązaniami wodorowymi w komplementarne pary), natomiast pętle tworzą niesparowane i w większości niezmienne nukleotydy. Końce 5' i 3' polirybonukleotydu tRNA tworzą rejon (z 7 par nukleotydów) sparowany wiązaniami wodorowymi, który nazywa się ramieniem akceptorowym aminokwasu. Następne, bardzo krótkie ramię, które składa się z 3 lub 4 par kom3’ A C C

5’p

G

PĘTLA DHU

PĘTLA TΨC

G T

Ψ

G C

PĘTLA ANTYKODONOWA

335

plementarnych nukleotydów sparowanych wiązaniami wodorowymi, poprzedza pętlę dihydrourydylową (DHU). Jej nazwa wynika z obecności zmodyfikowanej zasady dihydrouracylu. Pętla ta moŜe składać się z 7–10 nukleotydów. Po przeciwnej stronie ramienia akceptorowego znajduje się ramię antykodonowe, składające się z 5 par komplementarnych nukleotydów sparowanych wiązaniami wodorowymi, zakończone pętlą antykodonową. Pętla ta zawiera 7 nukleotydów, z których trzy centralne tworzą antykodon, komplementarny do trójnukleotydowego kodonu określonego aminokwasu, znajdującego się w sekwencji kodującej mRNA. Obecność inozyny w antykodonie umoŜliwia cząsteczce tRNA rozpoznawanie więcej niŜ jednego kodonu. Ramię zmienne (dodatkowe) jest najbardziej zmiennym elementem w strukturze poszczególnych cząsteczek tRNA. MoŜe mieć róŜną długość, od bardzo słabo zaznaczonej, składającej się z 3 nukleotydów do długiego ramienia utworzonego aŜ z 21 nukleotydów. Długie ramię zmienne moŜe zawierać rejon sparowany, składający się z 7 par nukleotydów. Ramię TΨ Ψ C, składające się z 5 par nukleotydów sparowanych zakończone jest pętlą TΨ Ψ C, utworzoną z 7 niesparowanych nukleotydów, wśród których niezmiennymi nukleotydami są GTΨC. Większość niezmiennych nukleotydów znajduje się w pętlach i nie ma istotnego znaczenia w tworzeniu struktury drugorzędowej, lecz biorą udział w tworzeniu trzeciorzędowych wiązań wodorowych, które stabilizują strukturę trzeciorzędową tRNA. Tworzenie komplementarnych par między nukleotydami niezmiennymi pętli DHU i pętli TΨC umoŜliwia cząsteczce tRNA przybranie konformacji przestrzennej (struktury III-rzędowej), przypominającej odwróconą literę L, zawierającą na jednym końcu (dłuŜszym) antykodon, a na drugim (krótszym) miejsce akceptorowe dla aminokwasu. Wszystkie dojrzałe tRNA powstają z dłuŜszych pierwotnych transkryptów, tzw. pre-tRNA, w procesie dojrzewania. Reakcje składające się na proces dojrzewania tRNA u eukariota polegają na 1) odcięciu sekwencji liderowej z końca 5'; 2) odcięciu dwóch nukleotydów z końca 3'; 3) dodaniu do końca 3' sekwencji CCA; 4) wycięciu centralnego intronu z cząsteczki pre-tRNA; 5) chemicznych modyfikacjach zasad azotowych. Procesy te katalizują egzonukleazy i endonukleazy (RNazy D, E, F, P) oraz enzymy modyfikujące zasady. RNaza P jest endonukleazą, składającą się z jednej cząsteczki RNA i jednej białka (jest więc RNP), za aktywność katalityczną odpowiedzialna jest cząsteczka RNA (rybozym), która przeprowadza dojrzewanie końca 5' tRNA. Rybozymy to katalityczne cząsteczki RNA, czyli biokatalizatory, zdolne do katalizowania chemicznej reakcji w nieobecności białka. W przypadku RNazy P, jej składnik białkowy przypuszczalnie pomaga katalizować reakcję in vivo, ponie-

336

waŜ in vitro rybozym RNazy P wymaga większego stęŜenia jonów Mg2+ od stęŜenia magnezu obecnego w komórkach.

rRNA Rybosomalne RNA są jednoniciowymi polirybonukleotydami, występującymi w komórkach jako główne składniki rybosomów oraz jąderka. Stanowią około 80% komórkowego kwasu rybonukleinowego. Masa cząsteczkowa większości rRNA jest bardzo duŜa, poniewaŜ pojedyncza cząsteczka moŜe zawierać kilka tysięcy nukleotydów, z wyjątkiem nielicznych, których pojedyncza cząsteczka posiada 121 lub 158 nukleotydów. Charakterystyczną modyfikację chemiczną dla cząsteczek rRNA stanowi metylacja, wykryto 24 swoiste metylacje zasad azotowych, przy czym grupa metylowa dodawana jest głównie do pierścienia adeniny. Ponadto, często obserwuje się metylację prowadzącą do 2'-O-metylorybozy, która moŜe zachodzić w ponad 100 miejscach cząsteczki rRNA. Reakcje metylacji, zachodzące w jądrze komórkowym, przeprowadzają niskocząsteczkowe cząstki RNP, których snRNA są komplementarne do rejonów rRNA, z którymi tworzą pary, definiując w ten sposób miejsca metylacji. Aktywnym donorem grup metylowych jest S-adenozylometionina. Struktura drugorzędowa wszystkich cząsteczek rRNA wyróŜnia się obecnością sparowanych rejonów dwuniciowych, tzw. ramion, poprzedzielanych rejonami niesparowanymi, jednoniciowymi, tzw. pętlami. Obecność w

5’

3’

PĘTLE RAMIONA

polirybonukleotydzie rejonów ramion i pętli sprzyja specyficznym oddziaływaniom i wiązaniu białek, tym samym tworzeniu kompleksów rybonukleoproteinowych RNP, mających istotne znaczenie w formowaniu rybosomów.

337

W komórkach eukariotycznych występują 4 rodzaje rRNA. Wielkocząsteczkowy rRNA, którego łańcuch polirybonukleinowy tworzy 4718 nukleotydów, określa się jako 28S rRNA. [Wielkość S (Swedberg) jest liczbową wartością współczynnika sedymentacji (s), zdefiniowanego szybkością, z jaką makrocząsteczki sedymentują (opadają) w polu wirowania (przyspieszenia odśrodkowego, tysiąckrotnie większego od pola grawitacji ziemskiej), osiąganego w ultrawirówkach. Wartości S są nieaddytywne, poniewaŜ zaleŜą od masy i kształtu cząsteczki.]

Mniejszą cząsteczką jest 18S rRNA, która składa się z 1874 reszt nukleotydowych. Niskocząsteczkowe rRNA są dwa, jeden z nich, mianowicie 5,8S rRNA (składający się z 158 nukleotydów), występuje tylko u eukariota, drugi natomiast, 5S rRNA (składający się z 121 nukleotydów), poza tym, Ŝe jest obecny w komórkach eukariotycznych, charakterystyczny jest równieŜ dla komórek prokariotycznych. W komórkach prokariotycznych występują 3 rodzaje rRNA, mianowicie: 23S rRNA, 16S rRNA i 5S rRNA. Dojrzałe cząsteczki rRNA powstają z pierwotnego transkryptu pre-rRNA, pojedynczego długiego prekursora, w wyniku serii modyfikacji i cięć w tzw. zewnętrznych transkrybowanych sekwencjach lub wewnętrznych transkrybowanych sekwencjach rozdzielających, składających się na proces dojrzewania. W komórkach ssaków pierwotny transkrypt o wielkości rzędu 13 500 nukleotydów zawiera po jednej kopii 18S rRNA, 5,8S rRNA i 28S rRNA. Natomiast eukariotyczny 5S rRNA powstaje z odrębnego genu w procesie transkrypcji katalizowanej przez polimerazę RNA (III), odmienną od polimerazy RNA (I), która transkrybuje prerRNA dla trzech pozostałych rybosomalnych kwasów rybonukleinowych. Proces dojrzewania transkryptu 5S rRNA jest znacznie ograniczony lub teŜ nie zachodzi wcale. Wszystkie trzy prokariotyczne rRNA transkrybowane są przez jedną polimerazę RNA III w formie pojedynczej nici pierwotnego transkryptu, na której znajdują się równieŜ sekwencje pre-tRNA. Proces dojrzewania pre-rRNA katalizowany jest enzymatycznie, w tym równieŜ przez rybozymy. Udowodniono (przynajmniej u jednego przedstawiciela eukariota), Ŝe występujący w pre-rRNA u Tetrahymena termophila intron przeprowadza autokatalityczny splicing. W układzie in vitro intron ten wymaga kofaktora, którym jest guanozyna lub jej ufosforylowane pochodne, natomiast zupełnie nie potrzebuje obecności białek do wycięcia się z prekursora. Intron ten spełnia kryteria typowego rybozymu. Rybozym ten, poza własnością samowycinania, posiada zdolność katalizowania ligacji uwolnionych fragmentów rRNA. Rybozymy, czyli katalityczne, krótkie cząsteczki RNA, charakteryzują się minimalnymi wymogami sekwencyjnymi, koniecznymi do ujawnienia swych własności. Fakt ten stał się podstawą konstruowania syntetycznych rybozymów, które mogą rozcinać inne cząsteczki RNA, w nadziei, Ŝe będzie moŜna je stosować w terapii, do inaktywacji odpowiednich mRNA, wirusów i do zabijania komórek nowotworowych. 338

Dojrzewające cząsteczki rRNA zwijają się w przestrzeni, łączą się z białkami rybosomowymi, podlegając samoorganizacji prowadzącej do wytworzenia rybosomów. Oznacza to, Ŝe informacje o strukturze rybosomów są zawarte w strukturze ich składników. Rybosomy to typowe RNP, czyli kompleksy rybonukleoproteinowe o olbrzymiej masie cząsteczkowej, rzędu 2,75 ⋅ 106 daltonów u prokariota (70 S) i rzędu 4,5 ⋅ 106 daltonów u eukariota (80 S). KaŜdy rybosom składa się z dwóch podjednostek, większej i mniejszej. Rybosomy eukariotyczne w swej duŜej podjednostce (o wielkości 60S, czyli 3 ⋅ 106 Da) zawierają trzy rodzaje rRNA (28S, 5,8S, 5S) i około 45 róŜnych białek, natomiast w małej podjednostce (o wielkości 40S, czyli 1,5 ⋅ 106 Da) jeden rodzaj rRNA (18S) oraz około 30 róŜnych białek. Rybosomy prokariotyczne w swej duŜej podjednostce (o wielkości 50S, czyli 1,7 ⋅ 106 Da) zawierają dwa rodzaje rRNA (23S, 5S) oraz około 31 róŜnych białek, natomiast w małej podjednostce (o wielkości 30S, czyli 0,95 ⋅ 106 Da) jeden rodzaj rRNA (16S) oraz około 21 róŜnych białek.

Własności chemiczno-fizyczne kwasów nukleinowych Cząsteczki DNA są bardzo długie w porównaniu do swej średnicy i stosunkowo sztywne, dlatego roztwory ich mają duŜą lepkość. Kwasy nukleinowe wykazują róŜną wraŜliwość na środowisko zasadowe i kwasowe. Cząsteczki DNA są odporne na działanie mocnych zasad. Pozostawienie DNA w roztworze 1M NaOH przez 20–40 godzin w temperaturze 37°C nie dostarcza Ŝadnych produktów hydrolizy zasadowej. W tych warunkach RNA rozpada się całkowicie do mieszaniny 2’- i 3’- monofosfonukleozydów. Następuje to dzięki obecności grupy –OH przy atomie C2' rybozy, która w środowisku zasadowym uczestniczy w tworzeniu nietrwałych wewnątrzcząsteczkowych wiązań fosfodiestrowych w cyklicznych nukleozydo-2’,3’-fosforanach. Wiązania te rozpadają się z równym prawdopodobieństwem do nukleozydo-2’- i nukleozydo-3’-fosforanów. Brak grupy –OH przy atomie C2' deoksyrybozy uniemoŜliwia powstanie cyklicznych fosforanów nukleozydów i jest podstawą oporności kwasów deoksyrybonukleinowych na działanie zasad. Hydroliza kwasowa kwasów nukleinowych dostarcza róŜnych produktów zaleŜnie od stęŜenia stosowanych kwasów, czasu trwania hydrolizy i temperatury. Wiązania glikozydowe róŜnią się wraŜliwością na działanie kwasów, mianowicie: w nukleotydach purynowych wiązania glikozydowe są bardziej labilne niŜ w nukleotydach pirymidynowych.

