A Historia da Microbiologia

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Aula 1 - História da Microbiologia e Microscopia Introdução Para muitas pessoas as palavras germe, micróbio, micro-organismo trazem a mente um grupo de minúsculos seres vivos que causam infecções desagradáveis ou até mesmo doenças graves como a AIDS. Porém pode-se afirmar categoricamente que a grande maioria das bactérias não causam doenças. Os micro-organismos incluem as bactérias, fungos, vírus, protozoários e algas microscópicas, porém, a maioria desses fornece contribuições cruciais para o bem estar do nosso ambiente. Os mamíferos e muitos outros animais dependem das bactérias em seus intestinos para auxiliarem na sua digestão e a produzirem as vitaminas K e algumas vitaminas do complexo B. Adicionalmente, a microbiota que “carregamos” impede que micro-organismos patogênicos se instalem em nosso organismo. Os micro-organismos atuam na fotossíntese, degradação de dejetos nos solos, auxiliam a incorporação do nitrogênio pelas plantas etc. Comercialmente, os micro-organismos são úteis na produção de combustíveis, compostos químicos e alimentos. As primeiras observações O inglês Robert Hooke, com o auxílio de um dos primeiros microscópios que se têm registro, identificou as menores unidades vivas, chamando-as de “pequenas caixas” ou “células”. A descoberta de Hooke marcou o início da teoria celular, que se baseia no fato de que todas as coisas vivas são constituídas por células. Robert Hooke, comissionado pela Real Sociedade, desenhou e construiu um microscópio muito prático. Usando sua habilidade artística, Hooke fez notáveis desenhos de cerca de 60 peças microscópicas. O olho da mosca, a metamorfose de uma larva de mosquito, a estrutura das penas, um piolho, uma pulga dentre muitos outros registros foram representados com grande aumento e meticulosa precisão. Esses notáveis desenhos foram publicados em sua obra “Micrographia”, em 1664. Em seu livro, Hooke também ensina a fazer e usar o microscópio.

Figura 1: Algumas da belas figuras que compõem a obra Micrographia de Robert Hooke.

Em 1673, uma carta de um médico holandês (Renier van De Graaf) chega às mãos de um secretário da Sociedade Real de Londres, informando que fora construído um microscópio que permitia a visualização de objetos incrivelmente pequenos. O secretário inglês solicitou que o autor de tal equipamento apresentasse uma carta relatando algumas de suas descobertas microscópicas para possível publicação científica. Antony van Leeuwenhoek não era um médico ou profissional relacionado à área. Sua ocupação era relacionada ao ramo varejista. Ele era dono de um armarinho. Tal atribuição lhe favoreceu a descoberta devido ao fato dos comerciantes de tecidos avaliarem seus produtos minuciosamente por meio de lupas. No entanto Leeuwenhoek não se limitava a examinar apenas tecidos, e muito menos limitou-se ao uso de simples lupas. Por ser pouco exigente, seu trabalho como lojista permitiu a Leeuwenhoek trabalhar na construção de microscópios, examinar os mais distintos objetos e, conseqüentemente, escrever cartas com suas descobertas a jornais vinculados à Sociedade Real. A confecção de suas lentes singulares permitiu que a análise de um novo e pequeno mundo se tornasse possível. No ano de 1675, mais precisamente em setembro, Leeuwenhouek resolveu investigar a água da chuva que permanecera alguns dias em uma tina. Nesse episódio o comerciante ficou maravilhado com sua descoberta, a grande quantidade de “pequenos animais” capazes de movimentar-se constantemente.

Figura 2: Antony van Leewenhoek e seu microscópio primitivos – na época um dos mais poderosos.

