techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej_2017-18

SAVE OFFLINE

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Uniwersytet Rzeszowski Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii

Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej

skrypt do ćwiczeń

Prowadzący mgr inż. Jennifer Mytych

Rzeszów, 2017/2018 Strona 1

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Plan zajęć: 1. Ćwiczenia organizacyjne: zasady BHP w laboratorium biotechnologicznym, kryteria oceniania, literatura. Znaczenie i klasyfikacja technik laboratoryjnych. Szkło laboratoryjne. 2. Podstawowe obliczenia chemiczne. Ćwiczenia obliczeniowe z zakresu stężenia molowe, procentowe, przeliczanie stężeń, rozcieńczanie i zatężanie roztworów, zastosowanie stężeń do obliczeń w oparciu o reakcje chemiczne, rozpuszczalność. 3. Budowa pipety automatycznej – zasady pipetowania. Zasady wykonywania rozcieńczeń oraz odmierzania cieczy. 4. Analiza wagowa. Rozpuszczanie próbek (sposoby rozpuszczania, różne rodzaje rozpuszczalników, stapianie z topnikami). 5. Zagęszczanie (odparowywanie, suszenie, wymrażanie, strącanie za pomocą selektywnych odczynników organicznych, odwirowywanie). 6. Roztwory (oznaczanie odczynu z zastosowaniem papierków uniwersalnych i pehametrów, sporządzanie buforów). 7. Podstawowe techniki laboratoryjne – sączenie, dekantacja. Zasady przygotowywania podłoży mikrobiologicznych. 8. Spektrofotometria i jej zastosowanie w biotechnologii. Spektrofotometria UV-VIS. 9. Podstawowe metody sporządzania preparatów mikroskopowych. Wstęp do technik mikroskopowych oraz ich zastosowanie w biomedycynie. 10. Techniki rozdzielania i oczyszczania struktur subkomórkowych: frakcjonowanie, wirowanie różnicowe, techniki membranowe.

Strona 2

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Ćwiczenie 6 Roztwory (oznaczanie odczynu z zastosowaniem papierków uniwersalnych i pehametrów, sporządzanie buforów). Zagadnienia do przygotowania: potencjometria, miareczkowanie potencjometryczne, wykładnik wodorowy pH, skala pH, siła jonowa, zasada działania pH-metrów, rodzaje elektrod, papierki do określania pH roztworu, chemiczne wskaźniki pH, zasada prowadzenia zeszytu laboratoryjnego, zasada pracy z odczynnikami niebezpiecznymi. Zagadnienia do przypomnienia: stężenie molowe i procentowe.

Niezbędne odczynniki: - Tris (MW = 121.14 g/mol) - NaCl (MW = 58.44 g/mol) - glicyna (MW = 75.07 g/mol) - SDS (MW = 288.38 g/mol) - metanol - Tween 20 - 36-38 % HCl Ćwiczenia do wykonania: Przy wykonywaniu eksperymentów ze stężonymi kwasami proszę zachować należytą ostrożność! 1. Przeprowadzić kalibrację pH-metru. 2. Przygotować 200 mL buforu Tris o stężeniu 1.5 M. Doprowadzić pH buforu do 8.8 korzystając z pH-metru, a następnie skontrolować za pomocą papierka uniwersalnego. 3. Przygotować 150 mL buforu Tris o stężeniu 0.5 M. Doprowadzić pH buforu do 6.8 korzystając z pH-metru, a następnie skontrolować za pomocą papierka uniwersalnego. 4. Przygotować 1 L buforu TBS-T o składzie: 20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1 % (v/v) Tween 20. Skontrolować pH i ewentualnie doprowadzić do 7.6. 5. Przygotować 1 L 10-krotnie stężonego buforu do elektroforezy SDS-PAGE. Skład buforu 1krotnie stężonego to 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0.1 % (w/v) SDS. Skontrolować pH i ewentualnie doprowadzić do 8.3. Z otrzymanego buforu 10-krotnie stężonego przygotować 1 L buforu 1-krotnie stężonego. 6. Przygotować 1 L buforu do transferu: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20 % metanol.