339

Krótkotrwałe ogrzewanie (w 100°C), zarówno DNA, jak i RNA z kwasami (np. HCl) o niskich stęŜeniach (ok. 1M) początkowo dostarcza kwasów apurynowych, będących łańcuchami polinukleotydowymi, pozbawionymi zasad purynowych. W dalszym etapie tej hydrolizy kwasowej (po 1 godz.) powstają mononukleotydy pirymidynowe, pentozy i kwas fosforowy. Pod wpływem działania mocnych kwasów mineralnych (np. 72% roztwór HClO4) i podwyŜszonej temperatury (100°C przez 1 godz.) zarówno z DNA, jak i z RNA uwolnione zastają zasady purynowe oraz pirymidynowe, pentozy, a takŜe kwas fosforowy, tym samym ulegają całkowitej hydrolizie. Hydroliza enzymatyczna kwasów nukleinowych polega na rozkładzie ich wiązań fosfodiestrowych przez enzymy z grupy endo- lub egzo- rybonukleaz lub deoksyrybonukleaz. W zaleŜności od rodzaju uczestniczącego w reakcji enzymu powstają róŜne produkty, nukleozydo-5'-monofosforany lub nukleozydo-3'-monofosforany. Uwolnienie zasad azotowych z połączeń glikozydowych przeprowadzają specyficzne nukleozydazy. Szczególną grupę endonukleaz stanowią enzymy restrykcyjne, zwane restryktazami. Są to enzymy syntetyzowane przez róŜnorodne szczepy bakterii, których zadaniem jest degradacja obcego (np. wirusowego) DNA w komórce bakteryjnej. Enzymy te charakteryzują się prawie absolutną specyficznością, rozpoznają w nici DNA sekwencję, zazwyczaj 4–8 nukleotydową, w obrębie której rozcinają specyficzne wiązanie fosfodiestrowe. W genomie bakteryjnym sekwencje te zwykle są metylowane na reszcie adeniny lub cytozyny, co zabezpiecza DNA gospodarza przed degradacją przez własne enzymy restrykcyjne. Enzymy restrykcyjne rozpoznają i rozszczepiają sekwencje palindromowe w DNA. Sekwencja palindromowa dwuniciowego DNA to taka sekwencja nukleotydów, która jest identyczna, gdy odczytuje się ją na obu niciach w kierunku 5'→3'. Niektóre restryktazy, w wyniku hydrolizy DNA, dostarczają fragmenty zakończone jednoniciowymi sekwencjami, zwanymi potocznie „końcami kohezyjnymi”. Końce kohezyjne fragmentów DNA wytworzonych skutkiem działania tego samego enzymu restrykcyjnego są zawsze komplementarne do siebie, niezaleŜnie od źródła pochodzenia preparatu DNA poddawanego hydrolizie. Takie produkty hydrolizy DNA moŜna połączyć ze sobą na zasadzie komplementarności poprzez jednoniciowe końce kohezyjne. Fakt ten sprawił, Ŝe enzymy restrykcyjne stały się waŜnym narzędziem w biologii molekularnej, umoŜliwiającym nie tylko wycinanie, ale i łączenie fragmentów DNA w rekombinowane cząsteczki.

Denaturacja i renaturacja DNA Proces denaturacji kwasów nukleinowych polega na zniszczeniu ich struktury II- i III-rzędowej. Czynnikami denaturującymi DNA są: wysoka wartość pH, alkohole, fenole, wysoka temperatura, ultradźwięki, promieniowanie. 340

Związkami powszechnie stosowanymi w analizie kwasów nukleinowych w celu spowodowania denaturacji kwasów nukleinowych są formamid (HCONH2) i mocznik (H2NCONH2). Związki te powodują rozrywanie wiązań wodorowych większości cząsteczek wody i wykluczają umiejscawianie się wody pomiędzy zasocjowanymi warstwowo hydrofobowymi zasadami azotowymi, doprowadzając do denaturacji dwuniciowych struktur kwasów nukleinowych. Wpływ środowiska zasadowego polega na zmianie tautomerycznych form zasad azotowych w kwasach nukleinowych, w kierunku form enolowych (laktymowych), poniewaŜ cząsteczka traci proton, a ładunek ujemny jest stabilnie zlokalizowany na atomie tlenu. Ma to wpływ na wiązania wodorowe między parami zasad azotowych, powodując ich rozerwanie, tym samym zniszczenie dwuniciowej struktury DNA, czyli jego denaturację. Pod wpływem ogrzewania struktura podwójnej helisy DNA ulega podobnemu zniszczeniu i rozpada się na pojedyncze nici. Rozpad struktury helikalnej następuje w określonej temperaturze, zwanej temperaturą topnienia DNA.

Zmiana absorbancji przy 260 nm

Temperatura topnienia (Tm) określonych cząsteczek DNA, to taka wartość, przy której dochodzi do utraty połowy helikalnej struktury DNA, z towarzyszącym nagłym wzrostem pochłaniania światła w ultrafiolecie (przy 260 nm). Na przed-

75

80

85

temp.

stawionym powyŜej wykresie temperatura topnienia analizowanego preparatu DNA wynosi 85°C. Jej wartość zaleŜy od składu zasad azotowych DNA, mianowicie im wyŜsza zawartość par CG, tym wyŜsza temperatura topnienia.

341

Zawartość GUANINY + CYTOZYNY (%)

100

80

60

40

20

0 70

80

90

100

110

temperatura topnienia

Denaturacja jest odwracalna, po usunięciu czynnika denaturującego, ma miejsce odtworzenie komplementarnej struktury podwójnej helisy DNA, a proces ten nazywa się renaturacją. Zdenaturowany DNA w temperaturze nieco niŜszej od temperatury topnienia, po powolnym schładzaniu w temperaturze pokojowej ulega prawie całkowitej renaturacji do struktury dwupasmowej. Szybkość renaturacji wyraŜa się jako iloczyn stęŜenia (mol/l) i czasu (s), u prokariota zazwyczaj jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości genomu. Jednocześnie szybkość renaturacji DNA okazuje się tym większa, im wyŜsza zawartość w nim powtarzających się sekwencji, np. mysi satelitarny DNA (10% mysiego DNA) renaturuje w ciągu kilku sekund, znacznie szybciej od najmniejszych cząsteczek DNA (np. faga T4, lub E.coli). Natomiast DNA zawierający sekwencje unikatowe, nie powtarzające się (np. 70% mysiego DNA) renaturuje bardzo wolno. Podczas renaturacji łączenie w podwójne helisy pojedynczych łańcuchów polinukleotydowych, pochodzących z róŜnych kwasów nukleinowych (zarówno typu DNA-DNA, jak i DNA-RNA), nazywa się hybrydyzacją. Tworzenie hybryd jest moŜliwe między podobnymi (spokrewnionymi) łańcuchami polinukleotydowymi, które na długich odcinkach cząsteczki mają komplementarne sekwencje zasad azotowych. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych wykorzystywana jest jako metoda w biologii molekularnej.

342

0

C dsDNA

0

C

0

C

ssDNA

Denaturacja i renaturacja termiczna DNA

Spektroskopowe właściwości kwasów nukleinowych Kwasy nukleinowe, podobnie jak nukleotydy, nukleozydy i zasady azotowe, selektywnie pochłaniają światło w nadfiolecie (UV), z maksimum przypadającym na 260 nm. Właściwość ta wynika z obecności w omawianych związkach układów aromatycznych: purynowego i pirymidynowego, zawierających sprzęŜone wiązania podwójne oraz heteroatomy.

343

Zdolność kwasów nukleinowych do absorpcji światła wykorzystuje się do wykrywania, ilościowego oznaczania oraz określania stopnia czystości preparatów kwasów nukleinowych. Absorbancja kwasów nukleinowych nie jest addytywną sumą absorbancji wszystkich zasad azotowych, wchodzących w ich skład, rzeczywista molowa absorpcja okazuje się niŜsza o około 40% od wartości teoretycznie obliczonej na podstawie składu. Zjawisko to nosi nazwę efektu hipochromowego, który wynika z helikalnego uporządkowania przestrzennego nici polinukleotydowych, opisanego strukturą drugorzędową i trzeciorzędową. Widma absorpcyjne kwasów rybonukleinowych i deoksyrybonukleinowych są bardzo podobne. Absorbancja przy 260 nm jest najmniejsza dla dwuniciowego DNA (dsDNA), większa dla jednoniciowego DNA (ssDNA) lub RNA i największa dla wolnych nukleotydów.

jednoniciowy

Absorbancja

dwuniciowy

220

260

300

λ nm

Cząsteczki jednoniciowe DNA są produktami denaturacji dwuniciowych cząsteczek DNA i silniej absorbują światło o długości fali 260 nm niŜ cząsteczki dwuniciowe DNA. Zjawisko to nosi nazwę efektu hiperchromowego, który jest konsekwencją obniŜenia uporządkowania przestrzennego nici polinukleotydowych. Wielkość efektu hiperchromowego jest proporcjonalna do ilości nukleotydów znajdujących się w obrębie helikalnych fragmentów cząsteczki, które uległy w tym procesie zniszczeniu. Renaturacji całkowitej DNA do struktury dwupasmowej towarzyszy efekt hipochromowy. Szybkie schłodzenie zdenaturowanego preparatu DNA, raczej utrwala struktury jednoniciowe. Takie ssDNA mogą splatać się swymi krótkimi regionami komplementarnymi pojedynczej nici, w nieznacznym natomiast stopniu powstają dwuniciowe struktury, stabilizowane wiązaniami wodorowymi, dlatego w tych warunkach efekt hipochromowy jest raczej niewielki.

344

Denaturacji i renaturacji DNA, poza zmianą absorpcji światła w ultrafiolecie, towarzyszą zmiany innych własności fizycznych, jak lepkość i skręcalność optyczna. Własności spektroskopowe makrocząsteczek pozwalają określić przybliŜoną czystość preparatów kwasów nukleinowych, na podstawie wartości stosunku absorbancji przy 260 nm i 280 nm (A260/A280). Wolny od zanieczyszczeń dwuniciowy DNA ma wartość współczynnika A260/A280 równą 1,8, czysty RNA około 2, czyste białka poniŜej 1 (około 0,5). Preparat DNA, którego wartość współczynnika A260/A280 jest większa od wartości 1.8, moŜe być zanieczyszczony RNA. Jeśli współczynnik A260/A280 ma wartość poniŜej 1.8, to preparat zanieczyszczony moŜe być białkami.

345

20.

CZYNNIKI MODYFIKUJĄCE STRUKTURĘ DNA Iwona śak, Paweł Niemiec

Czynniki chemiczne lub fizyczne o charakterze mutagennym są niejednorodną grupą. Wszystkie reagują bezpośrednio z DNA, wprowadzając modyfikacje w strukturze nukleotydów, leŜące u podstaw zmian sekwencji zasad azotowych. Chemicznymi czynnikami modyfikującymi strukturę DNA są: kwas azotawy, hydroksylamina, związki alkilujące, analogi zasad azotowych, barwniki akrydynowe, policykliczne węglowodory aromatyczne oraz reaktywne formy tlenu. Charakter mutagenny wykazują niektóre leki, np.: pewne klasy cytostatyków, antybiotyków oraz leków psychotropowych. Do fizycznych czynników mutagennych zalicza się promienie X, promienie α, β, γ, UV oraz hipertermię.

Chemiczne czynniki modyfikujące DNA Kwas azotawy jest związkiem, który deaminuje cytozynę, adeninę i guaninę w DNA. Deaminacja cytozyny przekształca ją w uracyl. Deaminacja kwasem azotawym adeniny przekształca ją w hipoksantynę. NH2 N O

O N

kwas azotawy deaminacja

N H

O

cytozyna NH2

O N

N N adenina

N H uracyl

N H

kwas azotawy

N

HN

deaminacja N

N H

hipoksantyna

Deaminacja kwasem azotawym guaniny przekształca ją w ksantynę.