Numa de suas cartas científicas, Leeuwenhoek, faz comparações de seus “animaizinhos” com uma pulga d’água, situando o leitor em relação ao tamanho deles. Leeuwenhouek os descreve 10 mil vezes menor que a pulga. Um fato que fascinava este singelo comerciante era observar os “animáculos”, como ele os chamava, possuidores de “pernas” ou “caudas” que lhes permitiam correr e movimentar-se livremente. Em uma de suas cartas ele desenha o curso que alguns deles fizeram durante sua observação. Ele prosseguiu na investigação microscópica. Leeuwenhoek não se limitava a pesquisar. Observou diversos tipos de amostras, como água da chuva, de poços e do mar, fezes humanas e de animais, sua saliva e sangue. Uma de suas mais surpreendentes observações ocorreu com seu próprio sêmen. Ali, no sêmen, os animáculos pareciam todos iguais. Todos possuíam caudas idênticas e corpos que consistiam basicamente em numa só cabeça. Chamava a atenção, a mobilidade incansável desses animaizinhos. Nenhum pesquisador até hoje foi capaz de produzir tantos artigos científicos a uma das mais respeitadas instituições como a Sociedade Real de Londres. A Sociedade Real recebia suas longas cartas que descreviam os seus maravilhosos achados no mundo

microscópico. Leeuwenhoek trabalhava com uma lente simples de notável poder de aumento, e embora houvesse produzido muitas lentes, recusava-se a cedê-las. Apesar de suas notáveis descobertas, Leeuwenhoek não chegou a associar os micro-organismos observados por meio de seu genial microscópio às doenças infecciosas. Quando ficou doente e febril, ele chegou muito perto do conceito de germe e doença. E novamente, ao extrair um dente cariado e examinar ao microscópio a raiz deteriorada, reconheceu mais uma vez os “animáculos” – multiplicados por centenas de milhares. Leeuwenhoek morreu em 1745, aos 91 anos. Somente trinta e nove anos após sua morte, um austríaco Marc Von Pleciz, declarou abertamente que as doenças seriam causadas pelos animáculos do holandês. Entretanto, foi em 1835 que Agostino Bassi demonstrou experimentalmente que as bactérias poderiam causar doenças. O trabalho de Bassi foi fundamental, pois impressionou Robert Koch (famoso médico alemão) e o induziu às suas marcantes descobertas. Germes e doença Foi antes de Koch fazer suas descobertas que outro importante cientista, Joseph Lister, aplicou a teoria do germe para procedimentos médicos. Lister sabia, por meio de estudos do médico húngaro Ignaz Semmelweis, que a transmissão de febre entre as parturientes ocorriam devido à falta de higiene e a não-descontaminação entre as consultas. Os estudos de Semmelweis indicaram que os médicos, ao realizarem as necropsias das parturientes mortas, serviam como vetores dos micro-organismos, contaminando outras mulheres grávidas. Por meio de um árduo processo de higienização, Semmelweis provou que as mortes e a contaminação poderiam ser evitadas. Na época, seus achados surtiram pouco efeito na comunidade científica. Porém, Joseph Lister foi um dos médicos que aderiu à higienização e descontaminação das mãos e materiais utilizados nas consultas e provou ao mundo que a higienização e esterilização prévia a procedimentos médicos poderia salvar inúmeras vidas. (Sim, foi por causa de Lister que o famoso antisséptico bucal Listerine® ganhou esse nome!) Identificação e isolamento de micro-organismos Outro médico que adotou e defendeu as teorias do germe em procedimentos médico foi Robert Koch. Ele costumava trabalhar em suas pesquisas num canto de seu consultório. Munido por um microscópio e apenas alguns instrumentos feitos a mão e auxiliado por sua esposa não-médica, ele isolara o germe do antraz, após três anos de estudo, em animais com carbúnculo, uma doença que acomete animais. Outra importante observação foi que o antraz tinha a capacidade de se transformar em esporos, garantindo lhe a vantagem de sobreviver por longos períodos sob condições extremas. Por fim, ele injetou culturas desses bacilos em porquinhos-da-índia e outros animais, inclusive carneiros e vacas, e observou que, ao morrerem rapidamente, seus corpos sucumbiam com o carbúnculo. O carbúnculo era, na época, prevalente entre os animais de fazenda da região de Wollstein, cidade em que Koch vivia. Tal doença era responsável por inúmeras mortes, causando importante prejuízo aos pecuaristas da época.

Figura 3: Médico e pesquisador alemão Robert Koch.