Strona 3

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Ćwiczenie 7 Podstawowe techniki laboratoryjne – sączenie, dekantacja, filtracja. Zasady przygotowywania podłoży mikrobiologicznych. Zagadnienia do przygotowania: sączenie, dekantacja, filtracja, sączenie pod próżnią, zasada działania mieszadła magnetycznego, metody otrzymywania nierozpuszczalnych soli, rozpuszczanie substancji, podstawowe podłoża mikrobiologiczne (bulion odżywczy), substancje zestalające podłoża.

Niezbędne odczynniki: - r-r soli wapnia - węglan sodu (MW = 105.977 g/mol) - bulion odżywczy - agar 1.

Otrzymywanie nierozpuszczalnej soli.

1. Przygotować 75 ml 1 M węglanu sodu. 2. Otrzymany od prowadzącego roztwór soli wapnia umieścić w zlewce o pojemności 500 ml. Do roztworu wlać 100 ml wody destylowanej. Zlewkę lekko przechylić i po jej ściance wpuścić dipol. Zlewkę ustawić na mieszadle magnetycznym, włączyć i powoli zwiększać obroty. 3. Cylindrem miarowym odmierzyć 70 ml 1 M węglanu sodu. Wlać po bagietce, powoli do zlewki z r-rem soli wapnia. Po wlaniu odczynnika strącającego mieszaninę reakcyjną mieszać przez ok. 5 min.

2.

Dekantacja oraz przemywanie uzyskanego osadu.

1. Mieszaninę odstawić na ok. 10 min w celu zdekantowania. 2. Zlać nadmiar cieczy, osad przelać przez bibułę filtracyjną, a następnie przemyć go kilkukrotnie wodą destylowaną. 3. Przemyty osad przenieść za pomocą szpatułki do zlewki i zawieści w ok. 200 ml wody destylowanej.

3.

Sączenie próżniowe.

1. Przygotować zestaw do sączenia pod próżnią. Przed rozpoczęciem sączenia należy odpowiednio ułożyć sączek na lejku i zwilżyć go wodą. Spowoduje to "przyklejenie" sączka

Strona 4

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

do dna lejka, co zabezpiecza przed dostaniem się osadu do kolby ssawkowej (patrz rysunek poniżej).

Rys. 1. Zestaw do sączenia próżniowego.

2. Wlać po bagietce r-r poreakcyjny na lejek. Spłukać resztki osadu za ścianek niewielką ilością wody z tryskawki, zmieszać kołowym ruchem ręki mieszaninę w zlewce i szybko wylać zawartość na lejek. 3. Po przesączeniu całości r-ru poreakcyjnego odłączyć na chwilę pompkę wodną od kolby zabezpieczającej i przemyć osad na lejku niewielką ilością wody.

4.

Analiza wagowa uzyskanego osadu.

1. Zważyć na wadze szkiełko zegarkowe. Wynik zapisać. 2. Przenieść odsączony osad węglanu wapnia wraz z sączkiem na zważone szkiełko zegarkowe posługując się szklaną bagietką. 3. Osad wysuszyć na powietrzu. 4. Po wysuszeniu osadu wyjąć delikatnie sączek, a następnie zważyć otrzymany węglan wapnia. Na tej podstawie obliczyć masę wapnia zawartą w roztworze otrzymanym od prowadzącego.

5.

Przygotowanie podłoży hodowlanych.

1. Przygotować w butelce (o pojemności 500 ml) 200 ml pożywki zawierającej 25 g/l bulionu odżywczego oraz 1.5 % agaru (rozpuszczalnik – woda destylowana). 2. Całość po wymieszaniu umieścić w mikrofalówce i podgrzewać do momentu rozpuszczenia wszystkich składników (butelka nie może być szczelnie zamknięta!). 3. Ostudzić pożywkę, ale niecałkowicie, aby pozostała płynna. 4. Pożywkę rozlać na szalki Petriego i pozostawić do zastygnięcia.