346

O

O N

HN H2N

kwas azotawy deaminacja

N H

N

N

HN O

guanina

N N H H ksantyna

Jeśli modyfikacje te zostaną utrwalone podczas replikacji, wówczas w DNA ma miejsce zamiana zasad azotowych GC na AT, gdy nastąpiła deaminacja typu cytozyna→uracyl lub zamiana zasad azotowych AT na GC, gdy miała miejsce deaminacja typu adenina→hipoksantyna, lub zasad azotowych GC na AT, gdy zaszła deaminacja typu guanina→ksantyna w DNA. Hydroksylamina jest związkiem, który w układzie in vitro reaguje z cytozyną w DNA, przekształcając ją w związek podobny do uracylu, w konsekwencji moŜe prowadzić to do tranzycji C→T. N

OH O N

O

CH3 S O CH3

H2N C N

CH2CH3 N

HONH

O metylosulfonian metylu

hydroksylamina

O

etylonitrozomocznik

Do związków alkilujących naleŜą między innymi sulfonian dietylowy, sulfonian etylometylowy oraz metylosulfonian metylu, etylonitrozomocznik i diepoksybutan. Obecność grup metylowych, etylowych i innych w tych związkach, powoduje alkilację zasad azotowych. Największą wraŜliwość na alkilację w α-helisie wykazuje atom azotu (N7) guaniny. W dalszej kolejności mogą ulegać alkilacji atomy azotu guaniny (N1), adeniny (N1 i N3) i cytozyny (N3). Pod wpływem tych związków obserwuje się liczne tranzycje i transwersje typu: AT→TA, AT→GC, GC→CG, GC→AT, GC→TA. Analogiczny mechanizm działania (z mechanizmem bifunkcyjnych związków alkilujących) wykazują niektóre pochodne platyny (Pt), wykorzystywane w terapii przeciwnowotworowej. Do grupy tej naleŜy między innymi cis-diamino-dichloroplatyna (cDDP). H3N Cl-

Pt

ClNH3

trans -diamino-dichloroplatyna

ClCl-

Pt

NH3 NH3

cis -diamino-dichloroplatyna

Rezultatem budowy cDDP (centralnie połoŜony atom Pt z dwiema reaktywnymi grupami Cl-) jest skłonność do łatwej zamiany ligandów w środowisku wodnym i do formowania kompleksów z grupami funkcyjnymi o ujemnym ładunku, czyli z grupami nukleofilowymi w cząsteczkach substancji biologicznie czynnych. 347

MoŜna wyróŜnić dwa rodzaje oddziaływań tego cytostatyku z DNA. Są to monofunkcyjne oraz bifunkcyjne reakcje związku. Efekt monofunkcyjny dotyczy rzadkich przypadków, kiedy jeden z atomów chloru unieczynniany jest przez np. H2O (ryc. a) lub białko niehistonowe – ryc. b (około 0,15% wszystkich adduktów cDDP–DNA).

a)

b)

c)

d)

Bifunkcyjne działanie cis-platyny jest znacznie częściej spotykane i silniejsze od monofunkcyjnego. Reakcja wymiany obu ligandów moŜe mieć dwojaki charakter: jeden z nich polega na międzyniciowym wiązaniu krzyŜowym z zasadami naleŜącymi do dwóch róŜnych nici (ryc. c), stanowi mniej niŜ 1% całkowitej ilości adduktów cDDP–DNA. Drugi, najwaŜniejszy pod względem terapeutycznym, polega na wewnątrzniciowym wiązaniu krzyŜowym z zasadami azotowymi naleŜącymi do tej samej nici (ryc. d), stanowi około 98% wszystkich adduktów cDDP–DNA. Odległość między dwoma labilnymi ligandami Cl- w cząsteczce cDDP jest rzędu 0,33 nm, niemal taka sama, jak odległość między dwiema sąsiadującymi zasadami w α-helisie. Stąd w krzyŜowych wiązaniach wewnątrzniciowych dominują oddziaływania typu 1,2-wiązań wewnątrzniciowych. Oddziaływania te nie występują w izomerze trans-DDP, u którego odległość między dwoma labilnymi ligandami Cl- równa się 0,45 nm. Trans-diamino-dichloroplatyna nie wykazuje więc właściwości genotoksycznych. Analogi zasad azotowych są strukturalnie podobne do zasad występujących w cząsteczce DNA, dzięki temu mogą być rozpoznawane i wbudowywane podczas TA CGTTG A TGCA A C

5Bu TA CGBTG A TGCA A C

O Br HN

zmiana tautomeryczna TA CGBTG A TGCGA C

O

N H 5 - bromouracyl 5-bromouracyl ( 5Bu )

5Bu

348

replikacja TA CGCTG A TGCGA C

replikacji przez polimerazę DNA. Powodują one mutacje na skutek niewłaściwego parowania zasad. Przykładami tych związków mogą być 2-aminopuryna i 5-bromouracyl. Drugi z tych związków jest analogiem tyminy i normalnie ulega parowaniu z adeniną. 5-bromouracyl moŜe ulec przesunięciu tautomerycznemu, na skutek którego ulega parowaniu z guaniną. Po replikacji wyjściowa para TA zostaje zastąpiona przez GC. Barwniki akrydynowe wnikają (interkalują) między zasady azotowe w łańcuchu DNA, powodując ich rozsunięcie. Do grupy tej naleŜą między innymi oranŜ akrydyny, proflawina oraz akryflawina. Deformacje matrycy DNA, spowodowane interkalacją barwników akrydynowych, wywołują błędy replikacji, prowadzące w rezultacie do delecji lub insercji pojedynczych par nukleotydów, a w dalszej konsekwencji do mutacji typu zmiany ramki odczytu.

H 2N

N proflawina

NH 2

H 2N

N

NH 2

CH 3 akryflawina

Interkalatorem jest teŜ bromek etydyny. Cząsteczka tego związku zawiera cztery pierścienie o rozmiarach zbliŜonych do pary zasad puryna-pirymidyna. Mechanizm działania bromku etydyny jest podobny do mechanizmu działania barwników akrydynowych. Związek ten wykorzystuje się powszechnie jako barwnik DNA, stosowany w elektroforezie agarozowej. Pod wpływem UV związany z DNA bromek etydyny emituje światło o zabarwieniu pomarańczowym. NH2

H2N

N+

CH3Br-

bromek etydyny (EtBr)

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, takie jak np. benzo[a]piren czy benzo[a]antracen tworzą addukty z DNA. Są to produkty reakcji przyłączania (addycji) atomów lub cząsteczek (w tym przypadku wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych) do cząsteczki innego związku (w tym przypadku DNA).

349

O cytochrom P 450 aktywacja metaboliczna HO OH benzo[a]piren

7, 8 -diol - 9, 10 - tlenek

Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne zaliczane są do promutagenów, czyli związków, które stają się właściwymi mutagenami dopiero po metabolicznym przekształceniu w organizmie. W aktywacji metabolicznej często uczestniczy kompleks cytochromu P450. Podobne związki występują w dymie papierosowym, kawie, herbacie oraz przede wszystkim w pokarmach pochodzenia zwierzęcego. Najwięcej znajduje się ich w tzw. czerwonym mięsie. Addukty z DNA tworzą takŜe niektóre heterocykliczne aminy aromatyczne, powstające równieŜ podczas obróbki termicznej białkowych produktów Ŝywnościowych, szczególnie podczas długotrwałego smaŜenia mięsa w temperaturze powyŜej 150°C, skutkiem pirolizy aminokwasów (glicyna, kwas glutaminowy, tryptofan, fenyloalanina). Dzięki łączeniu się z kreatyniną i cukrem tworzą mutagenne heterocykliczne aminy aromatyczne, np:. 3-amino-1-metylo-5H-pirydo [4,3-b]indol (Trp-P-2), 2-amino-6-metylodipirydo [1,2-a:3’,2’-d]indol (Glu-P-1), 2-amino-5-fenylopirydyna. CH3 N NH2

N H ( Trp - P -2)

N N

NH2

N

NH2

2 - amino- 5 - fenylopirydyna

N CH3 (Glu - P-1) ( Glu-P-1)

Wolne rodniki reagujące z DNA to rodnik hydroksylowy (OH•), jon wodorkowy (H•) oraz anion ponadtlenkowy (O2-•). Główną, aktywną formą tlenu, odpowiedzialną za powstanie większości oksydacyjnych uszkodzeń cząsteczki DNA, jest rodnik hydroksylowy. Wynika to z jego silnie elektrofilowego charakteru, który warunkuje dwa podstawowe typy przemian składowych cząsteczki DNA: 350

reakcję addycji z wiązaniami π zasad azotowych oraz dehydratację cząsteczek deoksyrybozy. W przypadku zasad pirymidynowych w przewaŜającej większości reakcje te mają charakter addycji z atomami węgla, połączonymi wiązaniem podwójnym C5 = C6 w pierścieniu, lub oderwania atomu wodoru od grupy metylowej przy atomie węgla C5. Natomiast w wypadku zasad purynowych reakcja ta dotyczy wiązania przy atomie węgla C4 lub C8. Poza tym, generowanie w bezpośrednim sąsiedztwie chromatyny wysoce reaktywnych rodników tlenowych doprowadzić moŜe do powstania wiązań poprzecznych między DNA a białkami, znajdującymi się w jego otoczeniu. O

O CH3

HN

OH

N H

O

O

tymina

N H glikol tyminy

O

H2N

O N

HN

HN

OH N guanina

CH3 OH

HN

OH

N H

H2N

N H N

CHO

NH2

Fapy-guanina

Rodniki hydroksylowe, poza oddziaływaniem z zasadami azotowymi i białkami, mogą równieŜ reagować z pierścieniami deoksyrybozy. Rodnik hydroksylowy moŜe indukować oderwanie kaŜdego atomu wodoru związanego z cząsteczką cukru. Nie wszystkie uszkodzenia pierścienia cukrowego są wynikiem bezpośredniej reakcji rodnika hydroksylowego z cząsteczką cukru. DuŜa ich część moŜe powstawać takŜe na skutek oderwania atomu wodoru od cząsteczki cukru przez powstały rodnik zasady azotowej.

Fizyczne czynniki modyfikujące DNA Uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem jonizującym, czyli promieniowaniem o duŜej energii, powodują pękanie cząsteczki DNA, niszczenie cukrów oraz zasad. Promienie jonizujące, przechodząc przez komórki, wybijają elektrony z atomów i cząsteczek, powodując ich jonizację. Powstałe jony mogą inicjować rozmaite reakcje wolnorodnikowe (głównie z udziałem omawianego wcześniej rodnika hydroksylowego), uszkadzające DNA. Najgroźniejsze dla Ŝycia 351

komórki uszkodzenia stanowią przerwy dwuniciowe w DNA, poniewaŜ mogą być związane są z utratą fragmentu informacji genetycznej. Uszkodzenia te powstają pierwotnie, tj. w momencie, gdy pęknięcia pojedynczych nici zlokalizowane są naprzeciwko siebie w niewielkiej odległości, lub wtórnie, do czego dochodzi w trakcie naprawy uszkodzonej zasady, znajdującej się naprzeciw jednoniciowego pęknięcia DNA. Przyjmuje się, Ŝe po zadziałaniu na komórkę promieniowaniem γ w wysokości 1Gy (1Gy to jednostka dawki zaabsorbowanej, odpowiadająca energii 1 dŜula, przyjętej przez 1kg masy ciała) dochodzi do powstania 600–1000 pęknięć jednoniciowych DNA, 26–40 przerw dwuniciowych łańcucha DNA i 250 uszkodzeń tyminy. Promieniowanie ultrafioletowe, ze względu na małą energię i znaczną długość fali, ma mniejszą zdolność przenikania przez tkanki niŜ promieniowanie jonizujące, jednak promienie UV są intensywnie pochłaniane przez DNA. Głównym efektem działania promieni UV na DNA jest tworzenie dimerów pirymidynowych C-C, C-T a zwłaszcza dimerów T-T pomiędzy atomami C5 i C6 jednej reszty pirymidyny, a tymi samymi atomami węgla drugiej pirymidyny. O HN

2 O

O CH3

CH3 HN

promieniowanie UV N H

tymina

O CH3

O

NH N H

N H

O

dimer tymidynowy

Wynikiem tej reakcji jest powstanie pierścienia cyklobutanowego, który powoduje zbliŜenie sąsiadujących pirymidyn, odkształcenia w szkielecie cukrowofosforanowym DNA, prowadzące w rezultacie do delecji takiego dimeru.

352

21.

ANALIZA INSTRUMENTALNA

Instrumentalna analiza chemiczna powstała dzięki konstruowaniu precyzyjnych aparatów pomiarowych, które pozwalają wykorzystać własności fizykochemiczne związków do ich analizy jakościowo-ilościowej. Spośród róŜnych technik analizy instrumentalnej omówiono tylko niektóre, podstawowe z zakresu technik optycznych, elektrycznych i chromatograficznych.