A descoberta de Koch foi apresentada em uma reunião científica em Breslau, na Alemanha, para dois famosos professores Ferdnand Kohn e Julius Cohnheim que ficaram maravilhados diante de seus achados. Estes dois professores publicaram os achados de Koch, e ainda conseguiram sua nomeação para o Instituto Imperial de Saúde de Berlim juntamente de um novo laboratório na capital alemã. Seria em Berlim que Koch faria uma das maiores descobertas da bacteriologia. Koch já dominara a prática de isolamento de culturas bacterianas, feito que ninguém mais tinha conseguido, até então. Porém, um outro pesquisador, Louis Pasteur, foi quem se beneficiou dos achados de Koch e desenvolveu a vacinação contra o antraz, sem atribuir qualquer crédito a Koch. Em segredo, devido à incredulidade da comunidade científica sobre microorganismos, ele trabalhou durante treze meses para identificar o agente etiológico da tuberculose. Doença que dava cabo de milhões de pessoas todos os anos. Então, Koch iniciou sua jornada. Por meio de amostras de tecido pulmonar com lesões características da tuberculose ele identificou um pequeno bacilo, corado com azul de metileno, nos tubérculos de cadáveres vítimas da tuberculose. A partir daí, Koch imaginou que poderia cultivar os bacilos da tuberculose como fizera com as outras bactérias que vinha estudando. No entanto ele percebera que após 24, 48 e 72 horas, não surgiam colônias específicas do bacilo. Porém, Koch não esmoreceu e partiu do princípio que a tuberculose é uma doença crônica e que os doentes não sucumbem em poucos dias. Sendo assim, não poderia o bacilo também demorar a produzir colônias que pudessem ser visualizadas? Após várias semanas sua paciência foi recompensada com o aparecimento de colônias. Ao examinar em seu microscópio ele pôde ver milhares de bacilos, obtidos de uma colônia em sua cultura. Com base em seus experimentos, Koch formulou um conjunto de critérios, conhecidos como “Postulados de Koch”, para associar um micro-organismo a uma doença específica: 1. O micro-organismo causador da doença deve sempre estar presente em todos os casos da doença, e ausente nos animais e humanos sadios. 2. O micro-organismo deve ser isolado a partir de animal ou humano doente e crescer em cultura pura, fora do corpo do doente – no laboratório. 3. O micro-organismo isolado deve causar a doença quando inoculado em um animal sadio. 4. O mesmo micro-organismo deve ser isolado dos animais experimentalmente infectados e crescer novamente em cultura, devendo apresentar as características do organismo original.

Infelizmente a carreira de Robert Koch não foi marcada apenas por bons resultados e grandes descobertas. A tentativa (frustrada) de desenvolver uma vacina anti-tuberculose levou à morte, milhares de pessoas. Koch desenvolveu um extrato de proteínas da tuberculose, conhecida até hoje como tuberculina. Ele imaginou que a aplicação da tuberculina seria suficiente para aniquilar o bacilo no paciente infectado. Porém, na prática não havia proteção mediada pela tuberculina e os pacientes não apresentavam melhorias. O erro de Koch foi induzido por sua impaciência em realizar um grande feito, à altura das descobertas de seu grande concorrente e desafeto, Louis Pasteur, e principalmente por ele ter desenvolvido a vacina contra o antraz, sem que lhe fosse dado qualquer mérito. Louis Pasteur foi um brilhante químico e pesquisador francês que logo no início da carreira contribuiu muito com seus estudos com compostos químicos e aos 25 anos fora nomeado professor em Estratasburgo, França. Incluíam-se em suas pesquisas, a investigação sobre a geração espontânea. Esta teoria afirmava que seres vivos poderiam ser gerados por meio de componentes inanimados. Pasteur desenvolveu um simples estudo capaz de derrubar a teoria da geração espontânea.

A

B

Figura 4: Experimento de Pasteur que garantia a esterilização de substâncias líquidas. (A) O design do frasco de vidro com o gargalo em “S” impedia que bactérias chegassem ao líquido, assim quando fervido, ele permanecia livre de germes. (B) A retirada do gargalo em “S”, mesmo após a fervura, não impede que novos germes alcancem a solução, ocorrendo crescimento microbiano.