Strona 5

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Ćwiczenie 8 Spektrofotometria i jej zastosowanie w biotechnologii. Spektrofotometria UV-VIS. Zagadnienia do przygotowania: pojęcia: spektroskopia, absorpcja promieniowania, absorbancja, transmitancja, widmo absorpcji, prawa absorpcji: prawo Lamberta, prawo Lamberta-Beera, metoda krzywej wzorcowej oznaczeń spektrofotometrycznych. Na zajęcia należy przynieść papier milimetrowy oraz linijkę i ołówek. Niezbędne odczynniki: - 1 mmol/dm3 roztwor błękitu metylenowego

1.

Wyznaczanie widma błękitu metylenowego.

Przygotowanie roztworów barwnika: Mając do dyspozycji 1 mmol/dm3 roztworu błękitu metylenowego przygotować po 4 ml roztworów o następujących stężeniach: a) 1 µmol/dm3 b) 5 µmol/dm3 c) 10 µmol/dm3 d) 15 µmol/dm3 Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzyć 1,5 ml roztworu błękitu metylowego o określonym stężeniu. Dokonać pomiarów absorbancji w zakresie od 360 nm do 600 nm co 10 nm, oraz od 600 nm do 750 nm co 50 nm. Jako odnośnika użyć wody destylowanej. Wykreślić widmo błękitu metylenowego na papierze milimetrowym. Podać maksima absorpcji.

2.

Oznaczanie stężenia roztworu próbek X i Y na podstawie krzywej wzorcowej.

Wykorzystując roztwór wyjściowy błękitu metylenowego o stężeniu 1 mmol/dm 3 przygotować po 2 ml roztworów o następujących stężeniach: a) 500 µmol/dm3 b) 250 µmol/dm3 c) 125 µmol/dm3 d) 62.5 µmol/dm3 e) 31.25 µmol/ dm3 f) 15.63 µmol/ dm3 g) próbka X h) próbka Y

Strona 6

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

Do kuwety spektrofotometrycznej odmierzyć 1,5 ml roztworu błękitu metylowego. Dokonać pomiarów absorbancji przy długości fali odpowiadającej maksimum wyznaczonej w poprzednim ćwiczeniu. Jako odnośnika użyć wody destylowanej. Wyznaczyć krzywą wzorcową zależności wartości absorpcji od badanego stężenia, a następnie określić stężenie próbek X i Y.

Ćwiczenie 9 Podstawowe metody sporządzania preparatów mikroskopowych. Wstęp do technik mikroskopowych oraz ich zastosowanie w biomedycynie. Zagadnienia do przygotowania: pojęcie biologicznego preparatu mikroskopowego, w jakim celu oraz jakie są etapy sporządzania preparatów, na czym polega podstawowe barwienie preparatów mikroskopowych; ogólna budowa i zasady pracy z mikroskopem świetlnym, zasada działania oraz rodzaje mikroskopów wykorzystywanych w badaniach biomedycznych (krótka charakterystyka).

1. Przygotowanie preparatu mikroskopowego ze skórki wewnętrznej strony liścia cebuli. 1. Umyć szkiełko podstawowe i osuszyć ręcznikiem papierowym. 2. Nanieść kroplę soli fizjologicznej na szkiełko podstawowe (na środek). 3. Wprowadzić niewielki i cienki fragment tkanki (wewnętrzna strona liścia cebuli) do kropli soli fizjologicznej. 4. Całość przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

2.

Przygotowanie preparatu mikroskopowego rozmazu komórek.

1. Umyć szkiełko podstawowe i osuszyć ręcznikiem papierowym. 2. Za pomocą pipety automatycznej na środek szkiełka nanieść około 20 µl zawiesiny komórkowej. 3. Całość przykryć szkiełkiem nakrywkowym.

3.

Przygotowanie preparatu mikroskopowego chromosomów metafazowych.

1. Na schłodzone szkiełko mikroskopowe nakropić 20 µl zawiesiny chromosomowej (nakropienie przeprowadzić metodą grawitacyjną z wysokości ok 20 cm poprzez szybkie opuszczenie zawartości końcówki na szkiełko podstawowe.