ABSORPCJOMETRIA Iwona śak, Beata Sarecka Absorpcjometria jest analityczną techniką optyczną, wykorzystującą zdolność substancji chemicznych będących w roztworze do pochłaniania światła całą swą objętością oraz pomiar natęŜenia wiązki światła. Cząsteczki związków zdolnych do absorpcji promieniowania świetlnego są układami rezonansowymi, zdolnymi do drgań z częstotliwością zgodną z częstotliwością drgań fal elektromagnetycznych o określonej długości fali. RóŜne substancje pochłaniają promieniowanie zwykle o odmiennej długości fali, jeśli jednak pochłaniają fale tej samej długości, to z róŜną intensywnością. Substancje mogą pochłaniać promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie światła widzialnego (VIS od ang. visible), tzn. o długości od 400 do 750 nm (zakres kolorymetrii), lub nadfioletu (UV od ang. ultra violet), tzn. o długości od 200 do 400 nm, czy teŜ podczerwieni (IR od ang. infra red), obejmującej obszar powyŜej 750 nm: podczerwień bliska – zakres długości fal 750–2500 nm; podczerwień – 2,5–25 µm.; podczerwień daleka – powyŜej 25 µm do ułamków milimetra. Promieniowanie o długości fal 0,4–200 nm to daleki nadfiolet, który charakteryzuje się tym, Ŝe jest pochłaniany przez atomy tlenu, dlatego analizy w spektrofotometrze z tym zakresem wykonuje się po usunięciu z niego powietrza, czyli w próŜni. Źródłem promieniowania mogą być lampy spektralne (np. deuterowe, wodorowe, rtęciowe, sodowe), lasery lub lampy Ŝarowe. Lampy spektralne i lasery dają 353

widmo liniowe, natomiast lampy Ŝarowe widmo ciągłe. W celu otrzymania określonej długości fali uŜywa się odpowiednich monochromatorów. W monochromatorze znajduje się układ (pryzmat, siatka dyfrakcyjna lub filtry), który przez odpowiednie ustawienie na szczelinę wyjściową pozwala skierować wiązkę promieniowania o Ŝądanej długości fali. Ze szczeliny wyjściowej wiązka monochromatyczna wpada do pomieszczenia pomiarowego, w którym przechodzi przez odpowiednie naczynie (kuwetę) z roztworem zawierającym analizowany związek. Kuwety powinny być wykonane z materiału przezroczystego dla określonych długości fal. Najpowszechniejszym materiałem przezroczystym jest kwarc, stosowany dla fal o długości: 200–400 nm, 400–750 nm oraz 750–2500 nm. Poza tym, dla fal o długości 400–750 nm stosuje się równieŜ wysokojakościowe szkło, a dla dłuŜszych fal podczerwieni kryształy: NaCl (w zakresie 2,5–15 µm), KBr (do 25 µm), CsBr (w zakresie 25–40 µm) i specjalne gatunki polietylenu przezroczystego dla fal o długości w granicach 15–300 µm. Podstawę kolorymetrycznego oznaczania stęŜenia substancji w roztworze stanowi zaleŜność między intensywnością zabarwienia roztworu, a stęŜeniem zawartej w nim substancji. Metoda ta słuŜy do oznaczania stęŜenia substancji mających własną barwę. Barwa substancji zaleŜy od selektywnej absorpcji określonej długości światła widzialnego i jest barwą dopełniającą do pochłoniętej. Na zabarwienie roztworu składają się fale elektromagnetyczne nie zaabsorbowane przez analizowaną substancję, czyli promieniowanie przepuszczone. Przykładowo, czerwona barwa roztworu substancji moŜe być wynikiem pochłaniania zieleni, która jest barwą dopełniającą do czerwieni lub zdolności analizowanej substancji do przepuszczania wyłącznie promieniowania czerwonego. Podobnie Ŝółta barwa roztworu substancji moŜe być wynikiem pochłaniania fal niebieskich, które są barwą dopełniającą do Ŝółtej lub zdolności analizowanej substancji do przepuszczania wyłącznie promieniowania Ŝółtego. Roztwory substancji bezbarwnych to takie, w których Ŝaden z rodzajów promieni widzialnych nie ulega pochłonięciu. Substancje bezbarwne moŜna oznaczać ilościowo metodą kolorymetyczną, lecz po przeprowadzeniu ich w barwne pochodne na drodze stechiometrycznych reakcji chemicznych, które powinny przebiegać szybko i do końca, powinny być powtarzalne i specyficzne oraz łatwe do przeprowadzenia. Specyficzność reakcji zwykle określa uŜyty odczynnik barwiący, który powinien reagować tylko z badaną substancją i nie powinien wchodzić w reakcję z Ŝadną inną substancją obecną w roztworze. Powstała barwa powinna być: trwała, niewraŜliwa na światło, niepodatna na zmiany pH, niezaleŜna od zmian temperatury i nadmiaru odczynnika barwiącego. Efekty absorpcji w zakresie światła widzialnego i ultrafioletu obserwuje się w widmach związków zawierających grupy chromoforowe oraz ugrupowania 354

atomów z wielokrotnymi sprzęŜonymi wiązaniami nienasyconymi. Niektóre z nich przykładowo przedstawiono poniŜej.

\ C / \ C /

O

N―

\ C / ―C

/ C

―N

O

\ C /

S

―N

N―

\ C―

Na intensywność barwy związku wpływają równieŜ podstawniki, zwane grupami auksochromowymi, które przykładowo przedstawiono poniŜej. Mają one zdolność przesuwania maksimum absorpcji w kierunku fal dłuŜszych, zjawisko to zwane jest efektem batochromowym. ―CH3,

―NH2,

―OH,

―OCH3,

―SH,

―Cl,

―Br

Absorpcję promieniowania przez roztwory opisuje prawo Beera. NatęŜenie (Io) wiązki promieniowania, którą przepuści się przez warstwę roztworu substancji pochłaniającej światło, spada do wartości (I), gdy przejdzie przez roztwór. Stosunek I do Io nazywa się transmitancją (T) lub przepuszczalnością, wyraŜaną zwykle w procentach promieniowania przechodzącego przez analizowany roztwór: T=

I I0

T% =

I ⋅100 I0

Transmitancja moŜe przyjmować wartości od 0 do 100. Wartość T będzie największa (100% przepuszczalności światła), gdy nie będzie absorpcji światła przez roztwór, najmniejsza wartość T (0% przepuszczalności światła) oznacza całkowitą absorpcję promieniowania. Transmitancja nie jest prostoliniową funkcją stęŜenia substancji pochłaniającej światło w przeciwieństwie do absorbancji (A), innej wielkości pozwalającej ocenić spadek natęŜenia wiązki światła po przejściu przez warstwę roztworu substancji pochłaniającej światło. Absorbancja to logarytm odwrotności transmitancji: A = log

I 1 = log 0 = ε ⋅ c ⋅ 1 T I

gdzie: ε – współczynnik absorpcji; c – stęŜenie roztworu; l – grubość warstwy roztworu absorbującego w cm.

355

Absorbancja (A), zwana teŜ ekstynkcją (E) lub gęstością optyczną (D), równa się logarytmowi stosunku natęŜenia promieniowania padającego (Io) do natęŜenia promieniowania przepuszczonego (I). Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stanowi podstawowe prawo absorpcjometrii, zgodnie z którym absorbancja substancji pochłaniającej światło jest wprost proporcjonalna do stęŜenia i grubości warstwy roztworu, którego matematyczny zapis to: A = ε⋅⋅c⋅⋅l. Jeśli stęŜenie roztworu (mol/l) i grubość jego warstwy (w cm) są równe jedności, to wówczas współczynnik absorpcji (ε) równa się wartości mierzonej absorbancji, A = ε, dlatego nazywa się molowym współczynnikiem absorpcji. Dla bardzo wielu substancji bezpośredni pomiar A przy stęŜeniu 1 mol/l jest niemoŜliwy, dlatego wartość molowego współczynnika absorpcji oblicza się z pomiaru absorbancji przy stęŜeniu znacznie niŜszym, korzystając z zaleŜności: ε=

A l / mol ⋅ cm c⋅l

to

c=

A ε

l/ mol ⋅ cm

JeŜeli stęŜenie substancji pochłaniającej promieniowanie jest wyraŜone w gramach na litr, wówczas współczynnik nosi nazwę właściwego współczynnika absorpcji (α). Molowy współczynnik absorpcji zaleŜy od długości fali, temperatury i uŜytego rozpuszczalnika. Im większą wartość ma molowy współczynnik absorpcji danej substancji, tym mniejszą ilość tej substancji moŜna oznaczyć kolorymetrycznie. Znając wartość molowego współczynnika absorpcji analizowanej substancji i absorbancję roztworu o nieznanym stęŜeniu tej substancji moŜna obliczyć jej stęŜenie (wyraŜone w mol/l) na podstawie matematycznego zapisu prawa Bouguera-Lamberta-Beera, jednak obliczenia takie stosuje się rzadko, zwykle odczytuje się je ze sporządzonego wykresu kalibracyjnego. W celu stwierdzenia, czy dana substancja pochłania promieniowanie w danym zakresie długości fal, naleŜy dokonać pomiarów absorbancji dla kaŜdej długości fali z tego zakresu. Z otrzymanych pomiarów sporządza się wykres zaleŜności absorbancji od długości fali, który jest charakterystycznym dla danej substancji widmem absorpcyjnym, w danym zakresie długości fal. Na widmie znajduje się maksymalna wartość absorbancji dla określonej długości fali, przy której następnie dokonuje się pomiarów absorbancji roztworów wzorcowych i badanych danej substancji. JeŜeli substancja nie pochłania światła w danym zakresie długości fal, wartości absorbancji są równe lub bliskie zeru. Największą zaletą absorbancji jest jej wprost proporcjonalna zaleŜność od stęŜenia. Wykres tej zaleŜności w dostatecznie szerokim zakresie ma kształt krzywej logarytmicznej. W początkowym odcinku kaŜdej pojedynczej wartości absorbancji moŜna przyporządkować tylko jedną wartość stęŜenia. W miarę, jak wykres 356

staje się asymptotą krzywej, niemoŜliwe okazuje się przyporządkowanie pojedynczej wartości absorbancji tylko jednego stęŜenia, bo w miarę postępu krzywej, jednej wartości absorbancji moŜna przyporządkować nieskończenie wiele stęŜeń.

3 1 ABSORBANCJA

2

STĘśENIE Prawo Bouguera-Lamberta-Beera stosuje się tylko do początkowego odcinka wykresu zaleŜności absorbancji do stęŜenia. Jest on prostoliniowy i nazywa się wykresem kalibracyjnym (1), z którego moŜna odczytać szukane stęŜenie roztworu po zmierzeniu wartości jego absorbancji. W wykresie kalibracyjnym mogą zdarzać się odchylenia od prostoliniowej zaleŜności, mianowicie: ujemne (2) – gdy absorbancja zwiększa się wolniej wraz ze zwiększaniem stęŜenia, niŜ wynikałoby to z proporcjonalnej zaleŜności, lub dodatnie (3) – gdy absorbancja zwiększa się znaczniej wraz ze zwiększaniem stęŜenia, niŜ wynikałoby to z proporcjonalnej zaleŜności. Przyczynami odchyleń od prawa Lamberta-Beera mogą być takie zjawiska, jak: dimeryzacja, dysocjacja lub asocjacja, które mogą wpływać na własności optyczne substancji oraz zaleŜą od stęŜenia. Wykres kalibracyjny wykorzystuje się w zakresie prostoliniowej zaleŜności. Ponadto, stęŜenie substancji, spełniającej prawo Bouguera-Lamberta-Beera w zakresie stęŜeń, dla których zaleŜność absorbancji od stęŜenia jest prostoliniowa, moŜna oznaczyć bez sporządzania wykresu kalibracyjnego. W tym celu mierzy się wartość absorbancji roztworu analizowanej substancji o znanym stęŜeniu (wzorzec) oraz roztworu analizowanego o nieznanym stęŜeniu. StęŜenie oznaczane oblicza się po przekształceniu następującej proporcji: Aw : Ax = cw : cx

cx = cw ⋅ Ax / Aw

gdzie: Aw – absorbancja roztworu o znanym stęŜeniu (wzorca); Ax – absorbancja roztworu analizowanego o nieznanym stęŜeniu; cw – stęŜenie znane, wzorca; cx – stęŜenie oznaczane 357

Aparaty słuŜące do pomiaru absorbancji to absorpcjometry. StęŜenie związków barwnych oceniano pierwotnie przez intensywność zabarwienia, czyli koloru, stąd wywodzi się wciąŜ uŜywana nazwa kolorymetria, odnosząca się do absorpcjometrii w świetle widzialnym. Przyrządem słuŜącym do tego typu pomiarów jest kolorymetr, który moŜna traktować jako uproszczony spektrofotometr. Przyrządy stosowane do pomiaru absorpcji promieniowania moŜna najogólniej podzielić na: 1) fotokolorymetry – w których światło monochromatyczne uzyskuje się przez specjalne filtry świetlne; 2) spektrofotometry – zawierające pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne do uzyskiwania monochromatyzacji światła. Na ogólny schemat budowy tych aparatów składa się: a) źródło światła, b) regulator natęŜenia wiązki promieniowania, c) monochromatory, d) pojemnik na roztwór badany, e) detektor, f) wskaźnik pomiaru. Przy pomiarze absorbancji pierwszą czynnością, jaką naleŜy wykonać jest nastawienie aparatu na wymaganą długość fali. Następnie trzeba przepuścić wiązkę światła monochromatycznego (przy ustawieniu wskaźnika cyfrowego na 100% przepuszczalności) przez kuwetę zawierającą roztwór porównawczy (np. woda lub uŜywany rozpuszczalnik) bądź tzw. próbę ślepą (jest to roztwór o takim samym składzie i pH, jak roztwór badany, nie zawierający jednak oznaczanego składnika). Jest to podstawowa zasada oznaczeń absorpcjometrycznych, pozwalająca na wyeliminowanie wpływu odczynników i zawartych w nich zanieczyszczeń na ostateczny wynik pomiaru. Kolejny etap to przełączenie wskaźnika cyfrowego na absorbancję, która powinna wynosić 0,00. Dopiero po wyzerowaniu aparatu na próbie ślepej moŜna odczytać absorbancję roztworu badanego, umieszczonego w identycznej kuwecie. Metody kolorytmetryczne naleŜą do najłatwiejszych i najszybszych metod analitycznych, są uniwersalne, dokładne i czułe.