Durante seus estudos sobre a geração espontânea, produtores de bebidas alcoólicas (cerveja e vinho) solicitaram a ajuda de Pasteur para que desvendasse o motivo sobre o comprometimento de seus produtos. Pasteur identificou a presença de leveduras e bactérias na fermentação da cerveja e do vinho (outro pesquisar Teodor Schwann já tinha descoberto tal fato - e Pasteur também não lhe deu os créditos). Com base em seus estudos, Pasteur determinou que as bebidas poderiam passar por um processo de aquecimento, destruindo as leveduras e bactérias, preservando assim, os produtos alimentícios. Este é o processo amplamente conhecido como pasteurização. Diante de seus engenhosos e persuasivos experimentos, Louis Pasteur tornava-se cada vez mais reverenciado diante da sociedade. Seus estudos prosseguiam e mais uma vez ele fez uma observação notável. Interessado em estudos post mortem, sua atenção voltava-se especialmente aos cadáveres de mulheres que tinham acabado de morrer de parto ou febre pueperal. Certamente, Pauster já conhecia os estudos de Ignaz Semmelweis que demonstrara que a febre puerperal tinha caráter contagioso. No entanto, ao invés de publicar seus achados, Pasteur permaneceu discreto diante deste

achado. Porém, somente em um evento médico, quando profissionais descartavam a possibilidade de contágio entre as numerosas parturientes vítimas da febre, Pasteur intervem furiosamente contradizendo os medíocres médicos cegos por sua ignorância. Obviamente, Pasteur demonstrara-se totalmente a favor da teoria germe e doença. Em 1878, Pasteur voltou suas atenções aos micro-organismos causadores de cólera em galinhas. Seus estudos baseavam na inoculação de cultura destes germes em galinhas, provocando suas mortes. Um dia quando inoculou uma cultura envelhecida em duas galinhas, Pasteur e os funcionários do laboratório observaram que ambas não morreram. Subseqüentemente, todos os funcionários entraram em férias. Ao regressar, novas culturas e inoculações continuavam a ocorrer e incrivelmente, as duas galinhas sobreviventes da injeção prévia não sucumbiram quando a equipe de Pasteur inoculou uma cultura com germes normais (não envelhecidos). Diante deste achado, tornou-se óbvio a Pasteur que a inoculação de agentes atenuados garantiria proteção contra a doença! Pasteur, deslumbrado e favorecido pelo acaso, fantasiava que a injeção de uma cultura envelhecida ou enfraquecida do germe da cólera poderia proteger não somente a doença colérica como qualquer outra doença infecciosa. Porém, bastaram alguns meses para que a realidade se impusesse e ficou claro que a cultura enfraquecida de cólera somente protegia os animais da cólera. Outra importante contribuição de Pasteur começou quando ele resolveu estudar uma doença perversa e sempre fatal, a raiva. Animais eram mantidos em seu laboratório para estudos. Pasteur observou que entre a mordida recebida por uma animal (ou ser humano) saudável até o surgimento da doença havia um intervalo considerável. Pasteur fez suposições que o agente causador da doença devia viajar pelos nervos periféricos até acabar se concentrando no cérebro e medula espinhal. (Fato comprovado posteriormente!). O agente da raiva não pudera ser visto pelos microscópio da época e Pasteur sugeriu que este agente deveria ser um tanto minúsculo a ponto de não ser possível vê-lo com seus equipamentos. Pasteur inoculava em seus cães de laboratório tecido cerebral de coelhos com raiva. Certo dia, um de seus cães saudáveis fora mordido por um cão raivoso e este não adoeceu, ao contrário do que se esperava. Pasteur e sua equipe observaram que a cultura deveria ter sido bem atenuada e envelhecida para garantir a proteção ao animal. A partir desse episódio, a equipe de Pasteur deixou envelhecendo por duas semanas a cultura de tecido espinhal contendo raiva. Somente depois desse período que ele injetou no cão e o mesmo não adquiriu a doença. Após algumas semanas ele injetou cultura fresca contendo o vírus da raiva e o cão não apresentava doença. Ou seja, o cão teria ficado imune à doença devido aplicação da cultura envelhecida. Sem concluir definitivamente seus estudos, Pasteur foi abordado por uma mãe desesperada que viu seu filho ser atacado por um cão raivoso, implorando-lhe que salvasse o menino. Pasteur não era médico, mas foi incentivado por dois amigos médicos a aplicar a profilaxia no menino. Logo, foi aplicado material envelhecido contendo vírus da raiva. Alguns dias depois correu ao mundo todo a notícia que o menino teria sido salvo. Outro episódio serviu para consolidar de vez a profilaxia anti-raiva. Dezenove camponeses russos foram mordidos por lobos selvagens raivosos. Pasteur aplicou o esquema profilático, igualmente fizera no menino. Após algumas semanas apenas três dos camponeses sucumbiram, mas os demais foram salvos. Tal feito rendeu um bom dinheiro a Pasteur e alguns meses depois diversos laboratórios começaram a fabricar a vacina contra raiva. Apesar da grande contribuição de Louis Pasteur à ciência (e à humanidade), nem todos seus estudos obtiveram sucesso. A elaboração da vacina anti-antraz teria sido bem