Strona 7

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

2. Bezpośrednio po opuszczeniu kropli preparatu całość rozdmuchać na powierzchni szkiełka. 3. Szkiełka suszyć w pozycji pionowej. 4. Preparaty gotowe do dalszych analiz przechowywać w temperaturze -20˚C.

4.

Opanowanie poprawnej techniki posługiwania się mikroskopem optycznym.

Przygotować mikroskop do pracy: - ustawić stolik na bezpieczną wysokość - ustawić odpowiedni obiektyw (10x) - wyregulować okulary mikroskopu

5.

Obserwacja przygotowanych preparatów mikroskopowych.

1. Preparaty mikroskopowe umieścić na stoliku oraz ustabilizować przy pomocy sprężynujących łapek. 2. Ustawić preparaty w oś optyczną mikroskopu oraz stolik w odległości 1-1,5 cm od preparatu. 3. Nastawić lusterkiem odpowiednie oświetlenie pola widzenia. 4. W zależności od potrzeb skorygować położenie kondensora. 5. Podczas obserwacji przez okular – ustawić za pomocą śruby makrometrycznej zarys preparatu. 6. Wyregulować ostrość obrazu za pomocą śruby mikrometrycznej. 7. Przeprowadzić obserwację i pomiary zgodnie z zaleceniami prowadzącego zajęcia laboratoryjne.

6.

Obserwacja preparatów mikroskopowych pod obiektywem immersyjnym.

1. Na preparat nanieść 1 krople olejku immersyjnego w interesującym nas miejscu. 2. Po dobraniu oświetlenia mikroskopu w osi optycznej mikroskopu zmienić ostrożnie obiektyw na immersyjny tj. obiektyw powiększający 100x. 3. Posługując się śrubą mikrometryczną nastawić ostrość obrazu. 4. Dokładnie obejrzeć preparat zwracając szczególną uwagę na kształt komórek/struktur komórkowych.

Strona 8

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

7.

Dokumentowanie obserwacji mikroskopowej.

Dokumentowanie obserwacji mikroskopowej polega na zapisaniu jej wyników. Obserwowane obiekty można fotografować za pomocą odpowiednio wyposażonego mikroskopu lub wykonać odręczne rysunki. Uwagi! Po pracy pozostawiamy mikroskop w stanie czystym, używając w tym celu ściereczek, jednej do wycierania części mechanicznych, drugiej (lnianej) - do części optycznych. Do czyszczenia mikroskopu używa się wody destylowanej. Obiektywy przetrzeć preparatem czystego alkoholu etylowego.

Ćwiczenie 10 Techniki rozdzielania i oczyszczania struktur subkomórkowych: frakcjonowanie, homogenizowanie, wirowanie różnicowe, techniki membranowe. Zagadnienia do przygotowania: zarys ultrastruktury i frakcjonowania komórek, homogenizatory i homogenizacja, warunki jakie powinien spełniać bufor do homogenizacji, wirowanie różnicowe, siła odśrodkowa, wirowanie w ciągłym i nieciągłym gradiencie gęstości.

Niezbędne odczynniki: - sól fizjologiczna - sacharoza (MW = 342.30 g/mol) - bufor TKM pH 7.4 [50 mM Tris, 25 mM KCl, 5 mM (CH3COO)2Mg] 1.

Przygotowanie tkanki.

Wątrobę oczyścić za pomocą skalpela oraz pęsety z tkanek pozahepatocytarnych i pokroić na drobne kawałki. Krwistą ciecz zdekantować i przeprowadzić kilkukrotne płukanie z wykorzystaniem soli fizjologicznej skrawków na gazie w celu maksymalnego usunięcia elementów morfotycznych oraz białek krwi.

2.

Homogenizacja i oczyszczenie homogenatu.

1. Porcję wątroby ok. 5 g wprowadzić do homogenizatora umieszczonego w pojemniku z pokruszonym lodem, a następne zalać buforem TKM tak, aby tkanka stanowiła ok. 10% całości (m/v). 2. Homogenizować, wykonując ok. 30 pasaży "góra/dół" z dokładnym przyciśnięciem tłoka do dna probówki.