POLARYMETRIA Iwona śak, Izabela Szołtysek-Bołdys Polarymetria to technika analityczna, która wykorzystuje zjawisko skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego do wykrywania lub oznaczania stęŜenia substancji optycznie czynnej, m.in. w analizie środków leczniczych. Przyrządem słuŜącym do oznaczania kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego jest polarymetr. Wiązkę światła liniowo spolaryzowanego otrzymuje się po przepusz-

358

czeniu wiązki światła monochromatycznego (lampy sodowej) przez pryzmat Nicola (nikol). Pryzmat Nicola to dwułomny kryształ szpatu islandzkiego (krystaliczny CaCO3), który szlifuje się pod kątem 68°, przecina wzdłuŜ przekątnej, po czym obie połówki skleja balsamem kanadyjskim o współczynniku załamania równym 1,54; główny przekrój jest płaszczyzną polaryzacji pryzmatu. balsam kanadyjski 90

68

promień nadzwyczajny

promień zwyczajny

Schemat działania pryzmatu Nicola Wchodzący do pryzmatu Nicola promień światła rozszczepia się na dwa promienie: zwyczajny i nadzwyczajny. Promień zwyczajny pada na warstwę balsamu kanadyjskiego pod kątem większym od granicznego, dlatego ulega odbiciu i wygaszeniu, promień nadzwyczajny zaś pod kątem mniejszym od granicznego, dlatego przechodzi bez zmian. Spolaryzowane promienie nadzwyczajne po opuszczeniu pryzmatu Nicola biegną dalej w tym samym kierunku, co promienie padające na ten pryzmat. Zatem pryzmat Nicola przepuszcza drgania fali elektromagnetycznej tylko w jednej płaszczyźnie, natomiast wygasza drgania w innych płaszczyznach. Po przepuszczeniu światła monochromatycznego przez dwa pryzmaty Nicola, ustawione jeden za drugim, natęŜenie światła spolaryzowanego zaleŜy od ustawienia drugiego.

Światło spolaryzowane wykazuje maksymalne natęŜenie, gdy płaszczyzny polaryzacji obu pryzmatów Nicola są do siebie ustawione równolegle. W przypadku, gdy jeden zostanie obrócony wokół swej osi moŜna obserwować coraz większe zaciemnienie w polu widzenia, tj. wygaszanie światła wychodzącego z polarymetru. Maksymalne zaciemnienie, czyli wygaszenie światła ma miejsce, gdy kąt obrotu pryzmatu Nicola osiągnie 90°, wówczas płaszczyzny polaryzacji (główne przekroje) obu pryzmatów są do siebie prostopadłe (skrzyŜowane). W takim ułoŜe359

niu drugi pryzmat Nicola nie przepuszcza wiązki światła spolaryzowanego wychodzącego z pierwszego. Wiązka odbija się od warstwy balsamu w drugim pryzmacie i dalej biegnie jako wiązka promieni zwyczajnych. Schemat budowy polarymetru

1

2

3

4

5

6

7

8

gdzie: 1 – źródło światła; 2 – filtr Ŝółty dający światło monochromatyczne; 3 – soczewka dająca wiązkę promieni równoległych; 4 – polaryzator; 5 – płytka kwarcowa; 6 – rurka polarymetru; 7 – analizator; 8 – okular

W polarymetrach pierwszy pryzmat Nicola jest nieruchomy i nosi nazwę polaryzatora, poniewaŜ słuŜy do wytwarzania wiązki światła spolaryzowanego. Drugi to analizator, który jest ruchomy wokół osi optycznej i sprzęŜony ze skalą kątową, słuŜącą do odczytu wielkości kąta skręcenia. Zasada działania polarymetru opiera się na tym, Ŝe jeśli między pryzmatami Nicola (skrzyŜowane) umieści się substancję optycznie czynną, która skręca płaszczyznę światła spolaryzowanego o kąt α, to pole widzenia w okularze rozjaśni się proporcjonalnie do stęŜenia tego związku. W celu osiągnięcia pierwotnego zaciemnienia naleŜy obrócić analizator dokładnie o kąt α. W przypadku jednych związków optycznie czynnych, analizator naleŜy obrócić w prawo (substancje prawoskrętne), w przypadku drugich w lewo (substancje lewoskrętne). Kąt skręcenia odczytuje się na skali kątowej z dokładnością do 0,05° za pomocą noniusza. Najczęściej uŜywane są polarymetry półcieniowe: dwucieniowe (dwupolowe) lub trójcieniowe (trójpolowe), które umoŜliwiają porównanie natęŜenia światła opuszczającego polaryzator z natęŜeniem światła przechodzącego przez analizator. W polarymetrach tych część wiązki światła przepuszcza się przez dodatkowy pryzmat lub płytkę kwarcową, które rozdzielają pole widzenia w okularze. Dzięki temu w okularze moŜe ukazać się jednocześnie pole maksymalnie jasne obok pola ciemniejszego. Polarymetr jest tak uregulowany, Ŝe jeśli w rurce polarymetru nie ma substancji optycznie czynnej i zerowa kreska podziałki kątowej pokrywa się z zerową kreską podziałki noniusza, wtedy wszystkie części pola widzenia w okularze są jednolicie szaro oświetlone (wygaszone), tak jak w pozycji „b” na rysunku, przedstawiającym rodzaje pól widzenia w polarymetrze.

360

Jeśli w rurce polarymetrycznej umieści się substancję optycznie czynną lewoskrętną, wówczas pojawi się pasek jasny w środkowej części pola widzenia, któremu towarzyszą po bokach pola ciemne, tak jak w pozycji „a” na rysunku. Rodzaje pól widzenia w polarymetrze

a

b

c

lewoskrętna substancja

wygaszenie całkowite

prawoskrętna substancja

JeŜeli w rurce polarymetrycznej umieści się substancję prawoskrętną, wówczas pojawia się pasek ciemny w środkowej części pola widzenia, któremu towarzyszą po bokach pola jasne, tak jak w pozycji „c” na rysunku. Podstawą polarymetrii jest zaleŜność wyraŜona wzorem: α = [α]D ⋅ c ⋅ l gdzie: α – zmierzony kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego; [α]D – skręcalność właściwa; c – stęŜenie związku optycznie czynnego, w g/ml roztworu; l – grubość warstwy roztworu, przez którą przechodzi wiązka światła spolaryzowanego, w dm

Wartość mierzonego kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego przez związek optycznie czynny zaleŜy od stęŜenia substancji, od grubości warstwy roztworu tej substancji, przez którą przechodzi światło spolaryzowane oraz od rodzaju substancji, jej budowy, ilości i rozmieszczenia jej centrów chiralności. Daną substancję optycznie czynną charakteryzuje wartość skręcalności właściwej.

Skręcalność właściwa danej substancji to kąt, o jaki skręcałaby płaszczyznę światła spolaryzowanego jednodecymetrowa warstwa roztworu danej substancji o stęŜeniu 1g/ml. Jej wartość zaleŜy od długości fali promieni spolaryzowanych, temperatury i rodzaju rozpuszczalnika, dlatego przy zapisie wartości skręcalności właściwej podaje się te parametry:

361

α

20 D

=

α c(g / ml) ⋅ l(dm)

gdzie: [α]D20 – skręcalność właściwa rozpuszczonej substancji wyraŜona w stopniach; indeks górny 20 oznacza temperaturę pomiaru; indeks dolny „D” – światło monochromatyczne, czyli linia D lampy sodowej (589,3 nm); α – zmierzony kąt skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego wyraŜony w stopniach; c – stęŜenie roztworu wyraŜone w g/ml; l – grubość warstwy roztworu, wyraŜona w dm, przez którą przechodzi światło spolaryzowane.

Po dokonaniu pomiaru kąta skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego przez substancję o znanej wartości skręcalności właściwej moŜna określić jej stęŜenie, wyraŜone w g/ml, na podstawie matematycznej zaleŜności: c=

α α

20 D

⋅ l (dm)

W technice polarymetrii stęŜenie wyznacza się z pomiaru kąta skręcenia na podstawie prostej matematycznej zaleŜności, której warunki stosowania moŜna łatwo zapewnić. Związek między stęŜeniem a odpowiadającym mu kątem skręcenia wyznacza wartość skręcalności właściwej, którą odczytać moŜna z odpowiednich zestawień tabelarycznych w poradnikach fizykochemicznych. Iloczyn skręcalności właściwej i masy molowej (M) podzielony przez 100 określa się jako skręcalność molowa [Φ]: F =

α ⋅M 100

Pozwala ona na porównywanie zdolności do skręcania światła spolaryzowanego w skali molowej. PoniewaŜ wartość iloczynu skręcalności właściwej i masy molowej byłaby liczbą zbyt duŜą, niewygodną w uŜyciu, została podzielona przez 100.

CHROMATOGRAFIA Iwona śak Chromatografia jest metodą słuŜącą do rozdzielania mieszanin substancji, w której wykorzystywane są róŜne fizykochemiczne oddziaływania rozdzielanych substancji z dwoma fazami: ruchomą i nieruchomą. Fazą nieruchomą moŜe być 362

ciało stałe (w chromatografii adsorpcyjnej) lub ciecz, unieruchomiona w stałym nośniku (w chromatografii podziałowej), fazą ruchomą bywa ciecz lub gaz.

Chromatografia adsorpcyjna W chromatografii adsorpcyjnej wykorzystuje się zjawisko adsorpcji, które jest następstwem cząsteczkowych oddziaływań dyspersyjnych, tworzenia się słabych wiązań chemicznych, wodorowych, doprowadzających do nagromadzania się substancji rozpuszczonej na powierzchni ciała stałego, zwanego adsorbentem. Wielkość adsorpcji określa się stosunkiem ilości masy substancji zaadsorbowanej, zwanej adsorbatem, przypadającej na jednostkę masy adsorbenta. Wielkość ta zaleŜy od temperatury oraz rodzaju adsorbatu i adsorbenta. Adsorbentami mogą być: Ŝel skrobiowy, sacharoza, węglan wapniowy, fosforan wapniowy, fosforan magnezowy, tlenek magnezowy, Ŝel krzemionkowy, węgiel aktywny i inne. Adsorbenty moŜna podzielić na dwie zasadnicze grupy, tj. polarne, np. Ŝel krzemionkowy, i niepolarne, np. węgiel aktywny. Fazą ruchomą uŜywaną do elucji są zwykle ciekłe związki organiczne o róŜnych stopniach polarności, od węglowodorów po alkohole i kwasy organiczne. Moc elucyjną poszczególnych rozpuszczalników moŜna określić, wyznaczając wartość współczynnika Rf (rate of flow – szybkość przepływu) dla substancji testowanej, zachowując jednakowe warunki doświadczalne (te same: adsorbent, adsorbat i temperatura).

Rf =

DROGA PRZEBYTA PRZEZ SUBSTANCJĘ DROGA PRZEBYTA PRZEZ ROZPUSZCZALNIK

Rf jest to stosunek odległości przebytej przez migrującą substancję do odległości przebytej przez czoło rozpuszczalnika w tym samym czasie. W chromatografii adsorpcyjnej rozdzielenie mieszaniny substancji odbywa się głównie dzięki róŜnicom w ich adsorpcji przez adsorbent. Substancje słabiej adsorbowane przez adsorbent są wymywane przez rozpuszczalnik wcześniej. Natomiast silniej adsorbowane przez adsorbent pozostają z nim związane. Czasami dla ich wymycia z adsorbentu naleŜy zastosować wiele rozpuszczalników o rosnącej mocy eluowania (zdolności wymywania) lub elucję gradientową, polegającą na ciągłym zwiększaniu mocy rozpuszczalnika wymywającego.

Chromatografia podziałowa W chromatografii podziałowej rozdzielenie mieszaniny opiera się na róŜnej rozpuszczalności jej związków w dwóch nie mieszających się rozpuszczalnikach. Jeden z rozpuszczalników, unieruchomiony na nośniku, stanowi fazę nieruchomą, natomiast drugi przemieszcza się względem pierwszego i stanowi fazę ruchomą. Rozdzielane substancje dzielą się pomiędzy fazę ruchomą i nieruchomą zgodnie 363

z ich rozpuszczalnością w tych fazach. Substancje, które lepiej rozpuszczają się w fazie nieruchomej, migrują wolniej i to właśnie prowadzi do rozdziału. Na podstawie polarności poszczególnych faz wyróŜniamy:

⇒ chromatografię podziałową zwykłą, w której fazą nieruchomą jest woda (lub roztwór buforowy albo rozpuszczalnik organiczny nasycony wodą) osadzona na nieaktywnym nośniku (np. bibuła), a fazą ruchomą jest rozpuszczalnik organiczny; ⇒ chromatografię podziałową z fazą nieruchomą, mniej polarną od wody, np. hydrofilny rozpuszczalnik organiczny nie mieszający się z fazą ruchomą; ⇒ chromatografię podziałową z odwróconymi fazami, w której nośnik jest silnie hydrofobowy i utrzymuje nieruchomą fazę organiczną. ZróŜnicowanie szybkości wędrowania składników rozdzielanej mieszaniny wynika z róŜnych wartości współczynników podziału dla poszczególnych składników. Współczynnik podziału substancji (k) jest to stosunek stęŜenia substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej do jej stęŜenia w fazie nieruchomej, który w stanie równowagi i w danej temperaturze ma wielkość stałą.