sucedida até o momento em que ele aplicara em poucos animais, com os critérios e cuidados adequados. Entretanto, na medida em que Pasteur começou a produzir a vacina em larga escala, ele não conseguira garantir sua segurança e efetividade. Assim, este foi um de seus experimentos marcados pelo fracasso. Porém, Pasteur (assim como Koch) é lembrado hoje em dia por seus sucessos científicos. Fármacos antimicrobianos Após a descoberta dos agentes microbianos causadores de doenças nos seres vivos, uma variedade de produtos é utilizada para controlar o crescimento destes organismos. Um agente antimicrobiano é um produto químico natural ou sintético, que mata ou inibe o crescimento de micro-organismos. Em 1928, Alexander Fleming, um bacteriologista escocês, descobriu acidentalmente o primeiro antibiótico quando constatou que o crescimento de bactérias do gênero Staphylococcus, em placas de cultura, era inibido pela presença de colônias de mofo contaminante, Penicillium notatum. Fleming deu o nome de “penicilina” à substância inibidora que estava sendo produzida pelo mofo. Ele constatou que as culturas em caldo do fungo não eram tóxicas para animais em laboratório, e que esse caldo era capaz de destruir estafilococos e outras bactérias. Ele pensou na hipótese de a penicilina ser utilizada no tratamento de doenças infecciosas causadas por esses microorganismos. Como afirmou Kenneth Raper em 1978, “a contaminação das placas de Staphylococcus pelo fungo foi um acidente; mas o reconhecimento, de Fleming, de um fenômeno potencialmente importante não foi acidente, assim a observação de Pasteur de que “o acaso favorece as mentes preparadas” não teria sido mais apropriada quanto no caso de Fleming e a penicilina”.

Figura 5: Alexander Fleming e sua cultura de estreptococos contaminada por uma colônia de Penicillium. Note que ao redor da colônia de fungo as bactérias não conseguem crescer.

O primeiro homem a ser tratado com penicilina foi um agente da polícia que sofria de septicemia com abcessos disseminados, uma condição geralmente fatal na época. Ele melhorou bastante após a administração do fármaco, mas veio a falecer quando as reservas iniciais de penicilina se esgotaram, devido à incapacidade de se produzir a penicilina em larga escala, naquela época. Em 1935, um químico chamado Gerhard Dogmak descobriu que o corante vermelho de Prontosil é eficaz contra infecções causadas por estreptococos, em camundongos. Posteriormente, descobriu-se que, no interior do organismo, o Prontosil era degradado até formar a sulfanilamida (uma sulfa) que serviria como base para novos fármacos contra infecções bacterianas.

Durante a segunda Guerra Mundial, dois bioquímicos Sir Howard Florey e Ernst Boris Chain, purificaram a penicilina e demonstraram sua eficácia no tratamento de várias infecções bacterianas. Por volta de 1942, a industria farmacêutica dos EUA foi capaz de produzir penicilina suficiente para uso no ser humano, e logo iniciaram-se as pesquisas para a busca de outros antibióticos. Em 1944, Selma Waksman e seus colaboradores isolaram a estreptomicina (primeiro fármaco antituberculose) e, em seguida, descobriram outros antibióticos como o cloranfenicol, tetraciclina e eritromicina em amostras de solo. Foi Waksman quem primeiro utilizou o termo ”antibiótico”. Devido às valiosas contribuições à medicina, esses investigadores – Chain, Fleming, Florey, Waksman e Dogmak – receberam, em diferentes ocasiões, o Premio Nobel.