Strona 9

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

3. Homogenat przesączyć przez 4 warstwy gazy w celu oddzielenia nieroztartych tkanek. 4. Homogenat nanieść na filtr komórkowy o średnicy 70 µm umieszczony na probówce wirówkowej 50 ml oraz odwirować 300 x g przez 5 min. Uzyskany homogenat trzymać na lodzie.

3.

Przygotowanie nieciągłego gradientu stężeń sacharozy.

1. Przygotować 40 ml 2 M wyjściowego roztworu sacharozy w buforze TKM, a następnie korzystając z wyjściowego r-ru przygotować kolejne r-ry do gradientu: 1.5 M, 1 M, 0.5 M. 2. Roztwory sacharozy (poczynając od stężenia 2 M – 5 ml, 1.5 M – 10 ml, 1 M – 9 ml, 0.5 M – 6 ml) nanieść kolejno delikatnie pipetą pasterowską tak, aby powstały wyraźne granice między fazami (patrz rysunek obok).

4.

Frakcjonowanie homogenatu wątroby.

1. Na przygotowany gradient stężeń sacharozy nanieść delikatnie uzyskany homogenat wątroby. 2. Odwirować całość przez 10 min przy prędkości 1000 x g. 3. Delikatnie zebrać uzyskane frakcje za pomocą pipety i przenieść je do probówek 1.5 ml. 4. Zagęścić uzyskane frakcje poprzez ich odwirowanie 2500 x g, 5 min. 5. Usunąć ok. 70 % supernatantu, a następnie osady zmieszać z pozostałą częścią supernatantu poprzez pipetowanie.

5. Kontrola homogenności uzyskanych frakcji. Homogenność uzyskanych frakcji skontrolować pod mikroskopem świetlnym: a) 20 µl zagęszczonych frakcji nanieść na szkiełko podstawowe; b) preparaty delikatnie przykryć szkiełkami nakrywkowymi, uważając na powstające pęcherze powietrza; c) preparaty oglądać pod coraz większym powiększeniem.

LITERATURA 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Całus H. Podstawy obliczeń chemicznych Jones A. Nauki o środowisku. Ćwiczenia praktyczne Kalembkiewicz J. Chemia organiczna i nieorganiczna. Laboratorium cz. I Kłyszejko - Stefanowicz L. Ćwiczenia z biochemii Kopacz M. Ćwiczenia laboratoryjne i rachunkowe z analizy ilościowej Kowalski P. Laboratorium chemii organicznej. Techniki pracy i przepisy BHP

Strona 10

Pozawydziałowy Instytut Biotechnologii, Uniwersytet Rzeszowski Techniki laboratoryjne w biologii eksperymentalnej Prowadzący: mgr inż. Jennifer Mytych

7. Sarbak Z. Podstawy techniki laboratoryjnej 8. Smith J.E. Biotechnology. The fifth edition. 9. Stephenson F.H. Całculations for Molecular Biology and Biotechnology. 10. Szczepanik W. Metody instrumentalne w analizie chemicznej 11. Zenkteler M. Hodowla komórek i tkanek roślinnych 12. Słomski R. (red.).: Analiza DNA – Teoria i Praktyka, Wyd Uniwersytetu Przyrodniczego, Poznań 2008. 13. Węgleński P. (red.).: Genetyka molekularna, PWN, Warszawa 2006. 14. Allison L.A., Podstawy biologii molekularnej, Wyd Uniwersytetu Warszawskiego, Warszawa 2009. 15. Berg J.M., Stryer L., Tymoczko J.L.: Biochemia, PWN, Warszawa 2009. 16. Skuza L., Słominska-Walkowiak.: Wybrane metody biologii i cytogenetyki molekularnej, Uniwersytet Szczeciński, Szczecin 2008. 17. Bal J.: Biologia molekularna w medycynie: elementy genetyki klinicznej, Wyd Naukowe PWN, Warszawa 2011. 18. Czasopisma naukowe z zakresu przedmiotu.

Strona 11