k=

STĘśENIE W FAZIE RUCHOWEJ STĘśENIE W FAZIE NIERUCHOMEJ

Najszybciej wędrują składniki posiadające największą wartość współczynnika podziału. Podczas chromatografii podziałowej, poza podziałem składników między dwie fazy ciekłe, często mają miejsce zjawiska związane w mniejszym lub większym stopniu z adsorpcją składników z nośnikiem. Siły adsorpcji hamują ruch podczas procesu chromatograficznego. Rozdzielane substancje w danych warunkach chromatograficznych charakteryzuje róŜna szybkość wędrowania, określona współczynnikiem Rf. Substancje, które mają identyczne wartości współczynników Rf, nie mogą być rozdzielone w danych warunkach chromatograficznych. Jeśli substancja ma współczynnik szybkości przepływu Rf = 1, to oznacza, Ŝe wędruje ona wraz z czołem rozpuszczalnika, czyli jest bardzo dobrze rozpuszczalna w fazie ruchomej, a nierozpuszczalna w fazie nieruchomej. JeŜeli natomiast substancja ma wartość Rf = 0, to oznacza, Ŝe substancja ta jest na tyle słabo rozpuszczalna w fazie ruchomej, Ŝe pozostała na linii startowej, nie będąc w stanie migrować. W chromatografii podziałowej najczęściej stosowanymi technikami są chromatografie: bibułowa, kolumnowa i cienkowarstwowa. W chromatografii bibułowej nośnikiem fazy nieruchomej jest bibuła, w której kierunek włókien celulozowych moŜe czasami mieć niekorzystny wpływ na zdolność rozdzielczą tego nośnika. 364

W chromatografii kolumnowej lub cienkowarstwowej nośnikami są Ŝele krzemionkowe, celulozowe, ziemia okrzemkowa i inne obojętne, porowate materiały, które albo wypełniają kolumny, albo naniesione są w postaci cienkiej warstwy na płytkach szklanych lub plastikowych. Wymienione nośniki są hydrofilowe, dlatego faza na nich unieruchomiona jest zawsze polarna, najczęściej woda lub wodne roztwory metanolu, kwasu octowego, buforów i inne. Jako faz ruchomych uŜywa się rozpuszczalników organicznych lub ich mieszanin, niekiedy z dodatkiem polarnych substancji, np. kwasu octowego. Nośniki o charakterze hydrofobowym (np. celulozy acetylowane lub kauczuk w obecności benzenu lub chloroformu) wykorzystuje się w chromatografii podziałowej z odwróconymi fazami, gdzie stosuje się niepolarną fazę nieruchomą. W chromatografii kolumnowej na pionowo ustawioną kolumnę, wypełnioną nośnikiem zrównowaŜonym fazą nieruchomą, nanosi się roztwór mieszaniny przeznaczonej do rozdzielenia, który wnika w kolumnę. Składniki mieszaniny, głównie dzięki róŜnym współczynnikom podziału, wędrują z róŜną prędkością wraz z fazą ruchomą. Wymywane z kolumny poszczególne składniki mieszaniny zbierane są do probówek znajdujących się w kolektorze frakcji, automatycznie przesuwającym probówki, zaleŜnie od nastawionego przedziału czasowego lub objętości zbieranej frakcji. W chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej wyróŜniamy dwie podstawowe techniki: chromatografię wstępującą i zstępującą. W tej pierwszej faza ruchoma wraz z rozdzielanymi substancjami wędrują wskutek sił kapilarnych warstwy nośnika. W technice zstępującej faza ruchoma wraz z rozdzielanymi substancjami wędrują wskutek sił cięŜkości. Po zakończeniu migracji na chromatogramie naleŜy uwidocznić i zidentyfikować rozdzielone związki, jeśli nie są one barwne. Właściwe uŜycie wzorców, odpowiednich odczynników identyfikujących i metod fizykochemicznych wraz z pomiarem wartości Rf pozwala na rozpoznanie substancji tworzących plamki na chromatogramie. Sposób wywołania chromatogramu zaleŜy od celu danej analizy.

Chromatografia na sitach molekularnych W chromatografii na sitach molekularnych, zwanej sączeniem molekularnym lub filtracją Ŝelową, rozdzielanie mieszaniny cząsteczek odbywa się na podstawie ich wielkości i kształtu. Nośnikami fazy ruchomej, czyli sitami molekularnymi w tej metodzie, są usieciowane poprzecznie, nierozpuszczalne polimery węglowodanowe, typu dekstran (Sephadex) lub agaroza (Sepharose), oraz polimery poliakrylamidowe (BioGel). Są one wysoce uwodnionymi ziarnami o strukturze porowatej, których wielkość porów jest charakterystyczna dla danego rodzaju sita, a poszczególne rodzaje sit róŜnią się rozmiarami porów. Wielkość porów określa rozmiar kanalików 365

w ziarnach, np. im będą one większe, tym większe cząsteczki będą do nich wnikały. Przykładowo, zdolności rozdzielcze Sephadexów serii G (G-15 – G-200) są róŜne, np. na Sephadexie G-75 najlepiej rozdzielane są substancje o masach cząsteczkowych mieszczących się w zakresie 3000–150 000, a np. na Sephadexie G-200 o masach w zakresie 5000–800 000. Techniki z uŜyciem sit molekularnych są podobne do stosowanych w przypadku chromatografii podziałowej, mianowicie technika kolumnowa lub cienkowarstwowa. W obu przypadkach, zasada rozdzielania polega na tym, Ŝe cząsteczki mniejsze od wielkości porów wchodzą do kanalików w poszczególnych ziarnach sit, natomiast cząsteczki od nich większe lub o wydłuŜonym kształcie nie mogą wejść do wnętrza kanalików w ziarnach. Cząsteczki większe występują tylko w płynie otaczającym ziarna, mają więc krótszą drogę do przebycia, niŜ cząsteczki mniejsze, które znajdują się w płynie o większej objętości (jest to płyn otaczający porowate ziarna, jak i wypełniający kanaliki w ziarnach), dlatego mają dłuŜszą drogę do przebycia od cząsteczek większych. Cząsteczki większe przemieszczają się przez sita molekularne szybciej i ulegają elucji jako frakcje początkowe, natomiast mniejsze poruszają się znacznie wolniej, poddając się elucji jako frakcje późniejsze. Sączenie molekularne często wykorzystywane jest do odsalania roztworów białek izolowanych z materiału biologicznego metodami wysalania. Podczas rozdziału cząsteczki soli wnikają do kanalików ziaren i eluowane są znacznie później od frakcji białek, które nie mając moŜliwości wejścia do kanalików ziaren, szczególnie Sephadexu G-25, wcześnie wymywane są z kolumny niemal z objętością swobodną kolumny (Vo), czyli objętością rozpuszczalnika wypełniającego przestrzeń między ziarnami. Sita molekularne najczęściej stosuje się do rozdziału białek, peptydów, kwasów nukleinowych i innych związków, zarówno w badaniach analitycznych, jak i w celach preparatywnych. Sączenie molekularne moŜna takŜe wykorzystać do wyznaczenia masy cząsteczkowej, np. białek. W tym celu naleŜy wyznaczyć objętość elucyjną (Ve) dla danego białka i objętość swobodną kolumny (Vo). Między określoną względną objętością elucyjną białka (Ve/Vo) a logarytmem jego masy cząsteczkowej występuje zaleŜność liniowa. Dzięki temu, po wystandaryzowaniu sita molekularnego wzorcowymi białkami o znanej masie cząsteczkowej, wykreśla się krzywą wzorcową (zaleŜności Ve/Vo do log10 masy cząsteczkowej), z której moŜna odczytać masę cząsteczkową badanego białka, znając jego względną objętość elucyjną.

Chromatografia jonowymienna W metodzie tej nośnikiem są wymieniacze jonowe (jonity), wysokocząsteczkowe, usieciowane związki nierozpuszczalne, które posiadają łatwo dysocju366

jące grupy chemiczne, kwaśne lub zasadowe. W ściśle określonych warunkach (pH i mocy jonowej roztworu) mogą one wiązać jony z roztworu oraz oddawać je w przypadku zmiany tych warunków.

Kationity zawierają dysocjujące grupy kwaśne (obdarzone ładunkiem ujemnym), np. –COO-H+, –SO3-H+, fenolowe lub fosforanowe, które na zasadzie podwójnej wymiany, przyłączają z roztworu rozdzielanej mieszaniny kationy, np. Ca++, oddając atom wodoru. Anionity zawierają dysocjujące grupy zasadowe, np. –N(CH3)3+OH-, lub aktywne ugrupowania amin I-, II- lub III-rzędowych (obdarzone ładunkiem dodatnim), które przyłączają z roztworu rozdzielanej mieszaniny aniony, np. Cl-. W chromatografii jonowymiennej podstawą rozdziału mieszaniny cząsteczek jest ich całkowity ładunek. Dlatego na kolumnie kationitowej z rozdzielanej mieszaniny zostaną zatrzymane tylko kationy, natomiast aniony i cząsteczki obojętne nie mogą być związane, dlatego wypłyną z kolumny wraz z frontem rozpuszczalnika. Związane z jonitem kationy moŜna następnie wymyć z kolumny przez przemycie roztworem jonów dodatnich, np. Na+ o wzrastającym gradiencie, które konkurują z badanymi kationami o wiązanie z obdarzonymi ładunkami ujemnymi grupami jonitu, lub teŜ uwolnić je poprzez zwiększenie pH buforu elucyjnego. Miarą pojemności wymieniacza jest stęŜenie aktywnych (obdarzonych ładunkiem) grup wymieniacza na jednostkę masy jonitu. W chromatografii jonowymiennej nośnikami mogą być teŜ sita molekularne, zawierające dodatkowo obdarzone ładunkiem dodatnim grupy dietyloaminoetylowe (DEAE), np. DEAE-Sephadex, DEAE-celuloza, są one anionitami często wykorzystywanymi do rozdziału i oczyszczania białek o wypadkowym ładunku ujemnym (białek anionowych). Sita molekularne zawierające obdarzone ładunkiem ujemnym grupy karboksymetylowe (CM), np. CM-Sephadex, CM-celuloza, są kationitami, często wykorzystywanymi do rozdziału i oczyszczania białek o wypadkowym ładunku dodatnim (białek kationowych).

Chromatografia powinowactwa Chromatografia powinowactwa wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne i o wysokim powinowactwie wiązanie się białka z inną cząsteczką zwaną ligandem, dlatego umoŜliwia wyodrębnienie jednego białka z mieszaniny wielu róŜnych białek. Przykładowo, częstymi kombinacjami specyficznych par ligandów i oczyszczanych białek są np.: hormon jako ligand w celu oczyszczenia rozpoznawanego i wiąŜącego go specyficznie receptora; lektyna w celu oczyszczenia glikoproteiny; przeciwciało, aby wyizolować antygen, inhibitor do oczyszczenia enzymu. Specyficzne ligandy są zwykle unieruchomione na porowatych nośnikach (sitach molekularnych) na Sepharose, Sephadexie, jak np. konkanawalina A-Sephadex. Mieszaninę białek nakłada się na immobilizowane ligandem sita molekularne, 367

uformowane na kształt złoŜa wypełniającego kolumnę. Na nośniku zostanie zatrzymane jedynie białko specyficznie wiąŜące się z ligandem, natomiast wszystkie pozostałe białka pozostaną w buforze elucyjnym, który opuści kolumnę. Białko związane z ligandem na kolumnie moŜna uwolnić w dwojaki sposób: albo przez przemycie kolumny roztworem zawierającym wolną formę liganda lub poprzez zmianę pH, czy teŜ stęŜenia soli w buforze elucyjnym.

ELEKTROFOREZA Iwona śak Elektroforeza jest techniką rozdzielania związków obdarzonych ładunkiem, która wykorzystuje zjawisko ruchu cząstek w polu elektrycznym. Pod wpływem pola elektrycznego cząstki obdarzone ładunkiem dodatnim, czyli kationy, wędrują do katody, tzn. elektrody ujemnej, w procesie zwanym kataforezą. Cząstki obdarzone ładunkiem ujemnym – aniony – wędrują w polu elektrycznym do anody, tj. elektrody dodatniej, w procesie zwanym anaforezą. Podstawą rozdziału elektroforetycznego cząstek jest ich zróŜnicowana szybkość wędrówki w polu elektrycznym, manifestująca się tym, Ŝe w jednakowym czasie odmienne cząstki przewędrują róŜne odległości. Szybkość przemieszczania cząstek obdarzonych ładunkiem w polu elektrycznym zaleŜy od trzech zasadniczych grup czynników, mianowicie: 1) własności cząstek wędrujących; 2) własności środowiska, w którym cząstki wędrują; 3) od parametrów charakteryzujących przepływający prąd. Własności cząstek wędrujących w polu elektrycznym, które mają największy wpływ na szybkość przemieszczania, to wielkość wypadkowego ładunku elektrycznego, masa i kształt cząstek. Wielkość masy i wypadkowego ładunku cząstek działają przeciwstawnie na szybkość wędrówki. Im większy wypadkowy ładunek cząstek, tym szybciej się poruszają, ale im większa masa, tym wolniejsza wędrówka cząstek. Zatem szybkość migracji cząstek w polu elektrycznym zaleŜy od stosunku ładunek/masa. Kształt cząstek wpływa na szybkość ich przemieszczania, dzięki obniŜaniu lub wzmaganiu oporu środowiska, który przeciwdziała ruchowi cząstek. Opór środowiska dla cząstek o kształcie bliskim kuli (globularnym) będzie mniejszy (dzięki czemu ruch tych cząstek jest szybszy) niŜ tych o rozpostartej konformacji przestrzennej.

Środowisko, w którym cząstki wędrują, rodzaj uŜytego buforu i jego właściwości, takie jak lepkość, siła jonowa, pH i temperatura, wpływają na rozdział elektroforetyczny. Im większa lepkość, tym większy opór środowiska ma do pokonania przemieszczająca się cząstka. Natomiast od siły jonowej i pH buforu elektroforetycznego moŜe zaleŜeć wielkość ładunku rozdzielanej cząstki. 368

Zastosowanie buforu o wartości pH odpowiadającej wartości pI rozdzielanych cząstek uniemoŜliwi ich rozdział, poniewaŜ w tych warunkach cząstki występują w formie jonu obojnaczego i nie poruszają się w polu elektrycznym. Dla cząstek rozpuszczalnych w środowisku zasadowym najwłaściwszy będzie bufor o pH wyŜszym od pI kaŜdej rozdzielanej cząstki mieszaniny. Przykładowo, bufor elektroforetyczny o wartości pH około 9 stwarza warunki, w których większość białek wykazuje ujemny wypadkowy ładunek i w polu elektrycznym wędruje w kierunku anody. Nie bez znaczenia jest rodzaj nośnika, którego pory są wypełnione buforem z cząstkami obdarzonymi ładunkiem elektrycznym. Nośnikiem do elektroforezy moŜe być bibuła (róŜnego rodzaju), inny nośnik celulozowy, w tym octan celulozy oraz obecnie powszechnie stosowane róŜne Ŝele obojętne (agarozowy, poliakrylamidowy) w przypadku elektroforezy Ŝelowej. Bibuła jest nośnikiem o duŜej oporności, natomiast Ŝele cechuje mała oporność oraz niska adsorpcja cząstek. Dodatkowo, Ŝele są sitami molekularnymi, w związku z tym przez kanaliki w Ŝelu małe cząstki przechodzą swobodnie, natomiast większe są zatrzymywane. Usieciowanie Ŝelu, np. poliakrylamidowego, decydujące o wielkości kanalików w Ŝelu, moŜna kontrolować stosownie do potrzeb przez wybór odpowiednich stęŜeń akrylamidu i odczynnika sieciującego metylenobisakrylamidu, tworzącego wiązania poprzeczne. W Ŝelu będą tym mniejsze kanaliki, im większe zastosuje się stęŜenie akrylamidu. Nie bez znaczenia dla rozdziału są wskaźniki charakteryzujące przepływający prąd, czyli wielkość przyłoŜonego napięcia, a właściwie jego spadek wzdłuŜ drogi wędrówki cząstek, wielkość natęŜenia. PrzyłoŜenie niskiego napięcia prądu sprawia, Ŝe niskie jest jego natęŜenie i wydzielanie ciepła, lecz szybkość wędrówki cząstek okazuje się wolna. W takich warunkach wydłuŜa się czas potrzebny do osiągnięcia rozdziału elektroforetycznego. Zbyt długi czas trwania rozdziału moŜe być niepoŜądany ze względu na towarzyszące niekorzystne procesy, m.in. dyfuzję, która powoduje rozmycie brzegów rozdzielonych stref. Pod względem wielkości przyłoŜonego napięcia rozróŜnia się elektroforezę niskonapięciową, w której spadek napięcia wynosi do kilkunastu V/cm, oraz elektroforezę wysokonapięciową przy spadku napięcia rzędu 50 V/cm i więcej.

Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym (PAGE) charakteryzuje się szczególnie duŜą rozdzielczością, która w połączeniu z wysoką czułością metod detekcji rozdzielanych substancji pozwala na analizowanie mikrogramowych ilości rozdzielanych mieszanin. Powszechnie stosuje się ją do rozdzielania i oczyszczania białek oraz kwasów nukleinowych. Elektroforezę na Ŝelu poliakrylamidowym w obecności siarczanu dodecylu sodu (SDS) (PAGE-SDS) wykorzystuje się do wyznaczania masy cząsteczkowej białek. W metodzie tej stosuje się białka, wcześniej poddane denaturacji termicznej (100°C) w obecności SDS i redukcji poprzez działanie β-merkaptoetanolu w celu zerwania wiązań disiarczkowych. Efektem 369

tych działań jest całkowite rozwinięcie struktury białka. Cząsteczki anionowego detergentu SDS są silnie ujemne i opłaszczają zdenaturowane białko, tworząc wydłuŜone micelle, we wnętrzu których znajduje się cząsteczka białka. W warunkach tych wszystkie białka wykazują wypadkowy ładunek ujemny i identyczny stosunek ładunku do masy. W obecności SDS wszystkie białka posiadają podobny włókienkowy kształt „prętopodobny” i ich długość jest wówczas proporcjonalna do długości łańcucha polipeptydowego, tym samym do masy cząsteczkowej białka. Podczas PAGE-SDS podstawę rozdziału stanowi jedynie róŜnica wielkości mas cząsteczkowych rozdzielanych białek. Wariantem elektroforezy na Ŝelu poliakrylamidowym jest ogniskowanie izoelektryczne, czyli elektroforeza PAGE w gradiencie pH, utworzonym przez poliamfolity pod wpływem pola elektrycznego. W tych warunkach rozdział elektroforetyczny białek polega na tym, Ŝe kaŜde białko wędruje w polu elektrycznym tylko do tych miejsc Ŝelu, w których środowisko pod względem pH odpowiada wartości jego punktu izoelektrycznego i w tych miejscach zatrzymuje się w postaci wąskiego prąŜka. Uwidocznienie w Ŝelu rozdzielonych cząstek polega na wykonaniu specyficznych reakcji barwienia, charakterystycznych dla tych związków. Często białka wybarwia się barwnikiem Coomassie brillant blue a kwasy nukleinowe bromkiem etydyny lub azotanem srebra.

370

22.

DODATKI Iwona śak, Paweł Niemiec

Tabela 1. Symbole określające wielokrotności i podwielokrotności ułamków dziesiętnych Symbol

Określenie

Wielokrotność

T

tera

1012

G

giga

109

M

mega

106

k

kilo

103

h

hekto

102

da

deka

101

d

decy

10-1

c

centy

10-2

m

mili

10-3

µ

mikro

10-6

n

nano

10-9

p

piko

10-12

371

Tabela 2. Gęstość, stęŜenia procentowe i molowe wodnych roztworów kwasów (w temp. 25o) HCl

HNO3

Gęstość

372

H2SO4

StęŜenia %

mol/l

%

mol/l

%

mol/l

1,00

0,360

0,099

0,333

0,052

0,261

0,027

1,02

4,388

1,227

3,982

0,644

3,242

0,337

1,05

10,52

3,029

9,259

1,543

7,704

0,825

1,10

20,39

6,150

17,58

3,068

14,73

1,652

1,15

30,14

9,505

25,48

4,649

21,38

2,507

1,20

40,62

13,30

32,94

6,273

27,72

3,391

1,32

51,71

10,83

41,95

5,646

1,38

62,70

13,73

48,45

6,817

1,42

71,63

16,14

52,51

7,603

1,46

82,39

19,09

56,41

8,397

1,50

96,73

23,02

60,17

9,202

1,56

65,59

10,43

1,62

70,82

11,70

1,74

81,16

14,40

1,78

85,16

15,46

1,84

96

18

Tabela 3. Gęstość, stęŜenia procentowe i molowe wodnych roztworów zasad (w temp. 25o) KOH

NaOH

Gęstość

StęŜenia %

mol/l

%

mol/l

1,00

0,197

0,035

0,159

0,040

1,02

2,38

0,433

1,94

0,494

1,05

5,66

1,06

4,66

1,222

1,10

11,03

2,16

9,19

2,527

1,14

15,22

3,09

12,83

3,655

1,18

19,35

4,07

16,44

4,850

1,22

23,38

5,08

20,07

6,122

1,26

27,32

6,14

23,73

7,475

1,30

31,15

7,22

27,41

8,906

1,34

34,90

8,34

31,14

10,43

1,40

40,37

10,07

36,99

12,95

1,46

45,66

11,88

43,12

15,74

1,52

50,80

13,76

49,44

18,78

Tabela 4. Gęstość, stęŜenia procentowe i molowe wodnych roztworów amoniaku (w temp. 25o) StęŜenie Gęstość

%

0,990

StęŜenie

mol/l

Gęstość

%

mol/l

1,89

1,10

0,926

19,06

10,37

0,982

3,78

2,18

0,918

21,50

11,59

0,974

5,75

3,29

0,910

24,03

12,84

0,962

8,82

4,98

0,902

26,67

14,12

0,954

10,95

6,13

0,894

29,33

15,40

0,946

13,14

7,29

0,886

32,09

16,69

0,938

15,47

8,52

0,880

34,35

17,75

373

374

Tabela 6. Stałe dysocjacji (tylko pierwszy stopień) wybranych kwasów nieorganicznych (w temp. 25o) Nazwa kwasu CO2 + H2O HCO3HNO2 H3PO3 H2PO3H3PO4 H2PO4HPO42H 2O H 2S H2SO4 HSO4HOCl HOCl2

Kk 4,2 · 10-7 4,8 · 10-11 4,5 · 10-4 1,6 · 10-2 7 · 10-7 7,5 · 10-3 6,2 · 10-8 10-12 1 · 10-14 1,1 · 10-7 ∞ 1,3 · 10-2 3,2 · 10-8 1,1 · 10-2

Tabela 7. Iloczyny rozpuszczalności (w temp. 25o) Nazwa związku Mg(OH)2 MgF2 Ca(OH)2 CaCO3 Sr(OH)2 Ba(OH)2 BaSO4 FeS CoS PtS CuS AgI Ag2S ZnS Hg2Cl2 HgS Al(OH)3 PbS

Ks 8,9 · 10-12 8 · 10-8 1,3 · 10-6 4,7 · 10-9 3,2 · 10-4 5,0 · 10-3 1,5 · 10-9 4 · 10-19 5 · 10-22 8 · 10-73 8 · 10-37 8,5 · 10-17 5,5 · 10-51 1 · 10-22 1,1 · 10-18 1,6 · 10-54 5 · 10-33 7 · 10-29

375

Tabela 8. Stałe dysocjacji (K) i wartości pK wybranych kwasów organicznych Nazwa kwasu Mrówkowy Octowy Propanowy Butanowy Chlorooctowy Benzoesowy Askorbinowy Bursztynowy Cytrynowy

Kk

pKk

2,1 · 10

-4

1,86 · 10

-5

3,68 4,73

1,4 · 10

-5

4,85

1,6 · 10

-5

4,80

1,5 · 10

-3

2,82

6,6 · 10

-5

4,18

-5

8 · 10 (K1) 6,4 · 10

-5

4,1 4,19

-4

3,06

-3

8,7 · 10 (K1)

o-fosforowy

7,5 · 10 (K1)

2,12

Jabłkowy

-4

3,40

n-masłowy Mlekowy Moczowy Szczawiowy

4 · 10 (K1) 1,5 · 10

-5

1,39 · 10 1,3 · 10

-4

-4

-2

6,5 · 10 (K1)

4,82 3,86 3,89 1,19

Tabela 9. Stałe dysocjacji (K) i wartości pK wybranych wodnych roztworów zasad organicznych Nazwa zasady Amoniak Benzydyna Dietyloamina Dimetyloamina Etanoloamina Etyloamina Guanina Hydrazyna Hydroksylamina Metyloamina Pirydyna Trietyloamina

376

Kk

pKk

1,75 · 10 9,3 · 10

-10

-5

4,75

(K1)

9,03

9,6 · 10

-4

3,02

5,2 · 10

-4

3,28

2,77 · 10

3 · 10

4,56

-4

3,25

-12

11,09

5,6 · 10 8,4 · 10

-5

-6

5,52

1,07 · 10

-8

7,97

4,38 · 10

-4

3,36

1,71 · 10

-9

8,77

5,65 · 10

-4

3,24

Tabela 10. Punkt izoelektryczny, stałe dysocjacji, masy cząsteczkowe aminokwasów Masa SprzęŜony Aminokwas pI Kk pKk cząsteczkowa kwas-zasada Kwas 2,87 133,1 α-COOH 8,13 · 10-3 2,09 asparaginowy β-COOH 1,38 · 10-4 3,86 α-NH3+ 1,51 · 10-10 9,82 Asparagina 5,41 132,1 α-COOH 9,55 · 10-3 2,02 α-NH3+ 1,58 · 10-9 8,8 Kwas 3,22 147,1 α-COOH 6,46· 10-3 2,19 glutaminowy γ-COOH 5,62 · 10-5 4,25 + α-NH3 2,14 · 10-10 9,67 Glutamina 5,65 146,1 α-COOH 6,76· 10-3 2,17 α-NH3+ 7,41· 10-10 9,13 Arginina 10,76 174,2 α-COOH 6,76· 10-3 2,17 + α-NH3 9,12 · 10-10 9,04 =NH3+ 3,31· 10-13 12,48 Lizyna 9,74 146,2 α-COOH 6,61· 10-3 2,18 + α-NH3 1,12 · 10-9 8,95 ε-NH3+ 2,95· 10-11 10,53 Histydyna 7,58 155,2 α-COOH 1,51· 10-2 1,82 + -NH3 (imidazol) 1,00 · 10-6 6,0 α-NH3+ 6,76 · 10-10 9,17 Tryptofan 5,88 204,2 α-COOH 4,17 · 10-3 2,38 + α-NH3 4,07 · 10-10 9,39 Fenyloalanina 5,48 165,2 α-COOH 1,48 · 10-2 1,83 + α-NH3 7,41 · 10-10 9,13 Tyrozyna 5,65 181,2 α-COOH 6,31 · 10-3 2,2 + α-NH3 7,76 · 10-10 9,11 -OH 8,51 · 10-11 10,07 Leucyna 5,98 131,2 α-COOH 4,37 · 10-3 2,36 + α-NH3 2,51 · 10-10 9,60 Treonina 6,53 119,1 α-COOH 2,35 · 10-3 2,63 + α-NH3 3,72 · 10-11 10,43 Cysteina 5,02 121,2 α-COOH 1,95 · 10-2 1,71 + α-NH3 4,68 · 10-9 8,33 β-SH 1,66 · 10-11 10,78 Cystyna 5,06 240,3 α-COOH 2,24 · 10-2 1,65 α-COOH 5,50 · 10-3 2,26 α-NH3+ 1,41 · 10-8 7,85 + α-NH3 1,41 · 10-10 9,85 Metionina 5,75 149,2 α-COOH 5,25 · 10-3 2,28 α-NH3+ 6,17 · 10-10 9,21 Prolina 6,1 115,1 α-COOH 1,02 · 10-2 1,99 + -NH2 2,51 · 10-11 10,6 Hydroksyprolina 5,83 131,1 α-COOH 1,20 · 10-2 1,92 -NH2+ 1,86 · 10-10 9,73 377

Tabela 11. Maksima absorpcji (λ max) i współczynniki molowe absorpcji (ε · 10-3) λ max [nm]

(ε · 10-3)

Związek

λ max [nm]

(ε · 10-3)

Adenina

260 245

13,3 8,05

Nikotynowego kwasu amid

260

4,6

Adenozyna

260

14,9

Ryboflawina

450

12,2

375

10,6

260

27,7

267

9,7

207

9,6

Związek

AMP, ADP, ATP

259

15,4

Tymidyna

Cytozyna

267

6,1

Tymina

264

7,9

Cytydyna, CMP, CDP, CTP

271

9,1

Tryptofan (w 0,1 M HCl)

278

5,6

218

33,5

FAD

450

11,3

280

5,43

375

9,3

Tryptofan (w 0,1 M NaOH)

221

34,6

260

37

Fenyloalanina (w HCl i NaOH)

258

0,2

Tyrozyna (w 0,1 M HCl)

274

1,34

223

8,2

Guanina

262

7,58

294

2,33

246

10,9

Tyrozyna (w 0,1 M NaOH)

240

11,1

252

13.6

Uracyl

260

8,2

260

18

Urydyna

262

10,1

340

6,22

UMP, UDP, UTP

261

8,1

260

15

Guanozyna +

NAD , NADP

+

NADH, NADPH

378

Tabela 12. Skręcalność właściwa ([α α]D20) wybranych związków organicznych Związek D-ryboza D-dezoksyryboza D-glukoza

Inne związki

Aminokwasy

Cukry

α-D-glukoza β-D-glukoza D-galaktoza α-D-galaktoza β-D-galaktoza D-mannoza α-D-mannoza D-fruktoza β-D-fruktoza Sacharoza Cukier inwertowany Laktoza Maltoza Skrobia Glikogen L-alanina * L-fenyloalanina * L-histydyna * L-leucyna * L-walina * L-treonina * L-prolina * L-tryptofan * Kwas L-winowy Kwas mezowinowy Cholesterol c Witamina C Witamina D2 c

[α α]D20 -24° -56° +52,7° +112,2° +18,7° +80,2° +150,7o +52,8o +14,6° -17o -92° -133o +66,5° -20° +52,3° +140,7° +196° +198° +33o -7,5o +7,5o +22,5o +62o -30o -80o -34o +14,1o 0o -39,5o + 24o +52o

Gwiazdka (*) przy nazwie substancji oznacza, Ŝe jej rozpuszczalnikiem jest kwas octowy lodowaty, litera c w indeksie górnym (c) wskazuje, Ŝe rozpuszczalnikiem jest chloroform. Rozpuszczalnikiem pozostałych związków jest woda.

379

Tabela 13. WaŜniejsze grupy funkcyjne Nazwa klasy związku

Struktura grupy funkcyjnej

Przykład

Alkany

Zawierają jedynie wiązania C-H oraz pojedyncze wiązania C-C

CH3CH3

Alkeny

C

Alkiny

C

C

H2C

H

C

-an etan

C

C

C

C

Areny

C

C

C C

H

H

C C

C

X

H

C

H

Halogenki

eten (etylen)

brak końcówki chlorometan

Cl

(X = F, Cl, Br, I)

C

O

H

Etery

C

O

C

C

N

H

brak końcówki benzen

H

H3C

Alkohole

-yn etyn (acetylen)

H

C

C

-en

CH2

H C

Końcówka nazwy

H3C

O

H3C

O

H

-ol metanol

H3C

CH3

NH2

eter eter dimetylowy -amina metyloamina (I rz)

H

Aminy

C

N

H

H3C

N

H

dimetyloamina (II rz)

CH3

trimetyloamina (III rz)

CH3

C

H3C

N

N CH3

Nitryle Związki

C

C

C

+

380

-nitryl H3C

O

N

Nitrowe Sulfidy

N

C

etanonitryl +

_

H3C N

O C

S

C

H3C

N

S

O _ O

CH3

brak końcówki nitrometan sulfid sulfid dimetylowy

cd. tabeli 13 Nazwa klasy związku

Struktura grupy funkcyjnej _

Przykład

O

Sulfotlenki

O

+

C

S

C

H3C

S _ O

O

Sulfony

2+

C

S

O

Tiole

C

Aldehydy

C

H3C

C

_

S

H

S

H3C

H

H3C

H3C

OH

C

H3C

O

H3C

NH2

H3C

C

C

O

OH

-an O

CH3

octan metylu -amid acetamid (I rz)

NH2

O

C

N

H

H3C

C

O C

C

O

C

C

CH3

C

O

Amidy

H

O

C

C

-al etanal (acetaldehyd) -on propanon (aceton) kwas –owy kwas etanowy (octowy)

O

C

O C

SH

C

O

Estry

CH3

O

C

C

CH3

C

O

Kwasy karboksylowe

sulfotlenek sulfotlenek dimetylowy sulfon sulfon dimetylowy -tiol metanotiol

O

C

C

2+

_ O

O

Ketony

_

+

_

Końcówka nazwy

N

H3C

N

C

N

N-metyloacetamid (II rz)

CH3

O

C

H

CH3

CH3

NN-dimetylo – acetamid (III rz)

Chlorki kwasu karboksylowego Bezwodniki kwasu karboksylowego

O C

C

O Cl

H3C O C

C

O O

C

C

O C

H3C

C

Cl O

O

C

CH3

chlorek –ilu, -ylu chlorek acetylu bezwodnik –owy bezwodnik octowy

Wiązania, przy których nie wpisano atomów, łączą się z atomem węgla lub wodoru pozostałej części cząsteczki.

381

382

383

384

23.

LITERATURA ŹRÓDŁOWA I UZUPEŁNIAJĄCA

1. Angielski S., Rogulski J.: Biochemia kliniczna, PZWL, Warszawa 1991. 2. Cygański A.: Chemiczne metody analizy ilościowej, WNT, Warszawa 1999. 3. Devlin T. M.: Textbook of biochemistry with clinical correlations, Wiley-Liss, New York 1997. 4. Drapała T.: Chemia ogólna nieorganiczna z zadaniami, Wyd. SGGW, Warszawa 1997. 5. Filipowicz B., Więckowski W.: Biochemia I, PWN, Warszawa 1990. 6. Hart H., Craine L. E., Hart D. J.: Chemia organiczna, Krótki kurs, PZWL, Warszawa 1999. 7. Horton, Moran, Ochs, Rawn, Scrimgeour: Principles of Biochemistry, PrenticeHall, Inc. New Jersey 1996. 8. Kłyszejko-Stefanowicz L.: Ćwiczenia z biochemii, PWN, Warszawa 1999. 9. Kabata-Pendias A., Pendias H.: Biogeochemia pierwiastków śladowych, PWN, Warszawa 1999. 10. Kozubek A., Sikorski A. F., Szopa J.: Molekularna organizacja komórki. II. Lipidy, liposomy i błony biologiczne, Wyd. Uniwers., Wrocław 1996. 11. Kryściak J.: Chemiczna analiza instrumentalna, PZWL, Warszawa 1999. 12. Lippard S. J., Berg J. M.: Podstawy chemii bionieorganicznej, PWN, Warszawa 1998. 13. Mastalerz P.: Podręcznik chemii organicznej, Wyd. Chem., Wrocław 1998. 14. Michajlik A., Bartnikowska E.: Lipidy i lipoproteiny osocza, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1998. 15. Mathews Ch. K., van Holde K. E.: Biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park 1995. 16. Minakowski W., Weidner S.: Biochemia kręgowców, PWN, Warszawa 1998. 17. Minczewski J., Marczenko Z.: Chemia analityczna 1, 2, PWN, Warszawa 1998. 18. McMurry J.: Chemia organiczna 1,2, PWN, Warszawa 2000. 19. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, PZWL, Warszawa 1994. 20. Pajdowski L.: Chemia ogólna, PWN, Warszawa 1999. 21. Pauling L., Pauling P.: Chemia, PWN, Warszawa 1998. 22. Sienko M. J., Plane R. A.: Chemia podstawy i zastosowania, WNT, Warszawa 1999. 23. Stryer L.: Biochemia, PWN, Warszawa 1997. 385

24. Tomaszewski J. J.: Diagnostyka laboratoryjna, PZWL, Warszawa 1993. 25. Turner P. C., McLennan A. G., Bates A. D., White W.R.H.: Krótkie wykłady, Biologia molekularna, PWN, Warszawa 1999. 26. Zgirski A., Gondko R.: Obliczenia biochemiczne, PWN, Warszawa 1998. 27. śak I.: Białka mozaikowe, Post. Biochem. 41(2), 131–138, 1995. 28. śak I.: Glikoproteiny ssaków, PWN, Warszawa 1990. 29. śak I.: Proteoglikany: struktura i biosynteza, Post. Biol. Kom. 22(3), 317–341, 1995. 30. śak I.: Receptory adhezyjne, Post. Biol. Kom. 23(2), 221–242, 1996. 31. śak I., DróŜdŜ M.: Biologiczna funkcja proteoglikanów, Czynniki Ryzyka, 2(8), 12– 20, 1995. 32. śak I., DróŜdŜ M.: Hormony glikoproteinowe, PTBioch., Warszawa 1996.

386

Tabela 2. Charakterystyka głównych klas lipoprotein (Lp) z osocza krwi Klasy lipoprotein Gęstość (g/ml) Średnica (nm)

Chylomikrony

VLDL

IDL

LDL

HDL

< 0,95

0,95–1,006

1,006–1,019

1,019–1,063

1,063–1,210

180–500

30–80

25–30

20–25

7–13

> 400 000

10 000–80 000

5 000–10 000

2 300

175–360

1–2

5–10

15–20

20– 25

40–55

B48, C, E, A

B100, C, E

B100, C, E

B100

A, C, D, E

80–90

50–70

20–25

5–10

3–5

% Cholesterolu wolnego

1–3

7–10

7–10

5–8

3–5

% Estrów Cholesterolu

2–5

4–13

10–12

40–45

15–20

% Fosfolipidów

3–8

15–20

15–20

20–22

20–30

jelito cienkie

wątroba

we krwi

we krwi

we krwi (a ich prekursory w wątrobie i jelicie)

Transportują TAG i cholesterol (egzogenny) z jelit do innych tkanek (tłuszczowej, mięśni i in.). Dostarczanie egzogennego cholesterolu do wątroby w formie chylomikronów resztkowych.

Transportują TAG i cholesterol syntetyzowane w organizmie (endogenne) z wątroby do tkanek obwodowych. Główne źródło IDL i LDL.

Pośredni etap przemian VLDL we krwi, dostarczający LDL. Forma lipoprotein pobierana przez wątrobę.

Transportują cholesterol z wątroby do tkanek obwodowych i regulują syntezę de novo cholesterolu. Końcowe lipoproteiny przemian VLDL we krwi.

Masa cząsteczkowa (kDa) % Białka Główne typy apoLp % Triacylogliceroli (TAG)

Miejsce powstawania form dojrzałych

Główna funkcja

Transportują endogenny cholesterol z tkanek obwodowych do wątroby. „Składowisko” dla apoLp C, E.